Name: 재조합 핵심 히스톤에서 뉴 클레오 배열과 뉴 클레오 솜 위치 DNA의 조립 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-10T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: 배우세요 재조합 핵심 히스톤과 뉴클레오솜 위치 DNA를 이용한 뉴클레오솜 배열 조립 방법을. 침전 속도 실험과 원자력 현미경으로 포화도를 평가하여 염색질 구조와 기능을 연구합니다.

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이 작품은 NIH 보조금 GM45916 및 GM66834 JCH 및이 작품을 AK하는 국제 레트 증후군 재단의 화목에 의해 지원되었다는 NIH가 GM088409와 하워드 휴즈 의학 연구소에게 KL 공헌을 부여에 의해 지원되었다

1. Octamers 재조합 핵심 히스톤의 조립 이유 : 뉴 클레오 어레이 재구성의 첫 번째 단계는 동결 건조 된 재조합 코어 히스톤으로부터 네이티브 코어 히스톤 octamers을 제조하는 공정이다. 히스톤 단백질은 동일한 몰 양의 결합 버퍼를 재 접힘에 변성 버퍼 중 샘플을 투석에 의해 히스톤 octamers로 조립된다. <ol><li> 정화 (13)을 설명 된대로 (H2A, H2B, H3, H4) 재조합 핵심 히스톤을 냉동 건조. </li><li> 전개 버퍼 (6 M 구 아니 염산, 20 MM 트리스 산도 7.5, 5 mM의 DTT)의 3 ㎖에 각 동결 건조의 핵심 히스톤의 약 5 밀리그램을 녹입니다. 각 나누어지는 적어도 한 시간 동안 분해 할 수 있습니다. 어떤 단백질이 용기의 측면에 남아 있는지 확인합니다. </li><li> 참고로 전개 버퍼를 사용하여 276 nm에서 각 히스톤의 흡광도를 측정한다. </li><li> 그들의 흡광 계수를 사용하여 각 히스톤의 몰 농도를 계산한다 (표 1 참조 </st룽&gt; Xenopus의 히스톤 흡광 계수의 경우). 단백질의 대부분이 용해되면 동결 건조 중량 및 추정에 히스톤의 흡광도 결정된 농도를 비교한다. </li><li> 이 모든 히스톤에 대한 몰수의 제한 수있을 것입니다, 당신이 가장 적은 몰수이있는 히스톤 결정합니다. </li><li> 동일한 몰 양으로 히스톤을 결합하고 1 ㎎ / ㎖의 최종 농도로 버퍼를 전개로 희석. </li><li> 6-8 kDa의 MWCO 투석 튜브에 샘플을 놓습니다. 튜브를 밀봉하고 차가운 폴딩 버퍼의 2 L에 배치 (2 M의 NaCl, 10 MM 트리스 산도 7.5, 1 ㎜ EDTA, 5 MM의 β-머 캅토 에탄올). </li><li> 교반하면서 4 ° C에서 18 시간 동안 샘플을 Dialyze. 확인 투석 튜브 자유롭게 적극적으로 회전 할 수있다, 또는 다른 히스톤이 침전하는 경우가 있습니다. </li><li> 두 번 18 시간 동안 (완료 될 때까지 즉, 매 6 시간에 대해 폴딩 버퍼를 변경)의 투석 버퍼를 변경합니다. 침전물이 형성된 경우에도 폐기하지수율이 감소 하겠지만 샘플 일부 옥타 머를 복구 할 수 있습니다. </li></ol> 참고 : 다음 일에 대한 열 평형을 준비하는 단계 2.1-2.2를 참조하십시오. 2. 크기 배제 크로마토 그래피로 정제하여 히스톤 Octamers 이유 : 섹션 1과 체결 한 후, 샘플 히스톤 octamers뿐만 아니라 집계, H3/H4의 테트라, 그리고 H2A/H2B 이량 체와 같은 다른 히스톤 복합체를 포함합니다. 히스톤 octamers 멀리 크기 배제 크로마토 그래피 (SEC)를 사용하여 다른 착물로부터 정제한다. <ol><li> HiLoad FPLC 시스템에 60분의 16 Superdex200 60분의 16 (S200) 열을 연결합니다. 기포가 시스템에 입력하지 않았는지 확인합니다. </li><li> 0.2 μm의 여과 물 S200 열을 청소합니다. 0.3 ㎖ / 분의 유속을 사용하여 0.5 ㎫의 배압 한도를 설정. 당신은 충분한 물이 있는지 확인하고, 열이 밤새 청소 할 수 있습니다. </li><li> F의 S200의 열 및 샘플 루프를 평형PLC는 버퍼를 사용하여 리 폴딩. 0.2 μm의 여과 폴딩 버퍼의 1 L를 사용합니다. / 분으로 1 ㎖의 비율로 약 2 시간 동안 0.5 MPa의 최대 압력에서 칼럼을 통해 완충액을 폴딩 흐름. </li><li> 리 폴딩 완충액을 1 ㎖로 원심 Vivaspin 농축기 (50 kDa의 MWCO)를 평형. 투석 튜브에서 샘플을 제거하고 침전물을 제거하기 위해 4 ° C에서 샘플을 원심 분리기. 집중에 샘플 상층 액을 피펫. 약 500 μL의 부피로 샘플을 집중한다. </li><li> 새 컨테이너에 집중 옥타 머 샘플을 제거하고 1 ㎖는 버퍼를 재 접힘과 집중을 씻어. 500 μL에 린스를 집중하고, 옥타 머 샘플에 추가합니다. 이것은 집중에 남아있는 옥타 머를 구제하는 데 도움이됩니다. </li><li> 4 ℃에서 10,000 rpm에서 5 분 동안 1.5 ML의 미세 원심 분리 튜브에 샘플을 스핀 상층 액을 수집하고 새로운 튜브로 전송할 수 있습니다. 이 FPL의 샘플을로드하기 전에 침전물을 제거하는 데 도움이C. </li><li> S200 칼럼 상에 샘플을로드합니다. 하나의 정제에 1.5 ㎖의 전체 볼륨 또는 15 밀리그램의 옥타 머의 최대로드합니다. </li><li> 갓 만든 리 폴딩 완충액을 사용하여 샘​​플을 용출. 1 ㎖ / 분의 유속 및 0.5 MPa의 배압 제한을 사용한다. 버퍼를 폴딩 두 열 볼륨 (400 ㎖)에 사용하고 2 ㎖ 분수를 수집합니다. 용출 동안 280 nm에서 흡광도를 모니터링합니다. 다른 종의 크기가 감소하는 순서로 용출됩니다. 히스톤 집계는 보통 약 84 ㎖ (그림 1)에서 약 45 ㎖, 옥타 약 65 ml로하고, 이량 체를 용출. </li><li> 18~20% SDS-PAGE에서 샘플을 실행하여 그 봉우리에서 용출 분수를 분석합니다. 정제 octamers을 포함하는 분획을 네 가지 핵심 히스톤 단백질의 동일 몰 양의 (그림 1)이 있어야합니다. </li><li> 정제 octamers를 포함하는 분수 수영장, Vivaspin 원심 필터를 15 ㎎ / ㎖를 ≤에 집중한다. 