Name: C.의 생체 Neuronal 칼슘 이미징에서 elegans (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: 학습하세요 C. elegans 단일 뉴런의 칼슘 역학 측정을 위한 유전자 인코딩 형광 지표법. 이 기술은 생체 내 뉴런 활성 및 세포 손상 반응을 실시간으로 분석하여 신경생물학 연구에 활용됩니다.

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몇몇 사람들은이 문서에 설명 된 작업에 기여 하였다. CVG는 실험 설정을 구축하고, LS, SHC, 그리고 CVG는 실험을 수행했습니다. CVG와 SHC는 원고를 썼다. 모든 저자는 이후 개정 과정에 참여했고 원고의 최종 사본을 승인했습니다. 우리는 GCaMP 변형에 대한 폴 Sternberg 감사드립니다. 이 작품에 사용 된 일부 선충류의 긴장은 연구 자원에 대한 NIH 국립 센터 (NCRR)의 지원을 받고 있습니다 Caenorhabditis 유전학 센터 (CGC)에 의해 제공되었다. MATLAB 이미지 분석 프로그램은 18에서 사용되는에서 적응되었습니다. 저자는 보스턴 대학과 매사추세츠 생명 과학 센터에서 지원했다.

1. 광 설치 <ol><li> epifluorescence 이미징 기능으로 표준 복합 현미경을 사용합니다. 우리는 Intensilight HG의 조명기와 니콘 이클립스 티-U 역 현미경을 사용합니다. </li><li> 최고의 이미지 및 신호 품질에 대해 높은 배율, 높은 수치 조리개 목표를 사용합니다. 우리는 일반적으로 니콘 X60 1.4 NA 오일 침적 목표를 사용합니다. 어떤 경우에는 그것은 형광 및 신호 강도의 표현 수준에 따라 (X40, X20) 낮은 배율을 사용할 수 있습니다. </li><li> 이러한 이미지 감도를 극대화하고 배경 소음을 최소화 할 수있는 ANDOR 클라라 카메라로 CCD 카메라를 냉각 높은 감도를 사용합니다. </li><li> 단일 색상 fluorophores은 형광의 특정 파장을위한 설정 표준 현미경 형광 필터를 사용하십시오. GCaMP 사용에 대한 표준 GFP 필터는 525 나노 미터에서 488 나노 미터와 배출에 여기에 최적화 된 설정합니다. 더 이상 광학 수정이 필요하지 않습니다. </li><li&gt; 등 cameleon 등 ratiometric fluorophores, 들어, 동일한 이미지가 동시에 두 개의 서로 다른 파장에서 캡처 할 수 있도록 이중 이미징 시스템을 사용합니다. 이것은 카메라에 듀얼 이미지 나란히을 투영하여 수행됩니다. 광 등급 브레드 보드에 기본 광학 구성 요소를 사용하여이 작업을 수행하는 간단한 설정은 그림 1에 도시된다. 그것은으로 구성되어 있습니다 : <ol class="ualpha"><li> 440 ± 20 나노 미터 여기 필터와 455 nm의로 설정 현미경 필터는 긴 이색 성 거울을 전달합니다. </li><li> 즉시 현미경 이미징 포트 (카메라 CCD 센서는 일반적으로 앉아있는 곳) 이외의 초기 이미지 평면에 배치 이미지 마스크. 이 기능은 카메라 센서의 절반 만이 채울 수 있도록 시야를 제한합니다. 두 이미지를 나란히 예상되고 날카로운 이미지 테두리의 첫 번째 이미지 평면 결과와 겹치는에이 마스크를 배치. </li><li> 첫 번째 릴레이 렌즈는 멀리 t에서 하나 초점 거리를 설정그는이 빛을 collimates 있도록 초기 이미지 평면. </li><li> (&lt;515 nm 정도, 시안) 다른 전송하면서 한 가지 색상을 (&gt; 515 nm 정도, 노란색) 반사 두 개의 이미지 파장 또는 채널로 빛을 분할 이색 성 거울. </li><li> 추가로 특정 이미지 파장 (485의 시안 ± 535 40 나노 미터 및 노란색 ± 30 nm 정도)로 전송 빛을 제한 방출 필터 (밴드 패스 필터), </li><li> 이 CCD 카메라에서 두 번째 이미지 평면에 빛을 refocuses 있도록 빔 경로에 배치 번째 릴레이 렌즈 (각 채널에 대해 하나). </li><li> 거울과 두 번째 이색 성 거울의 한 쌍은 두 이미지가 재결합하는 등의 빔 경로를 지휘하고 카메라 CCD 센서에 나란히을 예상하고 있습니다. 그림 4A는 결과 이미지의 예를 보여줍니다. </li></ol></li><li> 초기 광학 정렬 : 고 대비 imag과 광학의 설정 및 정렬을 시작낮은 배율 렌즈와 전송 폭 넓은 분야 조명 조명을 (현미경 슬라이드에 그려진 검은 sharpie이 잘 작동)를 사용하여 전자. 현미경 oculars을 통해 집중 이미지를 가져와 후 사용할 현미경 포트로 전환. 높은 빛 조명은 초기 초점 평면 (현미경 포트 이외의 몇 cm)에 색인 카드에 이미지를 볼 수 있습니다. 빔 경로의 첫 번째 릴레이 렌즈 (C)를 ​​놓고는 초기 초점 비행기에서 한 초점 거리이며, 빔 경로 (예 : 직접 빔 경로에 중심) 편향되지 않고 빛을 collimates 있도록. 보기의 절반 필드를 제한하고 이미지에서 날카로운 보더를 생성 조정 첫 번째 초점 평면에서 마스크를 놓습니다. 그림 1b와 같이 빔 경로가 테이블 표면에 평행하게 유지하고 두 개의 평행 한 경로를 나란히에서 실행되도록 거울과 필터 (D, E, G)를 배치합니다. 센터 두 번째 릴레이 각각의 빔 경로의 렌즈 (F)와카메라 CCD 센서가 될 것입니다이었다 배치 색인 카드에 초점에 이미지를 가져 길을 따라 앞뒤로으로 이동합니다. 