Name: 준비를 한 다음 감염을 방지하기 위해 새로운 접근 방식으로 PRP 체외에서 항균 속성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: 학습하세요 체외에서 혈소판 풍부 혈장(PRP)의 항균 특성을 평가하는 방법을. 토끼에서 PRP를 분리하고 혈소판 농도를 표준화하여 이식물 관련 감염 예방에 활용할 수 있습니다.

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저자는 Therwa 함자, 존 E. Tidwell, 니나 클로비스, 그리고 실험 지원 및 교정을위한 수잔 스미스 수잔 스미스 감사드립니다. 저자는 자신의 지원과 미생물학, 면역학 및 웨스트 버지니아 대학에서 세포 생물학의 부에있는 생물 안전 실험실의 사용에 대한 세균의 임상 격리하고 존 B. 바넷, 박사 학위를 제공하는 존 토마스, 박사 학위를 감사합니다. 저자 Osteosynthesis 및 외상 관리 재단과 국립 과학 재단 (National Science Foundation) (# 1003907)에서 재정 지원을 인정합니다. 현미경 실험 및 이미지 분석도 메리 Babb 랜돌프 암 센터와 NIH 보조금 P20 RR016440에 의해 부분적으로 지원되는 웨스트 버지니아 대학 이미징 시설에서 수행되었다. 피를 동물 사용은 웨스트 버지니아 대학 기관 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다립니다. 모든 실험은 모든 관련 guidelin을 준수 실행 된어, 규정 및 규제 기관.