희석을두면, octamers는 끊을 수 있습니다 In을 H2A/H2B 이합체와 H3/H4의 사량. </li><li> 280 nm에서 흡광도를 측정함으로써 옥타 머의 농도를 측정하고 표 1에서 흡광 계수를 사용하여 계산한다. </li><li> 히스톤 octamers 4 ℃에서 접힘 버퍼에 짧은 기간 유지 될 수있다 장기적으로 저장되는 경우, octamers는 -20 ° C에서와 50 % 글리세롤 용액에 더 안정 될 것입니다. 글리세롤에 저장 Octamers 흡광도 측정 전에 신선한 폴딩 버퍼에 투석과 뉴 클레오 배열 reconstitutions에 사용되어야한다. </li></ol> 3. DNA에서 뉴 클레오 배열 및 정화 Octamers의 재구성 이유 : 뉴 클레오 배열에서 재구성 히스톤 octamers 및 템플릿 DNA가 특정의 몰 비율로 결​​합해야합니다. 2 M 염화나트륨의 DNA와 히스톤 octamers의 혼합물은 이온 강도가 감소하는 버퍼에 투석 단계입니다. 낮은 소금에 점차적 인 변화는 적절한 뉴 클레오 솜 형성을 보장합니다. N 얻기템플릿 DNA의 히스톤 옥타 머 포화 원하는 수준 ucleosomal 배열은 대규모 예비 재구성 다음에 작은 규모의 시험 reconstitutions가 필요합니다. 작은 규모의 reconstitutions에 의해 정의 된 적절한 조건은 예비 재구성을 안내하는 데 사용됩니다. <ol><li> 4,12 바와 같이 tandemly 반복 뉴 클레오 솜 위치 DNA를 정제 하였다. 간단히, Qiagen 사 GigaPrep 키트 또는 유사한 제품을 이용하여 플라스미드 DNA를 분리. 셋업 제한 효소 템플릿 DNA를 분리하고 작은 크기 (≤의 약 700 bp)의 플라스미드 DNA를 소화하기 위해 소화를. 템플릿 DNA는 멀리 크기 배제 크로마토 그래피 (SEC)를 사용하여 작은 플라스미드 DNA 잔재로부터 정제 할 수있다. 중력이 세파 크릴 S-1000의 구슬로 포장 약 115 cm의 높이, 열 공급은 601 207bp X 12mer의 DNA의 정화에 충분하다. </li></ol> 참고 : 플라스미드 DNA의 감소 비용으로 정화하지만, 증가 EFF를 위해ORT, 하나는 E.부터 플라스미드 DNA를 분리하기 위해, 페놀 / 클로로포름 DNA 정제하여 알칼리 용해를 사용 대장균 (23, 24). 플라스미드 DNA의 주형 DNA를 분리하기위한 전략 템플릿 DNA의 크기의 변화에​​ 따라 달라질 수 있습니다. 삼성 전자의 경우는 제한 효소 템플릿 및 플라스미드 DNA 사이의 크기의 차이를 최대화하는 방식으로 소화를 설정하는 것이 중요합니다. <ol start="2"><li> 몰비 (R)은 reconstitutions에 사용할 판별. r은 반복의 DNA 몰에 옥타 머의 몰 비율이 동일하다. 의도가 포화 뉴 클레오 배열을 취득하는 경우 초기 작은 규모의 실험을 위해, 0.9, 1, 1.1의 R 값이 적합합니다. </li><li> 테스트 할 각각의 몰비 약 18 μg의 DNA에 추가 옥타 머의 양을 계산함으로써 소규모의 샘플을 준비한다. DNA와 히스톤 octamers을 섞는다. 샘플의 NaCl의 최종 농도는 2 ≥ M을, 그리고 D의 최종 농도되어야NA는 약 0.3 ㎍ / ㎕를해야한다. 최종 샘플 버퍼 조건은 10​​ MM 트리스 산도 7.8, 1 mM의 EDTA를 포함해야합니다. </li><li> 샘플은 현재 투석을위한 준비가되어 있습니다. 12K-14K MWCO 투석 튜브에 샘플을로드합니다. 다음과 같이 이온 강도가 감소하는 버퍼의 2L에 대해 샘플을 Dialyze. </li></ol> 10 MM 트리스 산도 7.8, 1 ㎜ EDTA : 모든 버퍼의 구성 요소. 버퍼 1 ~ 6 시​​간 동안 (1 M의 NaCl, 1 mM의 DTT 추가). 버퍼 2 하룻밤 (825 M의 NaCl, 1 mM의 DTT 추가). 버퍼 3 ~ 6 시​​간 동안 (2.5 밀리미터의 NaCl, 1 mM의 DTT 추가). 버퍼 4 하룻밤 (2.5 mM의 염화나트륨, 0.1 ㎜ PMSF 추가). <ol start="5"><li> 투석 튜브에서 샘플을 제거하고 섹션 4-6를 진행합니다. 소량의 샘플은 원하는 결과를 산출하는 경우, 대규모 섹션 3-6의 단계를 반복한다. </li></ol> 주 : 자원을 보존하기 위해, 소규모 샘플 하류 스크리닝 분석법을 위해 충분하기 위해 필요한 최소 체적을 가져야한다. E가하기 위해서는계속하지 0.3 ㎎ / ㎖ DNA에 여기에 나열된 침강 속도와 AFM 실험, 50 ㎕의 샘플에 대한 샘플이 적합합니다. 큰 규모의 크기는, 분취 샘플들은 의도 된 사용에 의존한다. 대규모 샘플은 작은 규모의 샘플과 동일한 방식으로 제조한다. 4. 재구성 된 뉴 클레오 배열의 침강 속도 분석 이유 : 용액에서 분자의 크기와 모양에 베크 XL-A / I 분석 초원 심 분리기 수익률 정보에 침강 속도 실험. 저염 조건에서 수행 침강 속도 실험을 재구성 배열이 뉴 클레오으로 포화되는 범위를 결정하는 데 사용됩니다. <ol><li> TEN 버퍼 (10 MM 트리스 산도 7.8, 1 ㎜ EDTA, 2.5 mM의 염화나트륨)를 사용하여 260 nm에서 0.5 정도 흡수에 샘플을 희석. 한쪽 샘플과 referen으로, 두 부문 중심으로 셀에 시료 400 μl를로드다른 25 CE (TEN 버퍼). (즉, 420 ㎕를 참조 솔루션을 추가) 샘플 메 니스 커스 (meniscus)보다 더 높은 기준 메 니스 커스 (meniscus)를 유지합니다. </li><li> 로터에 세포를 넣고 적절히 세포와 로터 (25)의 하단에 해시 마크를 이용하여 셀을 정렬. 부드럽게 압축 공기를 이용하여 세포의 렌즈 먼지. </li><li> , XL-A/XL-I 원심 분리기에 돌려 로터를 삽입하고, 연결하고 사용 설명서에 설명 된 바와 같이, 광학 장치를 고정합니다. 새로운 : 프로테옴 연구소 소프트웨어 선택 파일을 엽니 다. </li><li> 3,000 rpm으로 25 ℃의 온도에서 단일 스캔 실행을 설정 옵션에서 선택 마지막 스캔 후 중지 및 실행 반경 보정 (로터가 AUC에 사용 된 마지막 회 인 경우 반경 보정이 필요하지 않습니다). </li><li> 각 셀의 경우, 샘플의 이름을 파장 (260 나노 미터)을 선택, 흡광도를 선택하고 컴퓨터에서 파일을 저장할 위치를 선택합니다. 