올바르게 수행되면 두 이미지는 현미경 oculars 및 기타 카메라 포트 parfocal해야합니다. 마지막 위치에 카메라를 배치하고 정렬을 조정. </li><li> 미세 조정 광학 정렬 : 미세 조정 광학 정렬에 CCD 카메라가 본 이중 이미지를 사용합니다. 고 대비 이미지를 사용하여 최종 정렬 높은 배율로 전환, 낮은 배율로 시작합니다. 반사 이미지 (그림 1B에 노란색 채널)의 필드의 나머지 절반을 충당하기 위해 X와 Y. 위치에서 카메라를 이동하여 뷰의 카메라의 필드의 반을 충당하기 위해 전송 이미지 (그림 1B에서 시안 채널) 위치 의 빔 경로에있는 마지막 두 거울 (G)를 조정하여 볼 수 있습니다. 빔 경로를 따라 앞뒤로 각 채널에 대해 두 번째 릴레이 렌즈를 이동하여 초점을 최적화합니다. 왼쪽 경우그대로 광 설치가 안정적 만 희귀 한 미세 조정 조정을 필요로한다. </li></ol> 2. 샘플 준비 및 데이터 수집. <ol><li> Caenorhabditis 유전학 센터 (CGC) 또는 기타 소스에서 관심의 신경 세포에서 칼슘 민감한 형광을 표현 동물을 취득. 또는 유전자 변형 동물은 표준 C.를 사용하여 구성 할 수 있습니다 elegans 기술. 단세포 표현은 (때로는 바람직하지 여러 뉴런이 조사 할 경우, 12 참조) 이미지와 여러 셀에서 측정 쉽게 분리 될 수있는만큼 필요하지 않습니다. 형광의 transgene이 게놈에 통합되지 않은 경우, 표현의 중요한 변화가 동물에서 동물로 발생할 수 있습니다. 이 경우, 형광 해부 현미경을 사용하여 높은 표현 수준 동물을 preselecting하면 신호 대 잡음 비율을 증가하고 측정을 향상시킵니다. 형광 표현 수준 옛 성은쉽게 실험에 필요한 인수 매개 변수 아래 카메라로 이미징 할 충분한 될 D. </li><li> 실험실 테이프 두 조각으로 간격을두고 두개의 유리 슬라이드 사이의 용융 아가로 오스의 작은 방울을 눌러 원하는 고정 기술 (아래 2.3 참조)에 필요한 아가로 오스 패드를 확인합니다. 필요한 경우, 아가로 오스 패드는 동물을 장착하기 전에 유리 커버 슬립으로 이전 할 수 있습니다. 그림 2를 참조하십시오. </li><li> C.를 고정 다음 방법 중 하나를 사용하여 이미지에 대한 elegans : <ol class="ualpha"><li> 약리 Paralyzation : 2퍼센트 아가로 오스 패드 (2.2에 패드를하기 전에 용융 아가로 오스로 혼합)에 0.05 % Levamisole을 추가합니다. 패드에 5-10 동물을 선택하고 커버 슬립을 다룹니다. 그 위치에 개최 커버 슬립의 모서리에 왁스 혼합물의 소량 (50 % 파라핀 왁스 50 % 석유 젤리)를 적용합니다. B에 효과 동물을 위해 Levamisole 5-10 분 허용아직 완전히 ecome. </li><li> 스티프 아가로 오스의 고정 : C. elegans는 물리적으로 굳어 10% 아가로 오스 패드와 0.05 μm의 직경 폴리스티렌 나노 입자를 사용하여 고정 할 수 있습니다. 2.2을 10 %로 아가로 오스 패드 (중량 NGM 버퍼에서 10 % 아가로 오스)합니다. 패드의 상단에 구슬 솔루션 ~ 3 μl (볼륨의 NGM에 1시 10분 폴리스티렌 마이크로)를 추가합니다. 신속 5-10 C.을 선택 패드에 구슬 솔루션의 수영장에 부드럽게 elegans는 커버 슬립을 다룹니다. 그 위치에 개최 커버 슬립의 모서리에 적용 용융 왁스를 사용합니다. (이 기법에 대한 자세한 내용은뿐만 아니라 이전 주피터 제 8 조 등 7 참조) </li><li> 접착 : C. elegans는 동물의 한면에 적용 수의학 학년 접착제의 소량을 사용하는 곳에서 접착 할 수 있습니다. </li><li> 마이크로 유체 장치는 : 많은 마이크로 유체 장치는 물리적 C.를 개최하도록 설계되었습니다 이미징을위한 장소에 elegans. </li></ol> &lt;/ 리&gt; <li> 현미경에 준비된 슬라이드를 삽입하고 원하는 신경 세포에 초점을 맞 춥니 다. 그것은 C.을 찾기 위해 종종 가장 쉬운 것입니다 시야 조명과 낮은 배율을 사용 elegans. 그런 다음 높은 배율과 찾아 특정 신경 세포에 초점을 형광 이미지로 전환. </li><li> 자극 : 특정 자극에 대한 neuronal 응답 (조명, 전기 분야, gustatory 및 후각 신호, 온도 등) 필요하다면, 자극 장치는이에 동물에 투여 될 수있다하는 현미경 설치로 설계되어야 이미징 동안 샘플 준비. </li><li> 현미경 CCD 카메라를 사용하여 이미지를 획득. 노출 시간과 여기 광 수준은 concordantly 적은 시간 해상도로 더 이상 노출 시간을 필요로하는 약한 신호, 기준 신호와 형광의 표현 수준에 따라 달라집니다. 우리는 일반적으로 ~ 300 밀리 초 노출 시간을 사용합니다. </li><li> 개별적으로 또는 TI 등의 이미지를 취득영화 나 저속 촬영. 때문에 C. elegans의 뉴런은 일반적으로 속도가 느린 활성화 역학 (즉, 그들은 나트륨 기반의 액션 잠재력을 결여)을 표시 ~ 1 초에 느린 프레임 속도는 종종 신경 세포 역학을 측정하기에 충분합니다. 취득 가격까지 ~이이 약한 형광에 필요한 통합 시간에 의해 제한 될 수 있지만 초당 90 프레임이 사용되었습니다. 