Name: 의 분리 Plasmodium falciparum 늦은 단계에 감염된 적혈구 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 20 s
Description: 학습하세요 Plasmodium falciparum 감염 적혈구 분리법을 헤모조인의 자성 특성을 이용한 자기 분리법으로. 이 방법은 기생충 침입 능력을 보존하며 거의 100% 순도로 감염 세포를 농축합니다.

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이 작품은이 자금을 지원 한 보조금 PRB-009 CS와 Secretaría Nacional 드 Ciencia Y Tecnología (SENACYT), 파나마에서 LC에 박사 장학금합니다.

프로토콜의 모든 단계는 centrifugations을 제외하고, 샘플 무균 유지하는 후드 안에 수행해야합니다. 1. P.의 하순 무대 절연 falciparum에 감염된 적혈구 기생충에 paramagnetism을 수여 hemozoin는, 속으로 일반적인 신진 대사이기 때문에 Plasmodium에 감염된 적혈구의 모든 후반 단계는이 방법으로 분리 할 수​​ 있습니다. 전형적인 문화 2 ~ 4 %의 혈소판 (적색 혈액 세포의 부피 비율)와 1-8%의 parasitemia을 (감염된 비율이 포함되어 있지만, 문화에 높은 parasitemia (3-10%)은이 프로토콜보다 나은 수율을하는 것이 좋습니다 적혈구). Trager와 젠슨 (1)에 의해 설명 된대로 기생충을 배양 할 수 있습니다. <ol><li> 간단한 멀티 일부 설정은 모든 schizont 격리 절차를 조립해야합니다. 이를 위해 LS 열, 자기 MidiMACS 구분 기호와 Miltenyi BioTec에서 맥 MultiStand (그림 1 </STRONG&gt;)를 사용하고 있습니다. 첫째, 금속 스탠드에 자기 분리기를 첨부 한 후 분리기에서 자기 열을 배치합니다. </li><li> 별도의 관 (전역 50 ML conicals 사용), RPMI 1640의 23.2 ML 및 작업 솔루션을 생성 할 7.5 % 나트륨 중탄산염의 750 μl를 섞는다. 폐기를위한 손에 추가 튜브를 가지고 흐름을 통해 수집 기생충 문화의. </li><li> 를 평형에 열을 작업 솔루션의 3 ML를 추가하고 흐름을 통해 튜브에 폐기하십시오. </li><li> P. 8 ML을 추가 컬럼에 falciparum 문화, 즉시 작업 솔루션의 마지막 부분으로 문화에 의해 열을 밖으로 밀어되었는지 확인하는, 수신 튜브는 언 바운드 문화의 복구를 시작하기 위해 수집 하나씩 교체됩니다. 이 더 문화를 diluting 방지 할 필요가 있습니다. </li><li> 열을 통해 문화의 흐름이 중단되면, 컬럼의 나머지 적혈구을 밀어 작업 솔루션 1 ML을 추가. </li><li> 단계를 세탁하면 : 열에 작업 솔루션의 또 다른 3 ML을 추가하고 다른 튜브에 흐름을 통해로 저장되는 문화를 diluting 방지하기 위해 &#39;폐기&#39;튜브에 흐르는 액체를 수집합니다. </li><li> 용출 : 3 ML,이 칼럼을 통과 한 후, 스탠드에서 후자를 분리하고 15 ML 튜브의 상단에 배치. </li><li> 다시 열을 작업 솔루션의 3 ML를 추가합니다. 이 단계는 칼럼의 구슬에 갇힌 늦게 무대 기생충에 감염된 적혈구를 elutes. </li></ol> 참고 :이 시점에서, 그리고 필요한 기생충의 양에 따라 원래의 문화의 parasitemia의 한계를 분명히 대상이 컬렉션의 또 다른 라운드 / s를, 시작합니다. 흐름이 정상 상태를 유지로 열이 오랫동안로 활용할 수 있습니다. <ol start="9"><li> 수집 된 기생충의 농도 : 실온에서 150 XG에서 5 분의 eluate를 포함하는 15 ML 튜브를 원심 분리기parasitized 적혈구에서 어두운 펠렛을 형성합니다. </li><li> 아주 작은 샘플을 가지고 (아래 2 단계 참조) 현미경을 통해 농도와 총 생산량을 결정하기 위해 충분한 액체두고 표면에 뜨는을 제거합니다. </li><li> 늦은 무대 기생충의 절연 및 캡처가 만족스럽게 수행하는 경우이 순간에, 신선한 미디어로 다시 수집 문화를 품다. </li><li> 후속 실험에 필요한 볼륨 및 솔루션에 수집 된 기생충을 희석. </li></ol> 2. 순도 및 항복 분석 <ol><li> hemocytometer를 사용하여, 가벼운 현미경으로 계산하여 얻은 기생충의 농도를 확인합니다. 계산하려면, hemocytometer의 커버 슬립에서 수집 된 기생충과 미디어의 혼합의 10 μl를 추가합니다. hemocytometer의 네 당장 자리에 기생충의 수를 세어, 4로 총 수를 나눕니다. 감염된 전자의 농도를 얻기 위해 10 4에 의해 그 수를 모두 곱하면ML 당 rythrocytes. </li></ol> 주 : 믹스의) 농도가 더 많거나 적은 매체를 추가하여 펠렛을 resuspending의 순간에 사용자가 결정합니다. 제안 작업 농도는 μl 당 5.5 X 10 4 schizontes (이 일반적으로 수집 된 기생충에 100-300 μl를 추가하여 달성된다)입니다. 이 농도의 20 μl가 미디어와 적혈구, 전형적인 4 %의 혈소판 문화의 약 1 %의 parasitemia 100 μl 믹스의 최종 볼륨에 추가되어있는 경우 얻을 수 있습니다. b)는 hemocytometer에 따라 계산은 적혈구가 챔버 내부의 샘플 건조로 lysing 시작부터 빨리 할 수​​ 있습니다. 대부분의해야 감염된 적혈구는 비 감염된 사람에서 그들을 차별화 어두운 장소 내부를 표시합니다. <ol start="2"><li> 얇은 층 Giemsa은 10 % 메탄올에 매우 빠르게 슬라이드를 고정을 건조하고, t을 immersing하여 컬렉션의 순결을 평가하기 위해 얼룩을 수행Giemsa의 20 % 솔루션 자락은 증류수로 희석 청바지. 그들이 공기에 의해 건조하고 현미경으로 검사 할 수있는 후 10 분, 대한​​ 슬라이드를 청바지. 잘 70% 위 parasitemia이 달성해야합니다. </li></ol>