단일 스캔 실행을 시작합니다. </li><li> 적절한 RA를 결정하는 하나의 스캔을 사용하여스캔 길이 (그림 2A)를 다이얼. 스캔 할 셀의 길이를 줄이면 실행 시간을 감소시킵니다. 그러나, 샘플 메 니스 커스 (meniscus)를 포함하고 매우 가깝거나 셀의 하단에 끝을 확장해야합니다. </li></ol> 참고 : 싱글 스캔이 측정 영역은 단지 샘플 메 니스 커스 (도 2A) 전에 시작하여 측정 줄어드는 것을 허용한다. AUC를 실행하는 동안 생성 된 검사의 대부분은 메 니스 커스 (meniscus)뿐만 아니라 안정적인 고원 (그림 2B) 지난 경계 분수가 있어야합니다. AUC 세포에 더러운 렌즈가 큰 스파이크 스캔을 생성 할 수있는 데이터의 분석에 영향을 미칠 수있다. 기능 UltraScan 소프트웨어는 분석 초 원심 데이터 (26)의 분석에 관한 정보를위한 좋은 자원이다 설명서가 포함되어 있습니다. <ol start="7"><li> XL-A/XL-I 제어 패널을 사용하여, 0의 속도와 키를 눌러 시동을 입력합니다. 이 진공을 모두 끌어 원심 분리기 챔버를 묻는 메시지가 표시됩니다아야 챔버의 온도는 평형. 실행을 시작하기 전에 온도 평형 수 있도록 1 시간을 기다립니다. </li><li> 원하는 속도 및 스캔의 수에 대한 실행까지를 설정하는 소프트웨어를 사용합니다. 높은 속도는 해상도를 증가하지만, 샘플 셀의 바닥에 침전되기 전에 하나는 적어도 20 스캔 (바람직하게는 그 이상)를 수집한다. 그것은 실행의 진행 상황을 모니터링하고 누출 세포와 같은 잠재적 인 문제를 확인하기 위해 (옵션 메뉴에서 수행) 지난 몇 검사를 오버레이하는 것이 편리하다. 올바른 작동을 보장하기 위해 검사의 첫 번째 커플을 모니터링합니다. </li></ol> 5. 침강 속도 데이터를 편집 및 분석 이유 : 원시 침강 속도 데이터는 확산 보정 침강 계수 분포를 산출 프로그램에 의해 분석한다. 차례로이 정보는 관련 포화 레벨을 포함하는 재구성 된 샘플의 일부를 나타내고, 예를 들면 </EM&gt; 12 메르 DNA 템플릿을 사용하는 경우는 10, 11, 12 뉴 클레오 / DNA를 가지고 재구성 된 배열의 분획을 결정할 수있을 것이다. <ol><li> 데이터 26 편집 등의 UltraScan로 AUC 데이터 분석 소프트웨어를 사용합니다. 스캔 데이터의 편집은 각각의 셀에 대해 수행 및 후속 분석을위한 데이터 세트를 생성해야합니다. 스캔의 적절한 편집, 샘플 메 니스 커스를 정의하는 관심 영역에 데이터를 감소시키고 기준뿐만 아니라 고원 영역 (도 2)를 정의하는 것을 포함한다. 원하지 않는 스캔의이 시점에서 데이터 세트로부터 제거 될 수있다. 이 분석에서 불필요한 검사를 제거하는 것이 가능하기 때문에, 그것은 모든 스캔이이 시점에서 유지하는 것을 추천합니다. </li><li> 우리는 강력하게 강화 된 반 Holde-Weischet 방법은 데이터 27를 분석하는 데 사용하는 것이 좋습니다. 이 분석 방법은 런의 과정을 통해 확산의 효과를 보정하고, 침강 계수의 적분 분포를 산출한다. 특히, 강화 된 반 Holde-Weischet 방법 (의 UltraScan에서 구현) 안정 고원 부족, 또는 분석 (28)에 메 니스 커스 (meniscus)을 삭제하지 않은 경계 분수를 포함하는 검사의 포함을 허용합니다. </li><li> 조립 배열의 침강 계수의 분포를 결정합니다. 601-12 (207bp, 12 메르) 뉴 클레오 배열의 대표 결과는 그림 3에 나와 있습니다. </li><li> 작은 규모의 샘플 중 하나가 침강 계수의 원하는 범위의 배열이 포함되는 경우, 제 3 항부터 증가 규모 과정을 반복합니다. 작은 규모의 샘플 중에 침강 계수의 적절한 분배가없는 경우 다음 섹션 3에서 시작하는 새로운 연구 범위와 작은 규모의 테스트를 반복합니다. </li></ol> 6. 원자 힘 현미경을 사용하여 뉴 클레오 배열을 시각화 (AFM) 이유 : AFM은 수 nucleosoma의 포화 수준의 시각화L 배열. 이 기술은 품질 관리 분석으로 AUC 및 제한 효소 소화에 의한 침강 속도를 보완한다. <ol><li> 전술 한 방법을 사용하여, 잘 포화 뉴 클레오 어레이 (도 5a)을 얻었다. </li><li> 준비 APTES가 배치하여 운모 슬라이드를 처리 ~ 30 ㎕를 30 분 동안 0.22 μm의 여과 nanopure 물에 상용 (시그마 - 알드리치 (3 - 아미노 프로필) 트리에 톡시 실란의 A3648-100ML)의 1:1,000 희석. </li><li> 30 분 후 여과 물 APTES를 씻어 부드럽게 질소 흐름을 건조. </li><li> 슬라이드에 적절히 희석 뉴 클레오 배열 샘플 (~ 1.5 NG / μL)를 놓고 15 분 동안 실온에서 해당 품어. </li><li> 필터링 된 샘플 버퍼와 오프 샘플링 이전 건조하고, AFM (이 경우 정신 병원 연구 MFP - 3D 원자 힘 현미경)의 무대에 장소 슬라이드 씻어. </li><li> 512 스캔 라인을 2 × 2 μm의 스캔 이미징에 의해 시작합니다. SA의 수준을 확인하는 뉴 클레오 솜의 수를 계산turation (그림 5B). </li><li> 이상적으로해야 잘 분리 된 뉴 클레오 배열과 슬라이드 이미지 영역. </li><li> 높은 해상도 이미지의 경우 500 × 500 nm의 스캔 (그림 5C)를 얻을 수있다. </li><li> 이미지는 평탄화 및 정신 병원에서 제공 MFP-3D 소프트웨어를 사용하여 분석 할 수있다. </li><li> 각각의 이미지는 네 개의 사분면으로 나누어 뉴 클레오 (그림 5C, 오른쪽 패널 높이 추적에 대해받은 배열과 높이 프로파일을 그릴 수있는 잘 분리 배열과 여러 무료 손으로 라인을 명확하게보기를 얻기 위해 디지털 방식으로 확대 할 수 있습니다 및 (d)). </li><li> 몇몇 그러한 이미지는 뉴 클레오 수백 포괄 어레이의 각 유형에 대해 분석한다. 높이 프로파일은, 기록 분류 및 MS Excel에서 그려집니다. </li></ol>