고정 준비가 안정적이고 프레임 속도 느린 경우 하나의 뉴런의 개인 영화는 쉽게 몇 분 (~ 5-10 분) 이상 확장 할 수 있습니다. </li></ol> 3. 데이터 분석 <ol><li> ImageJ와 NIS 요소를 포함한 역동적이고 ratiometric 분석 기능을 볼 수있는 다양한 형광 이미징 소프트웨어 패키지의 다수가 있습니다. 우리는 관심 선택한 지역에 걸쳐 평균 형광 신호를 측정 할 수있는 간단한 사용자 정의 MATLAB 프로그램을 사용합니다. </li><li> 개별 이미지 (또는 유지 시간 경과 영화에 대한완벽 계속) 이미징 뉴런과 배경 측정을위한 별도의 인근 지역 내 관심 (ROI)의 지역을 선택합니다. 듀얼 이미지의 각 유사한 투자 수익 (ROI)과 배경 영역을 선택 ratiometric 이미지를하십시오. </li><li> 시간 경과 영화 내 이미징 뉴런의 완만 한 움직임이 자동으로 다양한 객체 추적 방식을 사용하여 수행 할 수 있습니다 각 프레임에서 투자 수익 (ROI)을 선택하기 위해 추가 분석이 필요합니다. 우리 프로그램은 거친 경계가 (모든 프레임에 관심 객체를 포함한)을 수동으로 선택하고 독립적 인 배경 영역이 선택되어있는 영화의 모든 이미지의 압축 이미지를 표시합니다. 첫 번째 프레임의 경우 투자 수익 (ROI)를 수동 경계 지역 내에서 선택됩니다. 이후의 각 프레임에 대한, 프로그램은 올바른 크기 (즉, 수동 첫 번째 프레임의 투자 수익 (ROI)과 같은 픽셀의 같은 수의)의 투자 수익 (ROI)을 생성하기 위해 경계 지역 내에서 가장 밝은 픽셀을 선택합니다. 이미지 위치 objec관심 t이 프로토콜은 각 프레임에 대한 합리적인 투자 수익 (ROI)을 선택 경계 지역 내에서 주변 배경을 한 후 충분히 밝아 있습니다. </li><li> 각 프레임에 대한 형광 신호, F는, 투자 수익 (ROI)의 평균 픽셀 강도 마이너스 배경 지역의 평균 강도로 계산됩니다. Ratiometric 값은 -0.65 / 두 신호의 비율 (YFP - YFP 배경) (CFP-CFP 배경)로 계산됩니다. 0.65의 요인은 fluorophores에 의존뿐만 아니라 (이 값은 일반적으로 cameleon 설정을위한 ~ 0​​.6입니다) 사용 된 특정 필터 설정됩니다 YFP 채널에 CFP 채널의를 통해 출혈에 대한 보상. </li><li> , ΔF / F = (F (t)-F O) / F O : 각 프레임에 대한 상대적인 칼슘 수준은 첫 번째 프레임 (또는 프레임 시리즈)에서 측정 초기 기본 값으로 정규화 된 강도의 변경 률로 계산됩니다 F (t)는 시간 t와 F O에서 형광입니다초기 기본 값입니다. </li><li> 전지 본체를 선택 투자 수익 (ROI)이 가장 강한 가장 강력한 신호를 생성하지만 신경 프로세스를 따라 투자 수익 (ROI)에서 신호를 선택하고 측정 할 수도 있습니다. </li></ol> 4. 문제 해결 <ol><li> 표백 : 여기 빛에 노출 형광의 표백 및 노출 수준에 따라 달라집니다 신호의 꾸준한 감소로 표시되어 발생할 수 있습니다. Ratiometric 측정이 보상하는 데 도움이됩니다. 한 파장의 표백 그러나 선택적는 여전히 (빨리 다음 일반적으로 CFP 표백제 YFP) 발생할 수 있습니다. 표백 노출 시간 및 / 또는 여기 강도를 (조명 경로의 중간 밀도 필터) 감소하여 빛 노출 수준을 감소 발생합니다. 필요한 경우, 하나는 모의 실험을 실행 (같은 여기에 노출되어 있지만 neuronal 자극)과 신호 붕괴의 일정한 시간을 정량화하여 표백 보상 할 수 있습니다. </li><li><strong&gt; 고정 : 간단한 이미지 분석을 위해는 동물이 녹음 기간 동안 상대적으로 남아 중요합니다 여기에 설명 된 C.이 있습니다. elegans는 녹화시 이동이를 가능성이 가장 높은 만들기, 빛 노출과 실험 자극에 반응. 축삭 과정에서 측정 특히 완만 한 움직임 측정에 상당한 소음을 소개 할 수 있습니다. Ratiometric 분석은 전지 본체에서 어느 정도 및 측정보다 강력한 아르 이러한 효과를 완화하는 데 도움이됩니다. 조심스럽게 실행과 고정 절차의 상세는 아직 완전히 동물이 높아집니다. </li><li> 배경 선택 : 배경 지역의주의 선택이 성공적으로 이미지 분석을위한 필요합니다. 배경 지역이 합리적으로 균일하고 이미징 뉴런 후 어두워해야합니다. 그것은 충분히 이미징 뉴런에서 분산 된 광 (그리고 따라서 픽업 신호)을 방지하기 위해 제거해야합니다. 우리는 균일 한 지역 20-5를 찾을 수투자 수익 (ROI)에서 0 μm 대부분의 경우에 잘 작동합니다. </li><li> Ratiometric 광학 : 영상 광학의 올바른 정렬은 분명 이중 이미지를 생성 중요합니다. ratiometric 이미징을위한 상업 현미경 첨부 파일을 사용할 수 있습니다. 대안 기술은 각각에 대해 별도의 이미지를 기록하면서 빠르게 방출 파장 사이를 전환 할 빠른 필터 휠을 사용하여 빠른 연속 이미지를 고용하는 것입니다. </li><li> Ratiometric 분석 : 분석 여기에 설명이 투자 수익 (ROI)을 통해 평균을 가진 강력한 신호를 생성하는 비교적 간단한 방법입니다. 그것은 투자 수익 (ROI)을 선택 없지 밝은 물체가 필요합니다. 보다 정교한 ratiometric 분석은 정확하게 형광 비율은 픽셀에서 픽셀을 계산 될 수 있다는 등의 듀얼 이미지를 정렬하고 매핑하여이 가능합니다. </li></ol>