<ol><li>Jensen, J. B., Trager, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+falciparum+in+culture%3A+use+of+outdated+erythrocytes+and+description+of+the+candle+jar+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Plasmodium falciparum in culture: use of outdated erythrocytes and description of the candle jar method.</a> J. Parasitology. 63 (5), 883-886 (1977).</li>
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<li>Spadafora, C., Gerena, L., Kopydlowski, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+in+vitro+invasive+capabilities+of+Plasmodium+falciparum+schizonts+isolated+by+Percoll+gradient+or+using+magnetic+based+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+J%22%5BJournal%5D)">Comparison of the in vitro invasive capabilities of Plasmodium falciparum schizonts isolated by Percoll gradient or using magnetic based separation.</a> Malaria J. 10, 96(2011).</li>
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<li>Pertoft, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractionation+of+cells+and+subcellular+particles+with+Percoll%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biochem.+Biophys.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fractionation of cells and subcellular particles with Percoll.</a> J. Biochem. Biophys. Methods. 44 (1-2), 1-30 (2000).</li>
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<li>Trang, D. T., Huy, N. T., Kariu, T., Tajima, K., Kamei, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+concentration+of+malarial+parasite-infected+red+blood+cells+and+removal+of+contaminating+white+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Malar.+J%22%5BJournal%5D)">One-step concentration of malarial parasite-infected red blood cells and removal of contaminating white blood cells.</a> Malar. J. 3, 7(2004).</li>
<li>Nillni, E. A., Londner, M. V., Spira, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+separation+of+uninfected+erythrocytes+from+those+infected+with+Plasmodium+berghei+and+for+isolation+of+artificially+released+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Z.+Parasitenkd%22%5BJournal%5D)">A simple method for separation of uninfected erythrocytes from those infected with Plasmodium berghei and for isolation of artificially released parasites.</a> Z. Parasitenkd. 64, 279-284 (1981).</li>
</ol>

우리는 공개 할 아무 것도 없습니다.