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</ol>

저자는 이익의 충돌이 없습니다.

모델 뉴 클레오 어레이는 염색질 구조와 기능의 시험 관내 연구에 매우 유용한 도구이다. 예를 들어, 널리 용액 30-34에서 염색질 섬유 축합 메카니즘을 연구하는 데 사용하고, 그것이 가능 tetranucleosome (35)의 x-선 구조를 구하는되었습니다. 최근에 그들은 특정 핵심 히스톤 변형, 돌연변이 전사 후 수정 14-16,36의 구조적 효과를 해독에 유용 입증했다. 여기에서 우리는 뉴 클레오 솜 위치 DNA 재조합 핵심 히스톤에서 모델 뉴 클레오 배열의 어셈블리에 대한 일반적인 방법을 설명합니다. 정제 octamers 601 207 X 12 DNA에서 뉴 클레오 배열의 재구성은 순차적으로 2 M 2.5 밀리미터에서의 NaCl 농도를 낮추는 여러 가지 투석 단계를 포함하는, 간단합니다. 프로토콜의 가장 어려운 부분은 원하는 TEM을 산출 r 값을 사용하는 것이다판 포화 수준...

진핵 생물의 게놈은 벌거 벗은 DNA가 존재하지 않고, 압축 및 결합 단백질에 의해 구성됩니다. DNA와 단백질의이 단지는 염색질로 알려져 있습니다. 염색질의 기본 반복 단위는 뉴 클레오입니다. 뉴 클레오 히스톤 옥타 약 1.6 배 1 옥타 머 히스톤 주위에 감싸 인 DNA의 146 개의 염기쌍으로 구성되어 있습니다. 히스톤 옥타는 두 개의 복사본 핵심 히스톤의 H2A, H2B, H3, H4와 각각 구성되어있다. 반복적 DNA 분자를 따라 간격이 핵심 히스톤 octamers는 뉴 클레오 배열이라고합니다. 뉴 클레오 배열의 확장 구조는 구조 &quot;문자열에 구슬&quot;10 나노 섬유 또는로하고, 저 염분의 조건 2에서 체외에 존재하고있다. 10 ㎚ 섬유는 배열 내부 압축 및 / 또는 인터 - 배열 올리고머 (2)를 통해 고차 구조로 집광 할 수있다. 이러한 고차 구조, 염의 존재하에 유발 될 수있다또는 뉴 클레오 배열 3,4에 염색질 건축 단백질의 결합을 통해 영향을받을 수있다. 염색질 압축의 수준은 반비례 생체 5,6의 전사 율과 상관된다. 최근의 연구는 분화, 암 발생 및 기타 7,8 같은 공정에서 게놈의 조직 구조의 중요성을 강조한다. 염색질의 구조와 기능을 연구하는 뉴 클레오 배열의 사용은 널리되고있다. 여기에서 우리는 재조합 핵심 히스톤과 뉴 클레오 솜 위치의 DNA에서 뉴 클레오 배열의 조립하는 방법을 설명합니다. 뉴 클레오 솜 위치 시퀀스의 탠덤 반복으로 재조합 DNA를 사용하여 정기적으로 간격 뉴 클레오를 포함하는 배열을 재구성 할 수 있습니다. 더 인기있는 위치 시퀀스의 두 5S rRNA 유전자 서열과 &quot;601&quot;시퀀스 9,10입니다. (601) 순서는 SELEX 실험 및 MOR에서 파생 된전자 강하게 5S 순서 11 이상의 뉴 클레오을 배치합니다. 따라서, (601) 어레이의 링커 DNA 길이는 더 균일하다. Tandemly 반복 뉴 클레오 솜 위치 DNA는 겔 여과 4,12함으로써 얻어진다. 재조합 히스톤은 E.에서 정제된다 변성 조건 13 세 미만 대장균. 재조합 히스톤의 사용은 하나의 정중 뉴 클레오 배열 히스톤 조성물을 제어 할 수있다. 예를 들어, 코어 (15, 16)은 야생형 코어 히스톤 대체 할 수있는 특정 변이 (14) 또는 번역 후 변형을 담지 히스톤. 침강 속도 실험인가 원심력 17 세 미만 용액에 고분자의 침전 속도를 모니터링 할 수 있습니다. 이것은 샘플에서 거대 분자의 크기와 형태에 대한 정보를 산출한다. 침강 속도 실험 따라서 염색질 섬유 용액 상태의 변경 사항을 공부에 적합한 도구입니다크로 마틴 응축 18에 의한 구조. 중요한 것은 뉴 클레오 배열 재구성의 품질 관리 단계로서 침강 속도 실험을 사용하는 것이 우선 필요하다. DNA와 뉴 클레오는 적절한 몰비 결합하지 않는 경우, 배열 또는 과다 포화 핵심 히스톤있을 수 있습니다. 따라서, 침강 속도 실험으로부터 얻은 정보는 DNA가 적절히 뉴 클레오로 포화되는 것을 보장하기 위해 사용된다. 그것은 이전에 uncharacterized DNA 템플릿 작업 특히, 뉴 클레오와 DNA의 채도를 추정하는 다른 방법을 사용하는 것이 중요합니다. 그러므로, 우리는 원자 힘 현미경 (AFM)을 사용하여 뉴 클레오 어레이 분석 방법을 설명한다. AFM은 수있는 강력한 기술이다 같은 포화 레벨, 히스톤 변형의 존재의 효과 또는 MgCl2를 19, 20의 효과와 같은 매개 변수의 개수의 효과를 가시화. AFM은 응용하고있다ED는 시간 경과 영상 (21)를 사용하여 뉴 클레오 역학을 연구한다. 시험관들이 AFM 이미징 22 적당한 크기의 범위에 속하기 때문에 뉴 클레오 12 메르 배열 AFM 연구에 특히 의무가 있습니다 조립. 본 연구에서 우리는 품질 관리뿐만 아니라 ( &quot;보는 것이 믿는 것&quot;) AUC의 데이터를 긍정하는 수단으로 뉴 클레오 배열의 AFM을 사용했습니다. 간단한 시각화 외에도, AFM은 추가적인 메트릭과 같은 샘플의 높이 프로파일의 측정을 허용한다.

<table><tbody><tr><td>(3-아미노프로필)트리에톡시실란</td><td>시그마-알드리치</td><td>A3648-100ML</td><td></td></tr><tr><td>6-8 kDa MWCO 투석 튜빙</td><td>Fisher</td><td>21-152-5</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad Superdex 200 16/60 열</td><td>GE</td><td>17-1069-01</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin, 50 kDa MWCO 원심 농축기</td><td>Sartorius</td><td>VS2031</td><td></td></tr><tr><td>12-14 kDa MWCO 투석 튜빙</td><td>Fisher</td><td>08-667A</td><td></td></tr><tr><td>Illustra Sephacryl S-1000 Superfine</td><td>GE</td><td>17-0476-01</td><td></td></tr><tr><td>XL-A/I 분석용 초원심분리기</td><td>Beckman-Coulter</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

재조합 핵심 히스톤에서 뉴 클레오 배열과 뉴 클레오 솜 위치 dna의 조립

Assembly of Nucleosomal Arrays from Recombinant Core Histones and Nucleosome Positioning DNA

반복적 DNA 분자를 따라 간격이 핵심 히스톤 octamers는 뉴 클레오 배열이라고합니다. 뉴 클레오 배열은 두 가지 방법 중 하나를 얻을 수있다 : 생체 소스의 정제, 또는 재조합 핵심 히스톤에서 체외에서 재구성 및 tandemly 반복 뉴 클레오 솜 위치의 DNA. 후자의 방법은보다 구조적으로 균일 한 조립 및 정밀 위치 뉴 클레오 배열을 허용하는 이점을 갖고있다. 그들이 원심력 하에서 용액을 통해 이주하는 비율을 분석함으로써 고분자의 크기 및 형상에 대한 분석 초 원심 수율 정보에 침강 속도 실험. 이 기술은, 원자력 현미경과 함께 DNA 템플릿의 대다수는 재구성 후 뉴 클레오로 포화되는 것을 보장하는, 품질 관리에 사용될 수있다. 여기에서 우리는 길이 밀리그램 수량을 재구성 할 필요가 조성이 D 프로토콜을 설명염색질의 구조와 기능의 생화학 및 생물 물리학 연구에 적합한 efined 뉴 클레오 배열.