1. 준비와 PRP의 활성화 1.1 혈액 무승부 <ol><li> isoflurane의 흡입 (유도를위한 O 2 2 % 유지 보수 1 %)에서 토끼를 마취. </li><li> 20 ML의 주사기로 2 ML 0.129 M 트라이 - 나트륨 구연산을 (anticoagulent 솔루션)립니다. 트라이 나트륨 구연산 솔루션은 50 ML 증류수 H 2 O에 1.897 g 트라이 - 나트륨 구연산을 용해하고 0.22 μm 살균 필터로 필터링하여 준비가되어 있습니다. </li><li> 70 % 에탄올을 사용하여 토끼 귀를 살균. </li><li> 나비 바늘 (25 G) 주사기에 연결을 통해 토끼 귀 정맥에서 (예를 들면 5 ML) 혈액을 그립니다. </li><li> 부드러운 교반하여 트라이 나트륨 구연산 솔루션으로 피를 섞는다. 혈액 및 트라이 - 나트륨 구연산 솔루션의 볼륨 비율이 9시 1분입니다. </li></ol> 1.2 PRP 준비 (그림 1) <ol><li> 50 ML 플라스틱 원심 분리기 튜브에 anticoagulated 혈액을 전송합니다. 10 μl의 나누어지는 해hemocytometry를 사용하여 기준 혈소판 수를 확인하기 위해 혈액. </li><li> 스윙 아웃 로터와 원심 분리기에 실온에서 10 분 (RT) 300 XG에서 혈액을 원심 분리기. 낮은 가속 및 브레이크 속도 (그림 1)을 설정합니다. </li><li> 원심 분리 후, 피가 3 층으로 분리된다. 아래 층은 주로 적혈구이며, 중간 층 (일반적으로 &#39;버피 코트 &quot;이라한다) 농축 혈소판과 백혈구로 구성하고, 상단 층은 주로 혈액의 액체 성분이 플라즈마, 그리고 혈소판 (입니다 그림 1). 세포 배양 후드에 원심 분리기 튜브를 조심스럽게 수송, 레이어를 방해하지 않습니다. 1 ML 플라스틱 pipettor를 사용하여 15 ML 플라스틱 튜브에 플라즈마의 모든 버피 코트, 그리고 2~3밀리미터 두께 적혈구 레이어를 전송합니다. </li><li> RT에서 15 분 3,000 XG에서 이전 샘플 두 번째 시간을 원심 분리기. 상단 층 (표면에 뜨는)는 혈소판 가난한 플라즈마 (PPP)로 간주됩니다D는 새로운 튜브로 전송됩니다. </li><li> PPP 2.0 X 10 6 혈소판 / μl를 (hemocytometry에 의해 결정)을 획득하는 데 사용 나머지 혈액 샘플에서 혈소판 농도를 조정하여 PRP를 구합니다. </li></ol> 1.3 PRP 활성화 <ol><li> 1000 IU / ML의 작업 농도에 5 ML 10 % 염화칼슘과 5,000 IU 소 트롬빈을 용해하여 PRP 활성화 솔루션을 준비합니다. </li><li> PRP와 PPP에 활성화 솔루션을 추가하고 반복적으로 PRP와 PPP-젤을 형성하기 위해 pipetting하여 솔루션을 섞는다. PRP 또는 PPP를 활성화 솔루션의 볼륨 비율이 1시 4분입니다. </li></ol> 2. 죽 곡선 분석을 사용하여 PRP의 체외 항균 시험 (그림 2)에서 <ol><li> 멸균 inoculating 루프를 사용 S. 여러 식민지를 추가 플라스틱 관 뮐러 힌튼 국물 (MHB)의 5 ML에 자사의 하룻밤 판 문화의 구균. 소용돌이가 잠시 후 37 2 시간 동안 샘플을 품다 ° C. 다음, 박테리아 미디어의 광학 밀도 분광 광도계를 사용하여 결정하고 ~ 1 이상으로 광학 밀도로 조정 된 X 10 8 CFU / 미리 정해진 표준 곡선에 따라 ML. </li><li> 1 개 10 6 CFU / ML을 취득과 얼음에 inoculums을 배치 PBS를 사용하여 100x 희석하십시오. </li><li> 설정 및 살균, 일회용 5 ML 왕복 아래 폴리스티렌 튜브를 라벨 및 각 관 2 ML의 최종 볼륨에 대해 표 1에 표시된 다음 예제 그룹을 준비합니다. </li><li> 활성화 (겔 형성)에 대한 트롬빈 솔루션 다음 폴리스티렌 튜브 먼저 PRP, PPP, 또는 PBS를 추가합니다. 다음 MHB를 추가 한 후 S. 구균의 inoculums (1 X 10 6 CFU / ML) 1 × 10 5 CFU / ML의 최종 농도를 얻을 수 있습니다. </li><li> ° C 150 rpm으로 궤도 동요와 함께 37 튜브를 품다. </li><li> 미리 정해진 시간 포인트 (예 : 0, 1, 2 시간)에서 반복 pipetting (이 통해 각 튜브의 솔루션을 혼합박테리아는 PRP 젤 안에 갇혀 될 수 있기 때문에 단계) 중요합니다. , 샘플의 10 μl를 멸균 0.9 %의 식염수에 순차적으로 희석하고, Tryptic 간장 한천 (TSA, 5 %의 양 피) CFU 계산을위한 플레이트로 각 희석의 100 μl 나누어지는을 피펫. </li><li> 37 번 밤 문화 한천 플레이트 ° C 한 다음 계산과 판 식민지를 기록합니다. 플롯 X-축과 CFU / y 축에 ML에서 시간 (시간)와 logarithimic 규모 데이터입니다. </li></ol>

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제작자들은 더 경쟁 금융 이익이 없다는 점 선언합니다.

혈소판이 풍부한 혈장은 점점 그 치유 - 홍보 등록 15-17으로 인해 임상 응용에 사용되었습니다. 본 연구에서는 PRP는 감염 예방을위한 새로운 접근 방법으로 제시되었다. PRP는 MRSA, MSSA, 그룹 연쇄상 구균 및 Neisseria gonorrhoeae에 대한 강력한 항균 특성을 가지고 발견되었습니다. 기존의 항생제 치료에 비해 PRP의 주요 장점은, 감염 예방을 위해 포함 : (1) 현재 항생제 치료는 점점 더보고 항생제 저항 14,18-20 등의 도전에 직면하고 있습니다. PRP는 혈소판은 (i) PRP의 혈소판 microbicidal 단백질 등 호중구, 단핵 세포와 병원체 공격 21에 대한 방어에 중요한 역할을 T 세포 등 면역 세포에 대한 chemotactic 속성을 가지고 할 수 있기 때문에 고급 대안, 그리고 (ii) 기존의 항생제에 비해 수 microbicidal 단백질은 내가이 적...

