C.의 생체 Neuronal 칼슘 이미징에서 elegans

다음 실험의 전반적인 목표는 유전적으로 암호화된 형광 4점을 사용하여 선충 내 단일 뉴런의 칼슘 역학을 측정하는 것입니다. 우아함을 보십시오, 이것은 표준 현미경 슬라이드에서 관심 뉴런에서 칼슘에 민감한 형광단을 표현하는 온전한 C 우아함을 먼저 장착하고 분해함으로써 달성됩니다. 다음으로, 개별 뉴런은 비디오 현미경 및 표준 epi 형광 이미징 기술을 사용하여 생체 내에서 이미지화됩니다.

그런 다음 비디오를 분석하여 일반적으로 사용되는 두 개의 Fluor fours G 캠프에 대한 뉴런의 특정 위치에서 형광 강도를 측정하며, 이는 강력하고 큰 진폭의 단일 채널 신호와 이중 채널 비율을 생성하는 프렛 기반 카멜레온을 제공합니다. 특정 감각 자극에 대한 반응으로 표시된 뉴런 활동과 세포 손상에 대한 반응으로 나타나는 세포 칼슘 생리학에 대한 미터법 측정 결과를 얻을 수 있으며, 둘 다 이미징된 뉴런 내의 상대적 칼슘 수치의 광학 측정을 기반으로 합니다. 척추동물 시스템 또는 기존 전기생리학에서 유사한 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 CL elgan이 기술적으로 간단하고 비용 효율적인 생체 내 신경 이미징을 위한 견고하고 유연하며 유전적으로 다루기 쉬운 시스템을 나타낸다는 것입니다.

이 방법은 광범위한 현장 기반 뉴런 생물학에서 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 생체 내에서 개별 뉴런의 활성과 사인을 모두 측정할 수 있습니다. 최상의 이미지 및 신호 품질을 위한 epi 형광 이미징 기능을 갖춘 표준 복합 현미경으로 시작하십시오. 고배율, 높은 개구수 대물렌즈 및 고감도 냉각 CCD 카메라를 사용하여 이미지 해상도와 감도를 최대화하는 동시에 단일 색상 플로라 포에 대한 배경 소음을 최소화하십시오.

G 캠프용 Fluor four의 특정 파장에 맞게 설계된 표준 현미경 형광 필터 세트를 사용하십시오. 488 나노미터의 여기(excitation) 및 525 나노미터의 방출에 최적화된 표준 GFP 필터 세트를 사용하며, 카멜레온(chameleon)과 같은 4가지 비율의 미터법 세균총은 이중 이미징 시스템을 사용하여 두 개의 개별 파장에서 동일한 이미지를 동시에 캡처할 수 있습니다. 이는 다음과 같은 방식으로 듀얼 이미지를 카메라에 나란히 투사하는 상용 또는 가정용 시스템을 사용하여 수행할 수 있습니다.

440 플러스 또는 마이너스 20 나노미터 여기 필터와 455 나노미터 장역 통과 iic 미러를 갖는 현미경 필터 세트는 카메라 CCD 센서가 일반적으로 초기 이미지 평면으로부터 하나의 초점 거리에서 떨어져 광을 대조하도록 하는 현미경 이미징 포트 바로 외부의 초기 이미지 평면에 배치된 이미지 마스크를 미러링하고, 빛을 두 개의 분리된 이미징 파장 또는 채널로 분할하여 한 가지 색상을 반사하고 다른 방출 필터는 투과시키는 이색성 미러입니다. 투과광을 특정 이미징 파장으로 더욱 제한합니다. 두 번째 릴레이 렌즈는 빔 경로에 배치된 각 채널에 하나씩 빛을 CCD 카메라에서 두 번째 이미지 평면으로 다시 초점을 맞춥니다.

한 쌍의 미러와 두 번째 다이크로익 미러는 두 이미지가 재결합되어 카메라에 나란히 투사되도록 빔 경로를 지시합니다. CCD 센서. 다음은 결과 이미지의 예입니다.