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</ol>

제작자들은 더 경쟁 금융 이익이 없다는 점 선언합니다.

유전자 인코딩 칼슘 표시기가 널리 C.에 활용 된 elegans 신경 생물학. 많은 그룹은 전기 필드에 ASJ 응답과 함께 시연와 같은 외부 자극에 차 감각 뉴런의 반응을 공부하고 이러한 기술을 고용하고 있습니다. 눈에 잘 띄는 예는 기계 터치의 감각, 특정 화학 물질, 온도 및 전기 분야 12, 16-19 등이 있습니다. interneuron 및 근육 세포의 활동은 자극에 대한 응답으로, 동물 행동의 통제에 모두 모니터링하고 있습니다. 이러한 연구의 대부분은이 기술에게 부분적으로 억제하거나 자유롭게 움직일 동물뿐만 아니라 동시에 여러 뉴런에서 기록 뉴런에서 녹화를 사용하려면 이미지 인식 및 추적 기술을 사용하여 더 단계를 추진해 왔습니다. 추가 연구는뿐만 아니라 여기에 제시된로 neuronal 손상 13, 20 응답으로 칼슘 생리학의 다른 측면을 조사했습니다더 이상 시간의 척도가 21 neuronal 퇴행. <p class="j...

여기 C.의 생체 칼슘 이미징에 대한 실질적인 방법을 제시 elegans의 뉴런. 높은 신호 대 잡음 비율 유전자 인코딩 칼슘에 민감한 fluorophores의 개발은 C.하게 neurophysiology과 활동의 측정을위한 비교적 간단하고 비용 효율적인 시스템을 elegans. 우리 이미징는 일반적으로 사용 가능한 fluorophores의 폭 넓은 분야 형광 이미징을 사용하여 표준 복합 현미경으로 이루어집니다. 우리는 각각의 강점과 약점을 토론, 다양한 fluorophores 서로 다른 샘플 준비를 채용 몇 가지 기술을 제시한다. 데이터는 후 두 예를 들어 실험에서 제공됩니다. 여기에서 설명한 기술에 훌륭한 추가 리소스가 WormBook, &quot;영상 뉴런과 근육의 활동&quot;R. 커로 (에서 찾을 수 있습니다 <a href="http://www.wormbook.org" target="_blank">http://www.wormbook.org</a> ) 3. geneti의 두 가지 주요 클래스켈리 인코딩 형광 칼슘 기자는 일반적으로 C.에 사용됩니다 elegans : 단일 채널 GCaMP과 걱정 기반 cameleon. 우리는 방법을 설명하고 각에서 생성 된 데이터에 대한 예를 표시합니다. GCaMP는 주변 칼슘 농도에 민감 수정 그린 형광 단백질 (GFP)을 기반으로합니다. 이것은 calmodulin에 의해 칼슘의 바인딩이 효율적으로 형광등 확인이로 GFP 분자을 제공되도록 GFP의 융합과 높은 칼슘 친 화성 단백질 calmodulin에 의해 달성된다. 이 fluorophores의 최근 발전은 칼슘 수준의 생리적 범위와 ~ 95 밀리 초 상승 시간 및 ~ 650 밀리 초 감소 시간 4 합리적으로 빠른 반응 속도론 이상의 형광 강도의 최대 500 % 증가로 뛰어난 신호 크기를 생성합니다. 비교적 짧은 기간 (분) 동안이 대형 신호는 낮은 해상도 영상을 허용 (낮은 배율)와, 잘 행동 INIT 부여 할 수 있습니다ial 기준 측정, 연속 기준선 또는 비교 측정의 필요성을 깨뜨릴. Cameleon은 두 개의 독립적 인 채널이나 파장 1 비교 ratiometric 측정을 생성하는 걱정 기반의 형광가되는 장점이 있습니다. 이 calmodulin 단백질로 연결 두 개의 별도 fluorophores (시안과 노란색 발광 형광 단백질, CFP 및 YFP)으로 구성되어 있습니다. 단지는 CFP을 자극 푸른 빛 (440 nm 정도)으로 조명하고 있습니다. 칼슘의 바인딩은 YFP (수용체)에 CFP (기증자)에서 형광 공명 에너지 전송 (걱정) 증가와 CFP 방사 (480 nm 정도)가 감소하고 YFP 방사 (535 nm 정도) 증가하는 원인이 서로 가깝게 fluorophores을 제공합니다 . 상대 칼슘 수준은 YFP / CFP 강도의 비율로 측정됩니다. Cameleon의 동력학은 ~ 1 초의 상승 시간과 ~ 3 초 5 붕괴 시간을 가지고 생체로 측정 GCaMP,보다 느린 있습니다. 그러나,oppositely 이동 신호의 비율은 신호의 크기를 증가시키고 인해 형광 농도, 모션 또는 초점 드리프트 및 표백의 변화에​​ 가능한 유물의 번호를 보상. 유전자 인코딩 형광 기자 exogenously 관리 프로브와 C.와 함께 필요한 샘플 준비의 대부분을 백지화 elegans 작은 투명한 몸은 간단한 넓은 필드 형광을 사용하여 손상 동물에서 이미지 할 수 있습니다. 샘플 준비의 주요 기술 과제는 안전하게 동물을 고정하는 것이 있습니다. 다른 일반적으로 사용되는 기술 장점과 단점 각각의 숫자가 있습니다. 동물을 마비하는 약리 에이전트를 사용하면 쉽게 구현할 수 있으며, 수 (Levamisole, 점유 근육 조직을 일으키는 일반적으로 6 데 사용되는 cholinergic 작용제) 한 준비에서 여러 동물의 장착. C. elegans는 물리적으로 장착하여 고정 할 수 있습니다뻣뻣한 10% 아가로 오스 7, 8 있습니다. 동물의 생리 기능에이 최소화 미치는 영향은 장기 이미징 (시간) 여러 동물의 복구를 할 수 있지만 더 기술적으로 어렵습니다. 