프로토콜을 설명하기 위해 우리는 12 직렬의 601 위치 시퀀스 (601 207 × 12)의 207 bp의 반복으로 이루어진 재조합 Xenopus의 핵심 히스톤과 DNA에서 뉴 클레오 배열을 재구성. 우리는 먼저 동결 건조의 핵심 히스톤에서 네이티브 octamers을 조립 한 후 S200 열 (그림 1A)를 사용하여 FPLC에 의해 octamers을 정제. 큰 단지는 S200 열에서 이전 용출. 히스톤은 일반적으로 다음 순서로 용출 : 비 특이 히스톤 집계, 히스톤 옥타 머, H3/H4 량체 및 H2A/H2B 이합체 (그림 1A). S200 열에서 피크를 SDS-PAGE에 의해 분석 하였다. 정제 된 옥타 머 분획의 겔은 네 히스톤 단백질 (도 1b)의 몰량을 표시한다. Xenopus의 H2A와 H2B는 약 200 다에 따라 다릅니다 따라서 그들은 SDS 겔에 하나의 밴드로 표시 분자량...

방법은 재조합 핵심 히스톤에서 모델 뉴 클레오 어레이의 재구성 및 tandemly 반복 뉴 클레오 솜 위치의 DNA에 표시됩니다. 또한 분석에서 초 원심 침강 속도 실험, 및 원자 힘 현미경 (AFM)을 재구성 후의 뉴 클레오 배열 포화 정도를 모니터링하는 데 사용되는 방법을 설명한다.

재조합 핵심 히스톤에서 뉴 클레오 배열과 뉴 클레오 솜 위치 DNA의 조립

Core histone octamers that are repetitively spaced along a DNA molecule  are called nucleosomal arrays. Nucleosomal arrays are obtained in one of two  ...