말라리아 기생충 P.의 체외 문화에 falciparum 더 문화의 높은 확산 지점에 감염되지 않은 적혈구의 절반 이상으로 제한된 parasitemia을 나타냅니다. 대부분의 연구 실험을 위해, 감염된 적혈구으로 만 작동하는 것이 바람직하다. 이를 위해 분리 기술은 감염에 따라 문화를 분할 할 필요가 있습니다. 유용한 방법은 감염되지 않은 적혈구 11 두 그룹의 서로 다른 밀도를 이용 차동 centrifugations의 변화 일련의 permeabilize하고 lyze하는 streptolysin O의 사용을 포함합니다. 이러한 방법 중 일부는 젤라틴 부양 12 Plasmion 13을 사용하지만, 다른 적혈구를 추적하기는 다양한 밀도의 레이어를 기생충 14 일부 독성을 제시 할 수 밀도 기울기 매체 Percoll,되어 작성하는 데 사용되는 가장 일반적인 물질이 포함되어 있습니다. 우리 헥...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> RPMI 1640 Hepes은 수정 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> R4130 </td><td> 10% 인간의 혈청, 2 %의 포도당과 0.2 % 나트륨 중탄산염을 보충 </td></tr><tr><td> MidiMACS 구분 </td><td> 맥 Miltenyi BioTec </td><td> 130-042-302 </td><td></td></tr><tr><td> 맥 MultiStand </td><td> 맥 Miltenyi BioTec </td><td> 130-042-303 </td><td></td></tr><tr><td> LS 열 </td><td> 맥 Miltenyi BioTec </td><td> 130-042-401 </td><td></td></tr><tr><td> Hemacytometer </td><td> Grafco </td><td> Grafco Neubauer 상공 회의소 </td><td> 많은 다른 공급 업체를 통해 찾을 수 있습니다 </td></tr></tbody></table>

의 분리<em&gt; plasmodium falciparum</em자기 수단으로&gt; 늦은 단계에 감염된 적혈구

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

다른 Plasmodium 종과는 달리, P. falciparum은 그 연구 1 용이 실험실에서 배양 할 수 있습니다. 달성 parasitemia는 ≈ 40 % 한도에 도달 할 수 있지만, 탐정은 일반적으로 약 10 %로 비율을 유지합니다. 대부분의 경우 그것은 문화를 풍부하게하고 주어진 실험을 진행하기 위해 감염되지 않은 사람에서 기생충 함유 적혈구를 (적혈구), 분리 할 필요가 있습니다. 때 P. falciparum은 적혈구를 감염 기생충이 저하과 헤모글로빈 2, 3의 피드. 그러나 기생충은 매우 독성 철 함유 haem 잔기 4, 5를 처리해야합니다. 기생충은 haemozoin 6, 7이라는 불활성 크리스탈 폴리머에 haem를 변화함으로써 독성을 도망 간다. 이 철 함유 분자은 ​​그 식품 액포에 저장하고 그 안에 금속이 haem 8 하나에서 다른 산화 상태를 가지고있다. haem의 철의 철 상태ozoin는 감염되지 않은 적혈구의 부재 상자성체의 속성에 수여. 침략 기생충이 성숙에 도달로서, haemozoin의 내용은 P.의 최신 단계에서 더욱 paramagnetism을 준다고하는 9 증가 적혈구 내부 falciparum. 이 상자성체의 속성, P.의 최신 단계에 따라 falciparum 감염 - 적혈구는 자기 구슬이 포함 된 열을 통해 문화를 전달하여 분리 할 수 있습니다. 을 포함하는 열 자석 홀더에 배치 할 때이 구슬은 자석이된다. 흐름을 통해이 포함하면서 paramagnetism로 인해 감염된 적혈구는 다음 대부분의, 감염되지 않은 적혈구 및 기생충들을 포함하는 초기 단계를 들어, 열 안에 갇혀 될 것입니다. 여기, 우리는 좋은 기생충의 생존 능력 (10) 유지 자성 열과 후반 단계 기생충의 인구를 풍부하게 할 수있는 방법에 대해 설명합니다.이 절차를 수행 한 후 무소속의 문화가 남아있는 기생충은 성장을 계속 할 수 있도록 보육에 반환 할 수 있습니다.