이러한 기술 모두 동물 (이는 커버 슬립 이하)에 물리적으로 액세스를 제한하기 때문에 특정 실험 자극 (예 : 빛, 온도, 전기장 또는 레이저 손상 등)와 함께 사용할 수 있습니다. 이러한 화학 물질의 접촉이나 관리와 같은 물리적 인 액세스가 필요합니다 자극에 대한 많은 연구가 성공적으로 C.이 붙은 것 장소에 elegans (수의학 등급 접착제를 사용하여) 9. 이 기술적으로 더 도전이며, 하나의 동물 준비하고 동물 복구를 허용하지 않습니다. 마지막으로, 다수의 마이크로 유체 장치는 물리적 C.을 억제하는 고용 한 elegans은, 동물 생리를 보존 자극 (장치 설계에 따라 다름) 대부분의 유형에 대한 노출을 허용하고하면 동물의 신속한 교류 및 복구를 사용할 수 있습니다 <sup&gt; 10, 11. 그러나 microfluidics는 디자인, 제조 및 구현에 추가 기술 기술과 기능을 필요로합니다. 고정 동물 활동 및 자극에 반응은 일반적으로 감각과 interneurons로 측정 할 수 있습니다. 모터 뉴런의 활동 움직이는 동물의 이미지에 대한 더 많은 정교한 기술을 필요로합니다. 여기 약리 paralyzation와 치열한 아가로 오스와 고정의 두 가장 간단한 기술을 채용 자세한 방법을 제시합니다. 여기에 제시된 방법은 C.의 neuronal 활동 및 세포 생리학을 측정하는 데 사용할 수 있습니다 elegans. 우리는 각각의 예를 들어 주 : 외부 전기장에 ASJ 신경의 감각 응답을 측정 할 수 GCaMP 사용하고, 신경 세포의 레이저 손상 생리 칼슘 응답을 측정 cameleon을 사용합니다. 이러한 예는 fluorophores의 두 유형의 장점과 단점을 보여 시스템이 가능합니다 무엇을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>Eclipse Ti-U inverted microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Intensilight HG Illuminator</td><td>Nikon</td><td>C-HGFI</td><td>형광 광원</td></tr><tr><td>CFI Plan Apo VC 60X Oil</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>광학 테이블 또는 3'X3' 광학 등급 브레드보드</td><td>Thor Labs</td><td></td><td>광학 테이블을 사용하지 않는 경우 > 견고한 실험실 벤치의 <br/ 광학 등급 브레드보드 로 충분합니다.</td></tr><tr><td>클라라 인터라인 카메라</td><td>Andor 기술</td><td></td><td>고감도 CCD 카메라</td></tr><tr><td>wtGFP 롱패스 방출</td><td>크로마 기술 Corp.</td><td>41015</td><td>GFP 필터 세트, GCaMP</td></tr><tr><td>필터 440 +/- 10 nm</td><td>Chroma</td><td>D440/20x EX</td><td>여기 필터, 낙타</td></tr>용 이<tr><td>색성 거울 > 455 nm 장역 통과</td><td>Chroma</td><td>455DCLP BS</td><td>현미경 이색성 카멜레온 이미징용</td></tr><tr><td>이색성 미러 > 515 nm 장통과</td><td>Chroma</td><td>515DCLP BS</td><td>이색성 미러 카멜레온 이미징</td></tr><tr><td>필터 535 +/- 15 nm</td><td>Chroma</td><td>D535/30m EM</td><td>YFP 방출 필터</td></tr><tr><td>필터 480 +/- 20 nm</td><td>Chroma</td><td>D485/40m EM</td><td>CFP 방출 필터</td></tr><tr><td>렌즈, 200 mm, Achromat</td><td>Thor Labs</td><td>AC508-200-A1</td><td>FRET 광학용 릴레이 렌즈 (3)</td></tr><tr><td>실버 광대역 미러</td><td>Thor Labs</td><td>ME2S-P01</td><td>FRET 광학 (2)</td></tr><tr><td>NGM 버퍼</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>레바미솔</td><td>시그마</td><td></td><td></td></tr><tr><td>폴리비드 마이크로스피어</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>08691-10, 2.5% by 부피, 50 nm 직경</td><td>폴리스티렌 나노 입자 elegans 고정화</td></tr><tr><td>형질전환 균주, Strain gpa-9::GCaMP3(pha-1에서; him-5 bkg) </td><td>Sternberg Lab</td><td>Strain PS6388</td><td></td></tr><tr><td>형질전환 균주, mec- 4::YC3.60</td><td>Gabel Lab</td><td>Strain CG1B</td><td></td></tr></tbody></table>