임플란트 - 관련 감염은 상당한 임상 합병증입니다. 포도상 구균 (S. 구균)이 임플란트 - 관련 감염으로부터 격리 가장 흔한 미생물 중 하나입니다. 그것은 임플란트의 표면을 커버하고 항생제 내성 감염 1,2으로 이어질 수있는 biofilm을 생산 할 수 있습니다. 임플란트 - 관련 감염의 치료가 자주 반복 ​​debridements과 장기간 비경 항생제 치료 장기 입원이 필요합니다. 항생제 내성의 경우, 보형물의 제거가 필요할 수 있습니다. 항생제에 대한 박테리아의 증가 저항도 등의 질병 통제 및 예방 (CDC)의 센터에 의해 참조되었습니다 &quot;세계에서 가장 급박 한 건강 문제 중 하나입니다.&quot; 시간이, 새로운과 효과적인 항균 요법의 개발없이, 그것은 다중 약물 내성 병원균은 기존의 항생제와 untreatable 될 가능성이 있습니다. 임플란트 - 관련 예방감염 것이 중요하며, 새로운 예방 대리인 또는 접근 방법은 이러한 감염을 예방하기 위해 필요합니다. 혈소판이 풍부한 혈장 (PRP)은 뼈와 뼈 이식 치료 3-5으로 도움을 줄 수 30 성장 요인을 포함 autologous 혈액의 농도이다. 뼈 재생과 부드러운 조직 성숙을 향상시키는 PRP의 응용 프로그램이 점점 때문에 혈소판에 의해 발표 다양한 성장 요인의 높은 농도의 병원에서보고되었습니다. PRP의 여러 특성은 PRP는 항균 특성에게 6-9있을 수 있습니다 것으로 나타났습니다. PRP는 혈소판의 큰 번호, 백혈구의 높은 농도 (세균 및 곰팡이에 대한 호스트 방어 동작을 가지고 할 수있는), 그리고 여러 항균 펩티드 7,8,10가 포함되어 있습니다. 심장 수술 환자의 큰 일대의 최근 연구에서,이 드러났다 그 상처 폐쇄 signif 동안 PRP-젤의 intraoperative 사용icantly 표면과 깊은 가슴 감염 (11)의 발생률을 감소. 이러한 이유와 관찰의 경우, 우리는 PRP는 그 잘 공부 치료 - 추진 특성 외에, 항균 특성을 가지고 가상. 감염을 방지하기 위해 PRP를 사용하는 잠재적 인 장점이 포함될 수 있습니다 :은 (i) PRP는 기존의 항생제 치료에 비해 저항을 유도 할 가능성이 적습니다. PRP의 치료 - 홍보 특성은 병원균과 인간의 세포가 이식 표면 12 질주를하고 같이함으로써 감염 가능성을 줄여 세균 첨부 파일을 방지하기 위해 인감을 제공 할 수 경우, (ii) PRP는 감염 예방에 시너지 효과가있을 수 있습니다 치유를 촉진 속성을 가지고 있습니다 13. (III) PRP는 본질적으로 biocompatible하고, 안전하고 전도 할 수있는 질병의 위험에서 무료입니다. 우리의 장기 목표는 임플란트 - 관련 infecti을 방지하기 위해 새로운 접근 방법으로 PRP를 사용하는 것입니다기능. 본 연구의 목적은 체외 항균 속성에 PRP의를 검사하기 위해, 두 번 원심 분리 방식을 사용하여 PRP를 준비하고, 이러한 항균 속성을 평가하기위한 프로토콜을 설명하는 것이 었습니다.