설정이 완료되면 다음과 같은 방법으로 이미지를 조정하고 미세 조정할 수 있으며, 전송된 이미지가 카메라 시야의 절반을 덮도록 카메라 위치를 이동합니다. 빔 경로에서 마지막 두 개의 미러를 조정하여 반사된 이미지를 시야의 나머지 절반을 덮도록 이동하고, 각 채널의 두 번째 릴레이 렌즈를 빔 경로를 따라 앞뒤로 움직여 초점을 최적화합니다. Citis 유전자 센터 또는 기타 출처에서 관심 뉴런에서 칼슘에 민감한 형광단을 발현하는 동물을 획득합니다.

또는 표준 바다표범 엘간 기술을 사용하여 형질전환 동물을 구성합니다. 그런 다음 다음 기술 중 하나를 사용하여 0.05%leal에서 2%aros에서 약리학적 마비를 위한 seal의 우아함을 고정시키고 두 개의 실험실 테이프를 스페이서로 사용하는 두 개의 유리 슬라이드 사이에 용융된 aros 한 방울을 눌러 이미징을 위한 aros 패드를 만듭니다. 상단 슬라이드를 제거한 후 5-10마리의 동물을 선택하여 패드에 옮깁니다.

패드 덮개를 커버 슬립으로 덮고 파라핀 왁스와 바셀린의 뜨거운 일대일 혼합물을 소량 모서리에 바르고 제자리에 고정합니다. 레미솔이 효과를 발휘하고 동물들이 완전히 가만히 있을 때까지 5분에서 10분 정도 기다립니다. 뻣뻣한 아로스 방법을 사용하여 동물을 움직이지 못하게 하려면 10% 아로스 패드를 만드십시오.

패드 표면에 약 3 마이크로 리터의 1-10 폴리스티렌 마이크로 스피어 용액을 추가하고 비트 용액 풀에 5-10 개의 깨끗한 바다 우아함을 빠르게 선택합니다. 커버 슬립으로 부드럽게 덮고 모서리에 용융 왁스를 바릅니다. 일반적인 실험은 동물에게 특정 자극이나 상태를 투여하는 동시에 단일 뉴런의 반응을 비디오로 기록하는 것을 필요로 합니다.

비디오 획득용. 우리는 약 300밀리초의 노출 시간으로 초당 약 1프레임으로 이미지를 만드는 경우가 많습니다. 관심 영역 내의 각 프레임에 대한 형광 강도 또는 근처 배경 영역을 기준으로 이미징된 뉴런의 ROI를 측정하기 위해 비디오를 분석해야 합니다.

당사의 분석 프로그램은 모든 프레임에서 관심 대상을 포함하는 대략적인 경계가 수동으로 선택되고 독립적인 배경 영역이 선택된 영화의 모든 이미지에 대한 압축된 이미지를 표시합니다. 첫 번째 경우 ROI는 경계 영역 내에서 수동으로 선택됩니다. 각 후속 프레임에 대해 프로그램은 카멜레온으로 생성된 비율 메트릭 이미지에 대한 올바른 크기의 ROI를 생성하기 위해 경계 영역 내에서 가장 밝은 픽셀을 선택하고, 각 이중 이미지 또는 채널에 대해 유사한 대략적인 ROI 및 배경 영역을 선택한 다음 첫 번째 프레임의 한 이미지에서 ROI를 선택합니다. 각 프레임에 대한 형광 신호 F는 ROI의 평균 픽셀 강도에서 배경 영역의 평균 강도를 뺀 값으로 계산됩니다.

각 프레임에 대한 상대적 칼슘 수준은 첫 번째 프레임 또는 일련의 프레임에서 측정된 초기 기준선 값으로 정규화된 강도의 변화율로 계산됩니다. 비율 메트릭 값은 두 채널의 비율로 계산됩니다. 세포체 내에서 선택된 ROI는 가장 강력하고 강력한 신호를 생성하지만, 신경 과정을 따라 ROI에서 신호를 선택하고 측정하는 것도 가능합니다.

여기광에 노출되면 4 가지 식물이 표백될 수 있으며 표백이 발생할 경우 노출 수준에 따라 신호가 꾸준히 감소하는 것이 특징입니다. 중성 밀도 필터로 노출 시간 및/또는 여기 강도를 줄여 녹음 중 바다의 우아함 움직임으로 인해 발생하는 소음을 최소화합니다. 빛 노출과 실험적 자극에 대응하여 깨끗한 제제를 사용하여 고정 절차를 조심스럽게 실행하십시오.