c.의 생체 neuronal 칼슘 이미징에서 elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

선충류 웜 C. elegans는 생체에서 상대적으로 단순하고 저렴한 비용으로 neuronal 이미징을위한 이상적인 모델 생물이다. 작은 투명 몸과 간단한 잘 특징 신경계의 손상 동물에서 확인하고 신경 세포의 형광 이미징 할 수 있습니다. 동물의 생리 기능에 미치는 영향을 최소화와 간단한 고정 기법은 오랜 시간 경과 영상 할 수 있습니다. 이러한 cameleon 1 GCaMP이 같은 유전자 인코딩 칼슘 민감한 fluorophores의 개발은 세포 생리학과 neuronal 활동을 모두 관련된 neuronal 칼슘의 생체 이미징에 수 있습니다. 특정 뉴런에서 이러한 fluorophores을 표현 수많은 유전자 변형 종자는 쉽게 사용할 수 있습니다 또는 잘 구축 된 기술을 사용하여 구축 할 수 있습니다. 여기, 우리는 GCaMP와 cameleon를 사용하여 생체 내에서 단일 신경 세포 내 칼슘 역학을 측정하기위한 세부 절차를 설명합니다. 우리는 장점과 disadvant을 논의모두 세뿐만 아니라 샘플 준비 (동물 고정) 및 이미지 분석의 다양한 방법. 외상성 레이저 손상 신경의 생리적 칼슘 응답을 측정 cameleon를 사용하여 외부 전기 분야 2 특정 뉴런의 감각 반응)를 측정하는 GCaMP를 사용하여 : 1) 마지막으로, 우리는 두 실험의 결과를 제시한다. 다음과 같은 칼슘 이미징 기술은 C.에 광범위하게 사용됩니다 elegans와는 유전 적 배경에서 자유롭게 이동하는 동물, 동시에 여러 뉴런과 비교 측정으로 확장되었습니다. C.는 elegans 기술 단순성과 비용의 다른 모델 시스템을 통해 장점과 생체 neuronal 이미지에 대한 강력하고 유연한 시스템을 제공합니다.