본 실험의 목적은 동일한 수의 뉴클레오솜이 포함된 일련의 직렬 반복 뉴클레오솜 위치 지정 DNA 서열을 갖는 뉴클레오솜 어레이를 조립하는 것입니다. 먼저 변성 완충액에서 코어 히스톤을 투석하여 히스톤 복합체를 재접합합니다. 그런 다음 크기 배제 컬럼을 사용하여 히스톤 이량체를 분리합니다. 다음으로, 히스톤 이량체와 템플릿 DNA를 다양한 몰비로 혼합하고, 고농도에서 저농도로 염분을 단계적으로 투석하여 DNA 상에 뉴클레오솜으로 증착시킵니다.다음으로, 원하는 포화 수준에 적합한 몰비를 결정하기 위해 침강 속도로 샘플을 테스트합니다. 결과는 원심력 하에서 용액을 통한 이동 또는 원자 힘 현미경으로 생성된 이미지를 기반으로 뉴클레오솜 어레이의 포화 수준을 보여줄 수 있습니다. 단일 뉴클레오솜보다 뉴클레오솜 어레이가 갖는 주요 장점은 뉴클레오솜들이 링커 DNA로 연결되어 추가적인 구조적 제약을 가한다는 점입니다.이 방법은 염색질 구조에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 염색질 템플릿 상의 인비트로(in vitro) 전사 연구와 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 이제 Ryan과 Anna가 뉴클레오좀 위치 지정 DNA 내의 재조합 핵심 히스톤으로부터 뉴클레오좀 어레이를 조립하는 과정을 시연하겠습니다. 정제된 동결 건조 재조합 핵심 히스톤 단백질 H2A, H2B, H3, H4를 준비합니다. 각 단백질 약 5 mg을 3 mL의 언폴딩 버퍼(unfolding buffer)에 녹이고, 실온에서 교반하며 최소 1시간 동안 인큐베이션합니다.이제 언폴딩 버퍼를 대조군으로 사용하여 각 히스톤 용액의 276 nanometers에서의 흡광도를 측정하십시오. 그런 다음 각 히스톤의 소쇠 계수를 이용하여 몰 농도를 계산하십시오. 흡광도로 결정된 히스톤 농도를 동결 건조된 건조 중량과 비교하여 단백질의 대부분이 용해되었는지 추정하십시오.가장 적은 몰수를 포함하는 히스톤 샘플을 확인하십시오. 이 샘플이 모든 히스톤의 제한 몰수가 됩니다. 그런 다음 히스톤들을 동일한 몰량으로 혼합하십시오. 히스톤 혼합물을 언폴딩 버퍼(unfolding buffer)로 희석하여 최종 농도를 1 mg/mL로 맞추십시오.이제 샘플을 투석 튜브로 옮깁니다. 튜브를 밀봉하고 2 L의 차가운 리폴딩 버퍼에 넣습니다. 교반하며 4 °C에서 18시간 동안 샘플을 투석합니다.석출물이 생기는 것을 방지하기 위해 투석 튜브가 자유롭고 활발하게 회전할 수 있도록 하십시오. 6시간마다 투석 완충액을 교체하십시오. 침전물이 형성되더라도 샘플을 버리지 마십시오. 수율은 감소하겠으나 일부 octi를 회수할 수 있습니다. 공기 방울이 시스템 내부로 들어가지 않도록 주의하며 S 200 컬럼을 FPLC 시스템에 연결하십시오.S 200 컬럼을 0.3 mL/min의 유속과 0.5 MPa의 배압 제한 조건에서 0.2 µm 필터링된 물로 하룻밤 동안 세척하십시오. 그다음 0.2 µm 필터링된 리폴딩 버퍼 1 L를 사용하여 시스템을 약 2시간 동안 평형화하십시오. 또한 원심 분축 농축기를 리폴딩 버퍼 1 mL로 평형화하십시오. 이제 투석 튜브에서 샘플을 꺼내십시오.침전물을 제거하기 위해 샘플을 4 °C에서 원심분리합니다. 샘플 상층액을 농축기로 피펫팅합니다. 샘플을 약 500 µL 부피로 농축합니다.농축된 Optimus 샘플을 새 용기로 옮깁니다. 농축기를 Refolding buffer 1 mL로 헹굽니다. 세척액을 500 µL까지 농축하여 ER 샘플에 첨가합니다.1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 담긴 시료를 4 °C에서 10,000 RPM으로 5분 동안 원심 분리하십시오. 상층액을 새 튜브로 옮깁니다. 이제 S 200 컬럼에 시료를 로딩하십시오.새로 제조한 리폴딩 버퍼 400 milliliters로 샘플을 용리시키고 2 milliliter씩 분획하여 수집합니다. 용리 과정 동안 280 nanometers에서의 흡광도를 모니터링합니다. His stone 응집체는 보통 45 milliliters EMR, 약 65 milliliters 및 timer에서 용리됩니다.약 84 mL 부근에서 확인합니다. 관심 피크의 용출 분획을 18~20% SDS page로 분석하여 샘플을 실행합니다. 정제된 emu가 포함된 분획은 4가지 핵심 히스톤 단백질이 동일한 몰수로 포함되어 있어야 합니다.이제 정제된 OCR이 포함된 분획들을 모으고, 원심분리 필터로 농축하여 최종 octr 농도를 결정합니다. 