성공적인 영상 분석을 위해서는 상당히 균일하고, 뉴런에 대한 영상보다 어둡고, 산란광을 피할 수 있을 만큼 충분히 멀리 떨어져 있는 배경 영역을 선택하십시오. 여기에 표시된 것은 단일 C 우아함, G 캠프를 표현하는 SJ 뉴런이 각각 10초 동안 지속되는 세 번의 개별 시도를 위해 외부 3볼트/센티미터 전기장에 반응하는 것입니다. 동물은 레미솔을 사용하여 움직이지 못하게 되었지만, 영상에는 움직임과 초점에 약간의 결함이 있다.

드리프트 형광 강도는 세포체에서 측정되었습니다. 첫 번째 및 세 번째 자극에 대한 반응으로 형광이 약 250% 크게 증가함을 보여주는 비디오 결함에도 불구하고 신호는 강력합니다. 두 번째 자극의 결과는 상당히 감소합니다.

뉴런 반응의 가변성을 보여주는 것은 백화(bleaching)가 미미하며, 이는 일관된 기준선 수준으로 복귀하는 것에서 알 수 있습니다. 외상성 세포 손상은 세포의 생리적 반응에 필수적인 역할을 하는 뉴런 내에서 큰 칼슘 과도를 유발합니다. 이 비디오는 단일 뉴런의 레이저 남색에 대한 손상 유도 반응을 보여줍니다.

카멜레온 리포터의 CFP 및 YFP 형광 채널 모두의 신호를 기록하기 위해 이중 이미징 광학 장치가 사용되었습니다. 이 그림은 레이저 수술 실험 과정에서 세포체에서 측정된 결과 프렛 신호를 보여줍니다. 레이저 손상과 세포질 칼슘의 증가에 대한 반응으로 T에서 칼슘은 0초와 같습니다.

CFP가 급격히 감소하고 YFP가 증가하여 비율 메트릭 신호가 즉시 약 200% 증가하며, 이는 약 90초 동안 유지된 후 기준선 수준에 가깝게 떨어집니다. 백화는 일관된 기준선에서 알 수 있듯이 최소화됩니다. 이 그림은 여기에서 절단 지점에 가까운 축삭 세그먼트에서 측정된 결과 프렛 신호를 보여줍니다.

플루오로 4의 국소 양은 실험 과정에 따라 변합니다. 신호 레이저 수술을 복잡하게 하면 축삭돌기가 절단되고 막이 잠시 파열되어 4번 식물군이 빠져나갈 수 있고 일시적으로 국소 세포질 농도가 감소합니다. 이는 이후 시점에서 YFP 추적의 초기 감소에서 분명합니다.

절단된 끝단은 지속적인 회복의 일환으로 부풀어 오르고, 그 결과 더 국소적인 플루오로 4가 생기고 강도가 증가합니다. 이는 천천히 증가하는 CFP 트레이스에서 가장 분명하지만, 이러한 변화는 두 채널에 동일하게 영향을 미치며 프렛 비율은 강력한 신호를 제공하는 데 효과적으로 보상합니다. 결과 측정 결과는 신호가 즉시 약 150% 증가하고, 약 90초에 거의 기준선으로 급격히 회복된 다음, 약 150초에 추가로 더 작은 2차 반응을 보이는 세포체와 유사한 반응을 보여줍니다.

비율 메트릭 이미징을 위한 상용 현미경 부착물을 사용할 수 있으며, 픽셀 단위 픽셀 비율 메트릭 측정을 생성하는 보다 정교한 이미지 분석 소프트웨어와 함께 사용할 수 있습니다. 일단 숙달되면 이러한 기술은 다른 모델 시스템이나 방법에 필요한 복잡한 샘플 준비, 조직 해부 또는 이미징 기술 없이 비교적 쉽게 수행할 수 있습니다. 적절하게 수행되면 전체 실험을 한두 시간 안에 실행할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 이미징을 위해 우아함을 고정시키는 방법, 생체 내에서 개별 뉴런에 대한 비디오 최대 복사를 수행하는 방법, 결과 비디오를 분석하여 뉴런을 기반으로 상대적인 칼슘 수치를 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.