여기 두 개의 서로 다른 실험의 결과를 제시한다. 첫 번째는 형광 칼슘 기자 광학 그대로 C.에 neuronal 활동을 모니터링하는 데 사용할 수있는 방법에 대한 좋은 예를 제공 정의 된 외부 자극에 특정 감각 신경 세포의 반응을 측정 할 GCaMP 고용 elegans. 두 번째는 cameleon이 과도 세포 내 칼슘이 때문에 칼슘 생리학은 생체 내에서 단일 세포 내에서 측정 할 수있는 방법을 설명하는 특정 레이저 손상에 대한 응답으로 신경 세포 내에서 발생 측정하는 고용합니다. 각 측정의 기술적 인 측면 개별 평가 결과를 상세하게 소개하고 설명합니다에 초점을합니다. 종종 시간 (자극에 대해 각 시점에서의 평균 응답으로 계산) 또는 특정 측정 항목 (예 : 응답의 평균 진폭 등) 동안의 평균 응답은 많은 시련에서 계산됩니다. 일반적으로 10-20 시련이 받아 들일 수있는 평균 측정을 생성 할 필요가 있지만, t 아르그 숫자는 응답의 고유 다양성에 따라 달라집니다. 여기에 논의 된...

작은 투명 몸, 잘 문서화 neuroanatomy 및 의무 유전자 기술과 시약의 호스트로,<em&gt; C. elegans</em&gt;를위한 이상적인 모델 유기체를 만들어<em&gt; 생체 내</em상대적으로 단순하고 저렴한 비용으로 기술을 사용하여&gt; neuronal 영상. 여기 유전자 인코딩 형광 칼슘 지표를 사용하여 그대로 어른이 동물에서 단일 신경 세포 이미징을 설명합니다.

C.의 생체 Neuronal 칼슘 이미징에서 elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

다음 실험의 전반적인 목표는 유전적으로 암호화된 형광 4점을 사용하여 선충 내 단일 뉴런의 칼슘 역학을 측정하는 것입니다. 우아함을 보십시오, 이것은 표준 현미경 슬라이드에서 관심 뉴런에서 칼슘에 민감한 형광단을 표현하는 온전한 C 우아함을 먼저 장착하고 분해함으로써 달성됩니다. 다음으로, 개별 뉴런은 비디오 현미경 및 표준 epi 형광 이미징 기술을 사용하여 생체 내에서 이미지화됩니다.그런 다음 비디오를 분석하여 일반적으로 사용되는 두 개의 Fluor fours G 캠프에 대한 뉴런의 특정 위치에서 형광 강도를 측정하며, 이는 강력하고 큰 진폭의 단일 채널 신호와 이중 채널 비율을 생성하는 프렛 기반 카멜레온을 제공합니다. 특정 감각 자극에 대한 반응으로 표시된 뉴런 활동과 세포 손상에 대한 반응으로 나타나는 세포 칼슘 생리학에 대한 미터법 측정 결과를 얻을 수 있으며, 둘 다 이미징된 뉴런 내의 상대적 칼슘 수치의 광학 측정을 기반으로 합니다. 척추동물 시스템 또는 기존 전기생리학에서 유사한 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 CL elgan이 기술적으로 간단하고 비용 효율적인 생체 내 신경 이미징을 위한 견고하고 유연하며 유전적으로 다루기 쉬운 시스템을 나타낸다는 것입니다.이 방법은 광범위한 현장 기반 뉴런 생물학에서 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 생체 내에서 개별 뉴런의 활성과 사인을 모두 측정할 수 있습니다. 최상의 이미지 및 신호 품질을 위한 epi 형광 이미징 기능을 갖춘 표준 복합 현미경으로 시작하십시오. 고배율, 높은 개구수 대물렌즈 및 고감도 냉각 CCD 카메라를 사용하여 이미지 해상도와 감도를 최대화하는 동시에 단일 색상 플로라 포에 대한 배경 소음을 최소화하십시오.G 캠프용 Fluor four의 특정 파장에 맞게 설계된 표준 현미경 형광 필터 세트를 사용하십시오. 488 나노미터의 여기(excitation) 및 525 나노미터의 방출에 최적화된 표준 GFP 필터 세트를 사용하며, 카멜레온(chameleon)과 같은 4가지 비율의 미터법 세균총은 이중 이미징 시스템을 사용하여 두 개의 개별 파장에서 동일한 이미지를 동시에 캡처할 수 있습니다. 이는 다음과 같은 방식으로 듀얼 이미지를 카메라에 나란히 투사하는 상용 또는 가정용 시스템을 사용하여 수행할 수 있습니다.440 플러스 또는 마이너스 20 나노미터 여기 필터와 455 나노미터 장역 통과 iic 미러를 갖는 현미경 필터

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 동영상은 칼슘 이미징의 개념을 소개하고 성형된 아가로스 웰에 포함된 벌레의 타임 랩스 이미징을 위한 예제 프로토콜을 포함합니다.

