Name: Endophytes로 곰팡이 Entomopathogens 구축 : Endophytic 생물학적 방제 향해 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 14 s
Description: 학습하세요 Beauveria bassiana를 Phaseolus vulgaris에 내생균으로 접종하는 두 가지 방법을. 잎면살포와 토양관수법으로 농업해충 방제를 위한 생물학적 방제 잠재력을 평가하는 기초 연구를 수행합니다.

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생산 및 실험 작업은 여기 Reynaldo Pareja의 헌신적이고 열정적 인 도움을 반영 발표했다. 콜롬비아의 행정 과학학과, 기술과 혁신 (Colciencias)와 빌 &amp; 그랜드 도전의 탐험 사업을 통해 멜린다 게이츠 재단의 교부금으로 운용.

1. 식물 <ol><li> 표면 살균 0.5 % 차아 염소산 나트륨의 2 분 70 % 에탄올에 2 분을 immersing하여 콩 종자 (cv. Calima를). 멸균 증류수의 씨앗을 세 번 씻어. </li><li> 감자 dextroxe 한천 (PDA) 미디어에 마지막 린스 물을 100 μl를 도금, 25에서 10 일 동안 판을 잠복기하여 살균의 성공 ° C.를 평가 모든 성장은 판에 표시되는 경우 실험을 종료하고 다시 시작합니다. </li><li> 2시 1분 비율로 토양과 모래의 무균 혼합을 포함 냄비에 세 그룹의 종자를 심습니다. 25 성장 챔버 ° C, CA에 냄비를 전송합니다. 50% RH, 12 시간 photoperiod. 일주일 발아 후, 두 최소 힘차게 모종을 제거합니다. 멸균 증류수 및 NPK 15-15-15 비료 6g / L 물 솔루션으로 재배 한 후 10 이십일 비옥 물에 모든 2-3일. </li></ol> 2. 진균류 <ol><li> commer을 확보Beauveria bassiana 변형 가나 (Mycotrol SE, Laverlam, 칼리, 콜롬비아)의 cial 제형. </li><li> 단일 포자 주식 문화를 생성하려면 CA를 일시 중지합니다. 하나는 10 초에 0.1 % 물 튼-X 100의 솔루션과 소용돌이의 1 ML에 conidia의 전체 루프를 inoculating. 25 24 시간에 2.5 % 귀족 한천과 배양에 정지 후, 판 100 μl ° C. 100mm 플레이트가 포함 된 PDA에 하나의 germinating conidium를 전송하고 전체 플레이트 (ca. 3-4주)를 포함 할 때까지 성장합니다. </li><li> 무균 조건에서 매체의 표면에서 곰팡이 성장을 다쳤고, 10 ML 멸균 0.1 % 트리톤 - X 100에 일시 중지됩니다. 1 분 와동. 그런 다음 균사를 제거하고 주식 정지를 얻기 위해 멸균 일종의 투박한 무명을 통해 정지 필터링합니다. </li><li> 주식 정지 conidial 농도를 추정하기 위해 hemocytometer를 사용합니다. conidial 카운트를 촉진하기 때마다 100 μl O를 전송, 주식의 10,000 배 희석 시리얼을 준비F conidial 0.1 % 트리톤 - X 100 900 μl에 정지하고, 다음 희석하기 전에 10 초에 vortexing. </li><li> inoculum를 생성하려면 다음 수식을 사용하여 10 8 conidia / ML의 최종 농도에 주식 정지를 조정 : <img src="/files/ftp_upload/50360/50360eq1.jpg" alt="방정식 1" fo:src="/files/ftp_upload/50360/50360eq1highres.jpg"/></li><li> 25에서 24 시간에 2.5 % 귀족 한천과 배양에 10,000 배 희석의 conidial 생존, 판 100 μl을 평가하기 위해 ° C. 그런 다음 %의 발아을 예측할 수 100 conidia 세 무작위로 그룹을 검사한다. germinated conidium을 고려 할 때의 conidium 프로젝트의 절반 직경보다 눈에 띄는 세균 관 이상. 평균 %의 발아이 90 %를 초과하는 경우에만 정지를 사용합니다. </li></ol> 3. 접종 <ol><li> 그들의 최초의 잎 단계 (ca. 십사일 재배 후)에 도달 할 때 식물의 예방. 멸균과 토양 용량 물 식물 증류예방 접종하기 전에 에드 물을 24 시간. </li><li> 잎 스프레이 방식의 경우 conidial 정지 (치료) 또는 0.1 % 트리톤 - X 100 (제어) 잎의 adaxial (위쪽) 표면에 사람들이 포화에 도달 할 때까지를 적용 할 수동 분무​​기를 사용합니다. 토양에 conidial 결선을 피하기 위해 알루미늄 호일로 냄비의 상단을 커버. 