<table><tbody><tr><td>소 트롬빈</td><td>King Pharmaceuticals, Inc</td><td>60793-215-05</td><td>트롬빈 (소 유래)</td></tr> <tr><td>염화칼슘</td><td>King Pharmaceuticals, Inc</td><td>60793-215-05</td><td>10 % 염화칼슘</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>이소 플루란</td><td>Baxter</td><td>1001936060</td><td></td></tr><tr><td>Mueller Hinton 육수</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>275710</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>시트르산 삼나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W302600</td><td></td></tr><tr><td>트립틱 대두 한천</td><td>Fisher Scientific</td><td>R01202</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Kendro 실험실 제품</td><td>750043077</td><td></td></tr><tr><td>주사기 필터</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr></tbody></table>

준비를 한 다음 감염을 방지하기 위해 새로운 접근 방식으로 prp<em&gt; 체외에서</emprp의&gt; 항균 속성

PRP as a New Approach to Prevent Infection: Preparation and In vitro Antimicrobial Properties of PRP

임플란트 - 관련 감염 항생제 저항, 동물과 인간 사이의 항생제 내성 박테리아의 전송과 감염을 치료의 높은 비용을 증가로 인해 점점 더 의료 산업에 더 도전 세계적되고 있습니다. 본 연구에서는, 우리는 혈소판이 풍부한 혈장 (PRP)의 잠재적 인 항균 특성을 바탕으로 임플란트 - 관련 감염을 예방에 효과가있을 수 있습니다 새로운 전략을 공개. 치유를 촉진위한 잘 연구 특성으로 인해, PRP는 (생물 제품) 점점 정형 외과 수술, 치주 및 구강 수술, 악안면 수술, 플라스틱 수술, 스포츠 의학 등 임상 응용에 사용되었습니다 PRP는 임플란트 - 관련 감염을 예방 기존의 항생제 치료에 대한 고급 대안이 될 수 있습니다. PRP의 사용은 기존의 항생제 치료시에 비해 유리할 수있다PRP는 항생제 저항을 유도 할 수 있고 PRP의 항균 및 치료 - 홍보 속성이 감염 예방에 시너지 효과가있을 수 있습니다 적은 가능성이 nce. 그것은 잘 병원균과 인간의 세포가 이식 표면에 경주하는 알려져 있으며, 홍보 치유의 PRP의 속성함으로써 감염 가능성을 줄여 인간의 세포 첨부 파일을 향상 수 있습니다. 또한, PRP는 본질적으로 biocompatible하고, 안전하고 전도 할 수있는 질병의 위험에서 무료입니다. 우리의 연구를 들어, 우리는 일반적으로 정형 외과 감염에서 발견하고 PRP이 박테리아에 대한 체외 항균 속성에 있는지 여부를 검사 몇 가지 임상 박테리아 변종을 선택했습니다. 우리는 같은 혈소판 농도가 모든 샘플에 대해 얻을 수 할 수있는 두 번 원심 분리 방식을 사용하여 PRP를 준비했습니다. 우리는 일관성있는 항균 결과를 달성하고 PRP는 methi 같은 세균에 대한 시험 관내 항균 속성에 강한 것으로 나타났습니다cillin에 민감한와 methicillin - 내성 황색 포도상 구균, 그룹 연쇄상 구균과 Neisseria gonorrhoeae. 따라서, PRP의 사용은 감염을 예방하고 임플란트 - 관련 감염의 비용이 많이 드는 수술 치료의 필요성을 줄일 수있는 가능성이있을 수 있습니다.

PRP는 reproducibly 두 번 원심 분리 방식 (그림 1)를 사용하여 준비가되어 있습니다. PRP는 methicillin 내성 S.에 대한 체외 항균 속성에 (CFUs에서 최대 100 배 감소) 강한 제시 찾을 수 있습니다 구균 (MRSA) (그림 3)은, 그는 일반적으로 전세계 병원 14에서 발견됩니다. 마찬가지로, PRP는 methicillin에 민감한 S.에 대한 강력한 항균 특성을 가지고 구균 (MSSA), 그룹 연쇄상 구균과 Neisseria gonorrhoeae. 두 번 원심 분리 방식은 동일한 혈소판 농도 (즉, 2.0 X 10 6 혈소판 / μl)는 있지만 PRP 취득을 허용하지...