280nm에서 흡광도를 측정하십시오. 그런 다음 소쇠 계수를 사용하여 농도를 계산합니다.프로토콜 본문에 상세히 설명된 대로 DNA와 정제된 ERs를 이용하여 뉴클레오솜 어레이를 재구성합니다. 그런 다음 260 nm에서 흡광도가 0.5가 되도록 시료를 희석합니다. 2섹터 센터피스가 있는 셀의 한쪽에는 시료를, 다른 쪽에는 레퍼런스 10 완충액을 넣고 시료 400 µL를 로딩합니다.두 구역의 액체 수준은 거의 동일해야 합니다. 기준 시료의 메니스커스를 검체 시료의 메니스커스보다 높게 유지하십시오. 셀을 로터에 장착하고 셀의 정렬 상태를 적절하게 맞추십시오.로터에 장착된 셀 바닥면의 해시 마크를 이용하여, 압축 공기로 셀의 렌즈 부분을 가볍게 먼지 제거하십시오. X-L-A-X-L-I 원심분리기를 켭니다. 매뉴얼에 설명된 대로 로터를 삽입하고 광학 장치를 부착하여 고정하십시오.proteome lab 소프트웨어를 실행하고 새 파일을 선택하십시오. 25 °C 온도에서 3000 RPM으로 단일 스캔 실행을 설정하십시오. 각 셀에 대해 샘플 이름을 지정하고, 파장을 선택하고, 흡광도를 선택한 다음 컴퓨터에 파일 저장 위치를 지정하십시오.옵션에서 중지를 선택하십시오. 마지막 스캔 후 방사형 보정(radial calibration)을 실행한 다음, 단일 스캔 실행을 시작하십시오. 단일 스캔을 사용하여 적절한 방사형 스캔 길이를 결정하십시오.X-L-A-X-L-I 제어 패널을 사용합니다. 속도를 0으로 입력하고 start를 눌러 챔버를 평형 상태로 만듭니다. 소프트웨어를 사용하여 원하는 속도와 스캔 횟수를 설정합니다.원심분리 속도가 높을수록 침강 계수의 해상도가 증가합니다. 하지만 전체 시료가 셀 바닥으로 침강하기 전까지 최소 20회의 스캔을 수행해야 합니다. 적절한 작동 여부를 확인하기 위해 초기 몇 번의 스캔 결과를 모니터링하십시오.런의 진행 상황을 모니터링하고 셀 누출과 같은 잠재적인 문제를 확인하기 위해 마지막 몇 차례의 스캔을 중첩합니다. 침강 속도 결과 분석과 원자 힘 현미경을 이용한 어레이 시각화 프로토콜은 프로토콜 본문에 자세히 설명되어 있습니다. 본 실험에서.동결 건조된 xenopus 코어 히스톤을 S 200 컬럼에서 FPLC로 정제한 옥타머(octamer) 내로 재구성하였습니다. 비특이적 히스톤 응집물 용액이 먼저 용출되었고, 이어서 히스톤 옥타머, H3, H4 테트라머(tetramer) 및 H2A-H2B 다이머(dimer)가 용출되었습니다. 정제된 옥타머 분획을 SDS-PAGE로 분석한 결과, 네 가지 히스톤 단백질이 동일 몰량으로 존재함을 확인하였습니다. xip H2A와 H2B는 분자량 차이가 약 200 daltons에 불과하여 SDS 젤 상에서 종종 하나의 밴드로 나타날 수 있음에 유의하십시오.분획 64에서 67까지를 모아 뉴클레오솜 배열 재구성을 위해 보관했습니다. 3000 RPM에서 수집한 단일 스캔의 Proteome Lab 소프트웨어 스크린 캡처를 사용하여 UC 셀 스캔의 측정 범위를 설정했습니다. 그런 다음 일련의 침강 속도 스캔을 편집하여 데이터 세트를 생성하며, 빨간색과 녹색 선은 침강 계수 분포를 확인하는 두 가지 서로 다른 방법을 나타냅니다.UltraScan에서 빨간색 선은 침강 계수의 적분 분포를 나타내며, 녹색 선은 염색질 구조 연구에서의 미분 분포를 나타냅니다. in vitro 원자간력 현미경은 분석 초원심분리와 상호 보완하여 재구성 후 템플릿 포화도를 결정합니다.여기서 이미징에 사용된 27개 SRA의 대부분은 10~11개의 뉴클레오솜을 포함하고 있었습니다. 이 500 by 500 nanometer 스캔은 링커 DNA가 포함된 뉴클레오솜 배열을 명확하게 보여줍니다. 또한 진폭 트레이스, 위상 트레이스, 그리고 뉴클레오솜의 높이 프로파일을 결정하기 위해 뉴클레오솜을 가로질러 자유 곡선(free hand line)을 그린 동일한 높이 트레이스가 표시되어 있습니다. 이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 3~4일 안에 완료할 수 있습니다.이 절차를 수행할 때, 시약의 농도를 매우 정밀하게 측정하는 것이 매우 중요합니다. 이 절차 이후에는 원자간력 현미경과 같은 기술을 사용하여 뉴클레오좀 어레이의 포화 수준을 테스트할 수 있습니다. 이 기술의 개발은 염색질 분야의 연구자들이 염색질 구조와 염색질 응축을 연구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

