일반적인 액체 취급 로봇에 TruTip 기술을 사용하여 임상 샘플에서 DNA와 RNA의 높은 처리량, 자동 추출

다음 실험의 전체적인 목표는 Hamilton Star 액체 핸들링 워크스테이션과 True Tip 추출 기술을 사용하여 전혈에서 인간 게놈 DNA를 분리하는 것입니다. 이를 위해 혈액 샘플 용해 버퍼, proteinase K 및 에탄올로 구성된 용액 내에서 세포를 용해시키며, True Tip을 통해 여러 번 흡입 및 분주하여 DNA를 True Tip 매트릭스에 결합시킵니다. 다음으로, 결합된 핵산으로부터 잔류 단백질, 용해 버퍼 및 기타 오염 물질을 제거하기 위해 두 가지 서로 다른 세척 버퍼를 True Tip에 흘려보냅니다.

세 번째 단계에서는 공기를 여러 번 흡입하고 분사하여 트루 팁(true tip)의 결합 매트릭스를 건조함으로써 마지막 단계의 잔류 세척 버퍼를 증발시키고, 이후 환원 버퍼(illusion buffer)를 결합 매트릭스에 왕복으로 흘려 매트릭스로부터 DNA를 용출합니다. 트루 팁 기술을 사용하여 오염 물질이 없는 고분자량의 게놈 DNA(Genomic DNA)를 추출할 수 있으며, 이는 UV-Vis 흡광도 측정, 겔 전기영동 및 정량적 PCR 또는 시퀀싱을 통해 확인할 수 있습니다. 스핀 컬럼이나 자기 입자를 기반으로 하는 다른 시료 준비 방법과 비교했을 때 트루 팁의 장점은 자동화가 용이하다는 점입니다.

이 방법은 원심분리기나 마그네틱 로드가 포함된 고가의 시스템을 필요로 하지 않으며, 단순한 워크플로우 덕분에 소중한 데크 공간을 절약할 수 있습니다. 오늘은 전혈에 집중하겠지만, Tru Tip은 다른 게놈 DNA 샘플 응용 분야뿐만 아니라 임상 스왑 샘플의 바이러스 RNA 또는 혈장 내 무세포 DNA 분리와 같은 다양한 용도로 적용될 수 있습니다. 절차 시연은 Hamilton 액체 핸들링 워크스테이션에서 Truet tip 추출 프로시저 개발에 핵심적인 역할을 한 저희 실험실의 자동화 엔지니어 Dane Brady가 진행하겠습니다.

본 프로토콜에서는 Hamilton Star 액체 핸들링 로봇을 사용하여 96개 웰의 전혈에서 DNA를 동시에 추출합니다. Hamilton Star의 덱에는 선택 사항인 히터 셰이커 유닛이 장착되어 있으며, 이는 전혈과 같은 특정 임상 매트릭스의 효소 분해에 필수적입니다. 시스템에 96채널 피펫 헤드를 장착할 수 있으므로, 각 팁 단계와 시약마다 전용 96웰 플레이트가 사용됩니다.

먼저 Hamilton Star 로봇의 관련 장비와 컴퓨터의 전원을 켭니다. 소프트웨어에서 Hamilton Run Control 소프트웨어를 실행합니다. 96개 샘플용으로 ACON에서 제공한 런 파일을 엽니다.

이제 다이어그램에 따라 스타 덱 레이아웃을 설정하십시오. 1번으로 표시된 모든 위치에 1 mL 필터 팁을 배치하고, 2번 위치에는 필터가 없는 1 mL 팁을 배치하십시오. 3번 위치에는 Conni Hamilton 1 mL LPT 2 mm true tip을 배치하십시오. 계속해서 차트를 참조하여 5번부터 12번까지의 나머지 위치를 필요한 실험 기구로 채우되, 아직 샘플을 로딩하지 마십시오.

이제 용해 및 결합 버퍼 F 75 milliliters의 시약을 분주하십시오. 이는 트러프 5번 위치에 로딩해야 합니다. 또는, 설정을 효율화하고 데크 배치를 단순화하기 위해 버퍼가 미리 채워진 플레이트를 사용할 수도 있습니다.

이에 따라 로봇 로딩을 계속합니다. 마지막으로, 혈액 튜브의 캡을 제거하고 샘플 캐리어 랙 또는 데크 4번 위치에 배치합니다. 샘플 1을 가장 왼쪽 캐리어의 뒤쪽에 배치하고, 각 캐리어를 따라 순차적으로 이동하여 샘플 96이 앞쪽 오른쪽 위치에 오도록 합니다.

모든 샘플을 로딩한 후, 실온에서 평형을 이루도록 둡니다. 프로토콜이 완전히 자동화되어 있으므로, 조작자 오류가 발생할 가능성이 거의 없습니다. 샘플을 랙의 올바른 순서대로 배치해야 하지만, 정확한 샘플 추적을 위해 바코드 시스템을 적용할 수 있습니다.