그림 2에서, 자기 열을 통과 문화는 전에 표시됩니다 (A)와 절차 후 (B). 화살표가 그림 2A에 감염된 적혈구를 가리키는과 그림 2에 도시 된 바와 같이 하나 두 감염된 적혈구는 보통 100X 배율 필드를 볼 수 있습니다. 전형적인 프로 시저에서 5 % parasitemia (그림 2A)에서 문화로 시작,이 절차의 성능은 일반적으로 97% -100 % (그림 2B)의 parasitemia으로 적혈구를 생성합니다. 20X의 순서에 parasitemia의 농축은 쉽게 달성하고, 칼럼을 통해 문화의 여러 패스 P.의 높은 수율을 달성 할 수 있습니다 falciparum 말기에 감염된 적혈구, 필요에 따라 또는 원하는. <p class="jove_content" fo:keep-t...

hemozoin의 상자성의 특성은 월말 단계를 분리하는 데 사용됩니다<em&gt; Plasmodium falciparum</em문화에 성장&gt; - 감염된 적혈구. 방법은 간단하고 빠르고 기생충의 후속 침습적 기능에는 영향을 미치지 않습니다.

의 분리<em&gt; Plasmodium falciparum</em자기 수단으로&gt; 늦은 단계에 감염된 적혈구

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the ...

Plasmodium Falciparum은 적혈구 내에서만 서식하는 인간 기생충입니다. 성장 과정에서 이 기생충은 적혈구 내의 분자들을 섭취하여 영양분으로 사용하며, 헤모글로빈 내의 철 분자는 기생충에게 독성이 될 수 있기 때문에 이를 섭취하여 헤민(hemin)이라는 불활성 결정체 속에 가둡니다. 이 헤모 결정체는 기생충에 약간의 상자성(paramagnetism)을 부여합니다.이러한 상자성 특성은 감염된 적혈구를 기생충이 없는 적혈구로부터 분리하는 데 이용됩니다. 자석을 사용하면 기생충 비율이 매우 낮은 배양액을 농축하여 거의 100%의 기생률을 달성할 수 있습니다. 감염된 적혈구와 비감염 적혈구를 분리하는 작업은 잉여 적혈구라는 혼란 변수 없이 기생충의 특정 형질을 연구해야 하는 많은 실험에서 매우 유용합니다.여기에 제시된 방법론은 신속하고 간단하며 기생충에 무해합니다. 오늘은 *Plasmodium falciparum*의 분열형(schizont) 단계 분리 절차에 대해 설명하겠습니다. 이 다구성 장비는 매 분리 시마다 조립되어야 합니다.먼저 금속 스탠드 위에 컬럼 홀더를 놓고, 그 다음 홀더 위에 자성 컬럼을 배치합니다. 본 절차에서는 milian의 Ls 컬럼을 사용합니다. 다음으로 50 ml 튜브를 사용하여 RPMI 1640 23.2 mls와 7.5% sodium bar carbonate 용액 750 microliters를 첨가하며, 이는 본 공정이 성공하기 위한 작업 용액이 됩니다. 시작 전 컬럼을 보정하는 것이 필요합니다.이를 위해 작업 용액 3 mL를 추가하면, 이 용액이 '폐기물(discard)'라고 표시된 50 mL 튜브로 흘러 들어갑니다. 그다음 plasmodium FCI 배양액 8 mL를 컬럼에 추가합니다. 배양액에 의해 작업 용액의 마지막 부분이 컬럼 밖으로 밀려 나오는 즉시, 아래에 있는 다른 50 mL 튜브로 교체하십시오.배양액 수집을 시작합니다. 컬럼을 통한 배양액의 흐름이 멈추면, 부착되지 않고 남아있는 적혈구를 밀어내기 위해 워킹 솔루션 1 ml를 컬럼에 첨가합니다. 그 다음, 배양액의 비율이 변하지 않도록 배출 튜브로 전환한 후 워킹 솔루션 3 ml를 컬럼에 첨가합니다.3 mL의 용액이 컬럼을 모두 통과하면, 컬럼을 스탠드에서 분리하여 15 mL 튜브에 넣습니다. 다음으로, 워킹 솔루션 3 mL를 첨가합니다. 이렇게 하면 컬럼의 비드에 포획된 chizen이 용출됩니다.수행 중인 실험에

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

선정 Plasmodium falciparum</em인간 두뇌 내피 세포 Cytoadhesion위한> 기생충

RNA 형광하여 단일 세포 유전자 전사의 분석<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드 (물고기)

<em&gt; 체외에서</em공부하기&gt; 공동 감염 모델<em&gt; Plasmodium falciparum</em인간의 기본 단핵구 파생 면역 세포에서&gt; - HIV-1 상호 작용

이 메소드는 혈소판 응집 매개 표현형을...