assembly-nucleosomal-arrays-from-recombinant-core-histones-nucleosome

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오에서는 뉴클레오솜 복합체의 역학을 연구하기 위한 고속 저속 원자력 현미경, AFM, 이미징 기술을 시연합니다. AFM 팁은 뉴클레오솜 표면을 스캔하면서 뉴클레오솜 높이의 변화를 감지하고 시간이 지남에 따라 DNA가 풀리는 것을 기록합니다.

뉴클레오솜 역학을 포착하기 위한 고속 타임랩스 원자력 현미경

이 프로토콜은 차등 동위 원소 표지 자매 히스톤를 포함하는 뉴 클레오의 재구성에 대해 설명합니다. 동시에, 비대칭 번역 후 개질은 뉴 클레오 히스톤 premodified 복사를 사용한 후 발생 될 수있다. 이러한 제제는 즉시 고해상도 NMR 분광법을 이용하여 두 자매 히스톤 동시에, 수정 누화 메커니즘을 연구하는데 사용될 수있다.

된 유의 동위 원소 표지 자매 히스톤과 뉴 클레오의 재구성

여기, 우리는 프로토콜 nucleosome 정적 및 시간 경과 원자 힘 현미경 (AFM) 이미징 기술을 사용 하 여 단일 분자 수준에서 입자의 특성을 제시. 설명 된 표면 기능화 방법 구조의 캡처 및에 nucleosomes의 역학에 대 한 수는 nanoscale에 고해상도.

구조와 원자 힘 현미경 이미징 사용 하 여 Nucleosomes의 역학 조사

여기서 우리는 유전 코드 확장을 사용하여 아세틸화 히스톤 단백질을 발현하고 체외에서 재구성된 뉴클레오좀을 조립하는 방법을 제시한다.

에체리치아 대장균의 유전코드 확장을 이용한 뉴클레오소성 재구성을 위한 히스톤의 특정 리신 아세틸화

이 프로토콜은 TEM 그리드 동결을 위한 두 가지 샘플 준비 방법을 사용하여 뉴클레오솜 복합체의 준비를 자세히 설명합니다.

초저온 전자 현미경 구조 결정을 위한 DNA 복구 인자와 복합체화된 뉴클레오솜 코어 입자의 준비

이 기사에서는 단일 분자 상관력 및 형광 현미경을 위해 뉴클레오솜 함유 DNA 테더를 재구성하는 자세한 실험 절차를 제시합니다. 또한 염색질 상호 작용 단백질의 결합 거동을 시각화하고 뉴클레오솜의 물리적 특성 변화를 분석하기 위해 수행할 수 있는 여러 다운스트림 실험에 대해 설명합니다.

In Situ Nucleosome Assembly for Single-Molecule Correlative Force and Fluorescence Microscopy

자기 눈썹 만든 전문 해부 도구 -이 비디오는 눈썹 나이프의 사용을 포함하여 Xenopus laevis의 배아에서 주최 및 동물 극 explants의 준비에 사용되는 기술을 설명합니다. 유착 분석을 조립을위한 프로토콜은 또한 주요 유착 분자의 존재에 대한 프로브가 표면 주최자 또는 적절한 개발을위한 중요 동물 극 세포에 존재하는, 주어진 것입니다.

주최자 및 동물 폴 Explants Xenopus laevis의 태아로부터 세포 접착 분석의 총회의 해부

마우스 뒷면에서 게놈 DNA의 분리

우리는 미래의 핵산 기반 치료제를위한 균일한 및 사용자 정의 polyplexes보다 제어하고 합성을 제공하는 것으로 예상된다 고분자 전해질의 polyplexes의 형성을 조사하기 위해 nanophotonics (QD - 걱정)와 microfluidics의 소설과 강력한 통합을 제시한다.

결합 QD - 걱정과 Microfluidics 실시간으로 DNA의 Nanocomplex 자체 어셈블리를 모니터하기 위해

분석 초원 심 분리기 (AUC)은 샘플 셀이 샘플과 참조 버퍼와 실험을하는 동안을 보유하고 있으며 고진공 및 60,000 RPM으로 로터 속도 최대 노출됩니다. 이 동영상은 AUC 실험이 매우 중요한 구성 요소의 조립, 로딩 및 정렬에 필요한 세부 사항에 대한 엄격한 관심을 입증합니다.

조립, 로딩 및 분석 초원 심 분리기 샘플 셀 정렬

배우세요 재조합 핵심 히스톤과 뉴클레오솜 위치 DNA를 이용한 뉴클레오솜 배열 조립 방법을. 침전 속도 실험과 원자력 현미경으로 포화도를 평가하여 염색질 구조와 기능을 연구합니다.

재조합 핵심 히스톤에서 뉴 클레오 배열과 뉴 클레오 솜 위치 DNA의 조립

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