칼슘 이미징: 살아있는 예쁜꼬마선충의 신경 활동을 시각화하는 방법

이 비디오는 유전적으로 암호화된 형광 리포터 단백질을 사용하여 행동하는 Caenorhabditis elegans의 개별 뉴런에서 칼슘 이미징 기술을 보여줍니다. 이 연구는 기생충의 움직임을 이미징하고 뉴런에서 리포터 형광 비율을 측정하여 세포 내 칼슘 수치를 알을 낳는 동안 뉴런 활동 및 행동 변화와 상관시키는 단계를 간략하게 설명합니다.

Calcium Imaging in individual neurons Regulating Egg-Laying Behavior in Caenorhabditis elegans(예쁜꼬마선충의 알을 낳는 행동을 조절하는 개별 뉴런의 칼슘 이미징)

출처: Doser, R., et al. 생체 내 신경 칼슘 처리의 세포 내 이미징. J. Vis. 경험. (2023년)이 비디오는 형질전환 Caenorhabditis elegans 균주의 복부 신경 코드 뉴런에서 세포내 칼슘 플럭스의 생체 내 이미징을 보여줍니다. 두 가지 별개의 칼슘 지표가 사용됩니다: 한 균주의 세포질 지표와 다른 균주의 미토콘드리아 지표. 뉴런은 자발적인 뉴런 활동 중 칼슘 플럭스를 반영하여 뉴런 세포질 및 미토콘드리아 내 형광 강도의 실시간 변화를 모니터링하기 위해 형광 현미경으로 관찰됩니다.

Caenorhabditis elegans의 뉴런에서 세포내 칼슘 역학 이미징

동물을 움직이지 않게 하지 않고 장시간 척도에 걸쳐 행동과 신경 활동을 영상화하는 것이 행동을 이해하기 위한 전제 조건입니다. 아가로스 미세유체 챔버 이미징(AMI)은 예쁜꼬마선충의 모든 생애 단계에 대한 신경 활동과 행동을 이미지화하는 데 사용할 수 있습니다.

의 장기 칼슘 이미징을위한 아가로 오스 Microchambers<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

이 프로토콜 꼬마 선 충 벌레 행동에 신경 활동에 기록 변화 유전자 인코딩된 캘리포니아2 + 기자의 사용을 설명 합니다.

꼬마 선 충 을 행동에 개별 뉴런의 비율 칼슘 이미징

이 방법은 모델 유기체 C. elegans의신체 벽 근육에서 발동 된 칼슘 과도 의 변화와 이미지 기준선 세포질 칼슘 수준에 광유전학 및 유전적으로 코딩 된 칼슘 센서를 결합하는 방법을 제공합니다.

C. 예쁜꼬마선충의 생체내 칼슘 이미징

여기에 보고된 것은 잘 제어되고 국소화되지 않은 진동을 가진 자유롭게 행동하는 예쁜꼬 마선충에서 칼슘 이미징을 위한 시스템이다. 이 시스템을 통해 연구원은 나노 규모의 변위에서 잘 제어 된 특성을 가진 비 국부적 인 진동을 불러 일으키고 진동에 대한 C. elegans 의 반응 중에 칼슘 전류를 정량화 할 수 있습니다.

잘 제어되고 국소화되지 않은 진동으로 자유롭게 행동하는 Caenorhabditis elegans의 칼슘 이미징

수지상 등뼈는 신경계의 중요한 세포 특징입니다. 여기에서는 C. elegans에서 수지상 가시의 구조와 기능을 평가하기위한 라이브 이미징 방법이 설명됩니다. 이러한 접근법은 수지상 척추 모양 또는 기능을 정의하는 유전자에 대한 돌연변이 스크린의 개발을 지원합니다.

Caenorhabditis elegans의 수지상 가시 이미징

현재 방법은 쉽게 사용할 수 있는 유전적으로 암호화된 칼슘 지표를 사용하여 예쁜꼬마선충에서 생체 내 고해상도 하위 구획 칼슘 이미징을 위한 비비율계량 접근 방식을 설명합니다.

생체 내에서 처리되는 신경 칼슘의 세포 내 이미징

여기에서는 모델 선충 C. elegans의 생식계에서 발현되는 유전적으로 암호화된 칼슘 리포터를 사용하여 수정 및 초기 배발생 중 칼슘을 시각화하기 위한 프로토콜과 도구를 제시합니다.

In vivo Visualization of calcium Transients during fertilization and Early Development in C. elegans(예쁜꼬마선충의 수정 및 초기 발달 중 칼슘 과도 현상의 생체 내 시각화)

학습하세요 C. elegans 단일 뉴런의 칼슘 역학 측정을 위한 유전자 인코딩 형광 지표법. 이 기술은 생체 내 뉴런 활성 및 세포 손상 반응을 실시간으로 분석하여 신경생물학 연구에 활용됩니다.

C.의 생체 Neuronal 칼슘 이미징에서 elegans

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