의 혈소판 응집 중재를위한 간단한 프로토콜<em&gt; 변형체 falciparum의</em자원별로 설정에서&gt; - 감염된 적혈구

이 동영상은 단핵구에 의해 표지되고 옵소니화된 Plasmodium falciparum에 감염된 적혈구를 포함하는 유세포 분석 기반 식세포작용 분석을 보여줍니다. 유세포 분석은 단핵구에서 형광을 식별하여 식세포작용을 통해 옵소니화된 적혈구의 성공적인 식별을 확인합니다.

기생충에 감염된 적혈구의 항체 매개 식세포작용(Antibody-Mediated Phagocytosis of Parasite-Infected Erythrocytes)을 정량화하기 위한 분석

항체의 기능을 측정하는 것은 변형체 falciparum의 말라리아에 대한 내성을 이해하는 열쇠입니다. 이 방법은 가능한 merozoites의 정화 및 유동 세포 계측법에 의해 옵 소닌 의존 식균 작용의 측정에 대해 설명합니다.

높은 수익률 정화<em&gt; 변형체 falciparum의</emOpsonizing 항체 분석 실험에 사용하기 위해&gt; Merozoites

인간 microRNA는 숙주 적혈구에서 Plasmodium falciparum 기생충으로 전위합니다. 여기에서는 합성 microRNA를 숙주 적혈구로 transfection하고 P. falciparum에서 모든 RNA를 분리하는 데 사용되는 기술에 대해 설명합니다.  또한 이 논문에서는 기생충 전사체의 리보솜 점유 및 번역 가능성을 결정하기 위해 P. falciparum에서 폴리솜 분리 방법을 자세히 설명합니다.

방법은 작은 RNA를과의 리보솜 점유 규제 역할을 조사하기 위해<em&gt; 말라리아 원충</em

여기, 선물이 탐지 및 정량화의 변형 체 falciparum 감염 수성 적혈구 감쇠 총 반사 적외선 분석기 및 다변량 데이터 분석을 사용 하는 프로토콜.

검색 및 변형 체 falciparum 에 수성 적혈구 총 반사 적외선 분광학 감쇠 및 복수 데이터 분석의 정량화

이 작품에서는, 우리는 변형 체 falciparum 감염 적혈구에 의해 발표 하는 extracellular 소포 (EVs)의 역할을 조사 하기 위해 프로토콜 설명 합니다. 특히, 우리는 내 피 세포와 EVs의 상호 작용에 초점.

말라리아 감염 시 세포 외 기 기능의 평가

이 프로토콜의 전반적인 목표는 Plasmodium falciparum 감염에 자연적으로 드러나는 개인의 혈장 또는 혈장에 존재하는 항체의 용량을 측정하는 방법에 대한 지침을 제공하여 기생충에 감염된 적혈구 (IEs)의 phagocytosis를 opsonize 및 유도하는 것입니다.

유동 세포측정 기반 분석체에 의한 플라스모듐 팔시파룸 기생충에 자연적으로 획득된 식세포증-유도 항체 측정

집속 이온빔 밀링을 사용하여 극저온 전자 단층 촬영을 위한 급락 동결 생물학적 샘플에서 유리질 그리드 상의 라멜라를 생성합니다.

극저온 전자 단층 촬영을 위한 이중 빔 주사 전자 현미경을 사용하여 유리체 생물학적 샘플에서 라멜라 준비

학습하세요 Plasmodium falciparum 감염 적혈구 분리법을 헤모조인의 자성 특성을 이용한 자기 분리법으로. 이 방법은 기생충 침입 능력을 보존하며 거의 100% 순도로 감염 세포를 농축합니다.

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