자동 스크립트를 시작하려면 실행 파일 창의 왼쪽 상단에 있는 재생 버튼을 선택하고 처리할 샘플 수를 입력하십시오. 스크립트가 실행하는 첫 번째 단계는 heater shaker 모듈의 14번 위치에 있는 배양 플레이트로 proteinase K 80 µL를 옮기는 것입니다. 그다음, 스크립트는 8채널 암을 사용하여 배양 플레이트의 각 샘플 웰에 샘플 200 µL를 분주합니다.

그 다음, 96채널 암을 사용하여 배양 플레이트의 각 웰에 600 µL의 lysis buffer F를 분주합니다. 이후 스크립트에 따라 용액을 10회 사이클로 혼합하고, 딥웰 플레이트에서 70 °C, 500 RPM으로 20분 동안 배양합니다. 온도는 proteinase K 활성 범위 내인 60 °C로 설정됩니다. 샘플이 배양되는 동안, 액체 핸들링 시스템은 벌크 시약 트로프에서 해당 96웰 플레이트로 추출 및 용출 시약을 분주하며 계속 작동하며, 딥웰 플레이트의 각 웰에 100 µL의 Elucian buffer A를 추가합니다.

13번 위치에서, 딥웰 플레이트의 각 웰에 800 µL의 에탄올을 분주합니다. 10번 위치에서, 12번 위치의 딥웰 플레이트 각 웰에 1.6 mL의 세척 버퍼 K를 추가하고, 11번 위치의 딥웰 플레이트 각 웰에 1.6 mL의 세척 버퍼 J를 추가합니다. 20분간의 배양 후, 배양 플레이트의 시료 혼합물을 10번 위치에 있는 에탄올 함유 딥웰 플레이트로 옮기고, 12회의 피펫팅 사이클을 통해 혼합합니다.

전 과정 동안 시약 팁은 필요에 따라 폐기함으로 배출됩니다. 프로그램은 데크 3번 위치에서 96개의 트루 팁(true tip)을 먼저 로드함으로써 용해 과정에서 DNA 추출 단계로 이어집니다. 다음 단계는 10회 사이클에 걸쳐 10번 위치의 샘플을 흡입 및 분주하여 핵산을 트루 팁 모놀리스에 결합시키는 것입니다.

다음으로, 트루 팁(true tips)이 11번 위치로 이동하며, 여기서 세척 버퍼 J를 모놀리스 위로 5회 순환시켜 잔류 용해물, 버퍼 및 샘플 매트릭스를 제거합니다. 그 후, 트루 팁이 12번 위치로 이동하며, 세척 버퍼 K를 5회 순환시켜 결합된 핵산으로부터 단백질 및 기타 오염 물질을 제거합니다. 마지막으로, 트루 팁이 세척 플레이트 상단에서 고속으로 80회 순환하여 공기 건조됩니다.

이제 팁이 13번 위치로 이동하며, 용출 버퍼가 두 사이클에 걸쳐 다섯 번 통과하면서 DNA를 딥웰 플레이트로 방출합니다. 이후 팁은 폐기물 함으로 배출됩니다. 이제 프로그램이 종료되었습니다.

기기에서 용리 플레이트를 제거하고, 추출된 샘플을 보관 또는 후속 응용 단계에 적합한 튜브로 옮깁니다. 또한, 프로그램 설정을 사용자 지정하여 단 한 시간 만에 최종 샘플을 원하는 튜브나 플레이트로 자동 이송할 수 있습니다. 자동화 시스템은 로봇을 사용하여 96개의 혈액 샘플에서 genomic DNA를 추출했습니다.

45개의 양성 혈액 샘플의 흡광도 프로파일을 45개의 시약 블랭크와 함께 동시에 처리하였습니다. 260nm 대비 280nm의 평균 흡광도 비율은 1.96이었으며, 260nm 대비 230nm의 평균 비율은 1.93으로, 이는 1% 아가로스 겔 상의 샘플들이 순수함을 시사합니다. 무작위 샘플들은 전단 현상이 최소화된 상태에서 높은 분자량으로 실행되었습니다.

평균 수율은 전혈 200 µL당 약 5 µg의 DNA였습니다. 자동화된 True Tip 프로토콜을 최적화할 때, 웰 간의 교차 오염이 발생하지 않도록 특별한 주의를 기울입니다. 실시간 PCR 결과, 여기에서 보는 바와 같이 양성과 음성 간의 명확한 구분이 나타납니다.

RNA 추출의 경우, 최소한의 수작업 시간만으로 96개 샘플 전체의 추출을 1시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면, Hamilton Star Liquid Handling Workstation의 TRU Technology Automated를 사용하여 전혈에서 인간 게놈 DNA를 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.