임플란트 - 관련 감염은 중요한 임상 합병증입니다. 이 연구는 임플란트 - 관련 감염을 방지하기 위해 혈소판이 풍부한 혈장 (PRP)를 사용하여 접근 방식을 설명 지속적인 혈소판 농도와 PRP를 준비 프로토콜을 제시하고, PRP의 새로 확인 된 항균 특성 및 항균 특성을 조사에 대한 관련 프로토콜을보고<em&gt; 체외 인치</em

준비를 한 다음 감염을 방지하기 위해 새로운 접근 방식으로 PRP<em&gt; 체외에서</emPRP의&gt; 항균 속성

Implant-associated infection is becoming more and more challenging to the healthcare industry worldwide due to increasing antibiotic resistance, ...

이 실험 절차의 전체적인 목적은 혈소판 풍부 혈장(PRP)의 인비트로(in vitro) 항균 특성을 조사하는 것입니다. 먼저, 공여 토끼로부터 혈소판 풍부 혈장을 분리합니다. 다음으로, 세균 접종액을 준비한 후, 트롬빈을 사용하여 PRP를 활성화하고 이를 세균 접종액과 혼합합니다.혼합물을 배양하고 샘플을 채취하여 생성된 집락 형성 단위(colony forming units)를 측정합니다. PRP 처리된 샘플에서 대조군 샘플에 비해 CFU가 감소함으로써 PRP의 항균 특성이 입증됩니다. PRP 처리를 하지 않은 경우, 혈소판 풍부 혈장(Platelet rich plasma)은 기존의 BOL 처리법에 비해 BOL 내성을 유발할 가능성이 더 낮습니다.또한 이는 상처 치유를 촉진하는 특성을 가지고 있어 감염 예방에 시너지 효과를 낼 수 있습니다. 본 프로토콜에서는 2회 농축 방식이 수행되었으며, 혈액 내 기저치보다 약 10배 높은 농도의 백혈구가 포함된 PRP의 혈소판 농도를 2 x 10⁶ platelets로 표준화하여 사용하였습니다. 백혈구 또한 직접적인 세균 살해 및 항원 특이적 면역 반응에 관여하며, 이는 PRP의 항균 특성에 기여할 수 있습니다. 먼저 이소플루린(isoflurane)을 흡입시켜 토끼를 마취합니다.0.129 moles per liter의 Tri sodium citrate 2 mL를 20 mL 주사기에 취합니다. 토끼 귀를 70% ethanol로 소독합니다.25 gauge 버터플라이 바늘을 사용하여 토끼의 귀정맥에서 혈액을 채취하고, 가볍게 흔들어 혈액을 시트르산 나트륨 용액과 혼합합니다. 항응고 처리된 혈액을 50 milliliter 플라스틱 원심분리 튜브로 옮깁니다.스윙 아웃 로터를 사용한 혈구 계수법으로 기저 혈소판 수를 결정하기 위해 10 µL의 혈액을 취합니다. 가속 및 감속 속도를 '낮음'으로 설정하고 300 Gs에서 10분 동안 혈액을 원심분리합니다. 층이 흐트러지지 않도록 주의하며 원심분리 튜브를 상온에서 세포 배양 후드로 조심스럽게 옮깁니다.혈장 버피코트(buffy coat) 전체와 2~3mm 두께의 적혈구 층을 15mL 플라스틱 튜브로 옮깁니다. 옮겨진 시료를 3000 Gs에서 15분 동안 원심분리합니다. 상온에서 혈소판 결핍 혈장(platelet poor plasma) 상층액을 새 튜브로 옮깁니다.PPP를 사용하여 남은 혈액 샘플의 혈소판 농도를 조절함으로써, S reus의 하룻

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

여기, 제한 효소 사이트를 동의어 DNA 시퀀스에 삽입 및 기능 플라스미드 복구를 기반으로하는 프로토콜 인 플라스미드 회수 및 제한 효소 사이트 삽입 (CAPRRESI)에 의한 키메라 어셈블리를 제시합니다. 이 프로토콜은 단백질 코딩 유전자 융합을위한 빠르고 저렴한 방법입니다.

카스트레 : 플라스미드 회수 및 제한 효소 부위 삽입에 의한 키메라 조립

이 종이 androgenetic 탈모 증 30 게이지 바늘을 갖춘 의료 인젝터 총을 사용 하 여 5 m m의 깊이에 의해 영향을 받는 23 환자의 두 피에 interfollicular 헌 혈소판이 풍부한 혈장 주사 (0.20 mL x2cm)를 설명 하는 것을 목표로 3 세션입니다.

Androgenetic 탈모 증에 의해 영향을 받는 환자에서 기계 및 제어 PRP 주사

프로토콜 선물 대장균-lactococcal 항균 성 펩 티 드 nisin에 비정규 아미노산 (ncAAs)의 선택적 압력 관을 기반으로. 재조합 식을 통해 대체 정의 된 성장 매체에서 원하는 ncAAs로 동안 그것의 속성을 변경할 수 있습니다. Bioactivity 결과 변화 성장 금지 분석 실험 및 형광 현미경 검사 법에 의해 매핑됩니다.

정식이 아닌 아미노산의 선택적 압력 관에 의해 생산 하는 항균 성 펩 티 드

우리는 항생제의 복제를 위한 이소제닉 항생제 저항하는 대장균의 도서관을 이용하는 플랫폼을 기술합니다. 박테리아 또는 곰팡이에 의해 생성된 항생제의 정체성은 각각의 내성 유전자를 발현하는 대장균의 성장에 의해 추론될 수 있다. 이 플랫폼은 경제적으로 효과적이고 시간 효율적입니다.

항생제 내성 플랫폼을 이용한 항생제 복제

이 프로토콜은 100% 자가 섬유아세포 배양 시스템에서 세포의 시험관 내 확장을 촉진하기 위해 PRP를 생성하는 장치를 제시합니다.

In Vitro 인간 섬유아세포 확장을 촉진하기 위한 자가 혈소판 풍부 혈장 생산

이 프로토콜은 황색포도상구 균 의 내재화의 범위와 인간 숙주 세포 내부에서 살아남을 수있는 능력뿐만 아니라 항균 화합물의 세포 내 효능을 연구하는 방법을 설명하는 것을 목표로합니다.

황 색포도상구균 내산화 및 항균 화합물의 세포 내성 효능을 연구하는 향상된 효소 보호 분석

시험관 내 기술을 사용하여 나노 입자 및 나노 구조 표면의 항균 활성을 평가하는 네 가지 방법을 소개합니다. 이러한 방법은 다양한 나노 입자 및 나노 구조 표면과 광범위한 미생물 종의 상호 작용을 연구하는 데 적용될 수 있습니다.

시험관 내에서 나노 입자 및 나노 구조 표면의 항균 활성 평가

이 프로토콜은 클린룸 환경에서 미생물 바이오버든을 최소화하기 위한 모범 사례를 요약하고 환경 모니터링, 공정 모니터링 및 제품 멸균 테스트와 같은 전략을 포함합니다. 이는 현재 우수 조직 관행 표준 및 현재 우수 제조 관행 표준을 충족하는 데 필요한 제조 및 테스트 시설과 관련이 있습니다.

클린룸 환경 및 세포 치료를 위한 미생물 제어 및 모니터링 전략

실험실 환경에서 일반적으로 사용되는 영역을 프리온 오염 및 효과적인 오염 제거를 평가하는 방법은 부족합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 특정 실험실의 개별 요구 사항을 충족하도록 쉽게 수정할 수 있는 실험실 프리온 안전 스와이프 테스트를 구현하기 위한 핵심 기본 사항을 제공합니다.

Prion 안전 연구소 스와이프 테스트

우리는 retroviral 전달을 사용하여 항원 - 특정 마우스 T - 세포를 생산하는 프로토콜을...

마우스 T - 세포에서 T - 세포 수용체의 Retroviral 전달

학습하세요 체외에서 혈소판 풍부 혈장(PRP)의 항균 특성을 평가하는 방법을. 토끼에서 PRP를 분리하고 혈소판 농도를 표준화하여 이식물 관련 감염 예방에 활용할 수 있습니다.

준비를 한 다음 감염을 방지하기 위해 새로운 접근 방식으로 PRP

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