분사 후, 곰팡이 침략을 촉진 습도의 높은 수준을 유지하기 위해 24 시간을위한 비닐 봉지에 식물을 다룹니다. </li><li> 토양 물약 방법에 대해 conidial 정지 (치료)의 10 ML 또는 0.1 % 트리톤 - X 100 (제어) 공장의 바닥에있는 흙의 표면합니다.을 적용하기 위해 눈금 실린더를 사용하여 </li><li> 예방 접종 후, 무작위로 전체 블록 디자인을 주선 성장 방으로 식물을 반환합니다. 이하 사보다 추가 실험 블록이 같은 실험에서, endophytic 식민지의 평가뿐만 아니라, 식물 성장의 평가를 허용하도록 설치해야합니다. </li></ol> 4. 건강 검진 보고서uations <ol><li> 무작위 순서로 블록을 선택 한 번에 실험 한 블록을 평가합니다. 이 하루에 평가 될 수없는 대규모 실험에 특히 중요합니다. </li><li> 식물을 처리하기 전에 측정하고 기지에서 꼭대기의 분열 조직과의 높이를 기록합니다. 그런 다음, 신중하게 근절하고 수돗물을 실행에 철저하게 씻는다. </li><li> 각 공장, 샘플에서 두 전단지, 루트 두 가지와 줄기의 두 조각. 식물의 최초의 잎에서 무작위로 전단지 샘플을 선택합니다. 그런 다음, 식물의 중간에서와 토양 표면 근처에서 두 줄기 샘플, 3cm 길이의 각을 구하십시오. 마지막으로, 루트의 중간에서와 루트 끝 뒤에 1cm에서, 또한 3cm 길이 각각 두 개의 직근 샘플을 얻습니다. 적절하게 세 가지 종이 봉투 및 레이블에 샘플을 배치합니다. </li><li> 블록에있는 모든 식물을 세탁 및 샘플링 후, 다음, 잎을 처리하여 뿌리를 시작하고 마지막으로 줄기. </li><li> t를 검사 표면위의 1.1에서와 같이 무균 층류 후드에 문제를 해결합니다. 멸균 증류수에 침수하여 각 샘플을 세 번 씻어 살균 수건 종이에 말 리도록 해. 그런 다음 해부 및 endophytes은 소독제와의 접촉으로 인해 제거되었을 수있는 곳, 그 바깥 쪽 가장자리를 폐기하십시오. </li><li> 줄기와 뿌리에 잎과 6mm 길이에 대한 6x6 mm의 평균 여섯 부분으로 다듬어 샘플을 잘라 버릴거야. 판 2 밀리그램 / L 각에서 항생제의 테트라 사이클린, 스트렙토 마이신과 페니실린을 보충 PDA 미디어 60mm 페트리 접시에 여섯 섹션을 제공합니다. parafilm으로 판을 봉쇄하고 25 어둠 속에서 길러 ° C.를 각 공장은 여섯 접시, 두 당 공장의 일부를 얻을. </li><li> 특정 식물 부분의 각 블록을 처리 한 후 물을 씻어 변경합니다. 폐기하기 전에 사용 린스 물, 음식 ° C는 살균 성공을 25 10 일간 PDA 미디어 및 배양에 100 μl 샘플을 평가합니다. 곰팡이 성장이 ensues 경우, 분석에 해당하는 샘플을 고려하지 않습니다. </li><li> 곰팡이 성장을 관찰하고 기록하기 위해서는 20 일 동안 판 매 2-3 일 검사합니다. 소비세와 송금 공장 섹션 신선한 PDA를 포함하는 접시에 곰팡이 endophytes의 존재를 전시. 이것은 원래 판에 인접한 공장 섹션의 오염을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 기록 B. 식물 섹션에서 bassiana 성장. Beauveria bassiana는 특성 흰색 조밀 mycelia는 가장자리에 연한 노란색으로 크림이 될 때 추가로 식별 할 수 있습니다. 의심, 물 한 방울에 표본을 마운트 종의 특성 구형의 conidia과 지그재그 모양의 conidiophores, 찾고, 현미경으로 검사합니다. </li><li> 식물 바이오 매스에 대한 치료의 영향을 평가하기 위해 추가 실험 블록을 사용합니다. 첫째, 기지에서 꼭대기의 분열 조직의 상단에 자신의 높이를 측정합니다. 그런 다음, 신중하게 근절하고 수돗물에 식물을 씻어하고 건조 중량을 결정하기 위해 사흘 동안 45 ° C에서 그들을 건조 보자. </li></ol>

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</ol>

제작자들은 더 경쟁 금융 이익이 없다는 점 선언합니다.

많은 요소가 endophyte으로 곰팡이 entomopathogen를 구축 할 수있는 실험의 구체적인 결과에 영향을 미칠 수있다. 결과는 접종 방법이 그 중 하나입니다 보여줍니다. 과 실험 생물 요소는 작물 종이나 개량 품종 선택하고 곰팡이 entomopathogen 종 변형을 포함하거나 사용 격리. 조작 고려해야 할 다른 요소는 inoculum의 농도, 예방 접종 동안 식물의 연령, 식물의 성장 조건이 포함되어 있습니다. 이 곰팡이 entomopathogen 14,17,18,21하여 체계적 식물의 식민지가 발생하는 접종 방법에 적합 할 것입니다. 대신, 접종 방법은 현지 식민지의 특정 패턴을 선호하는 경향이있는 것 같습니다. 토양 drenches 루트 식민지 17 선호하는 반면 커피에서 예를 들어, 잎 스프레이는 잎 식민지를 선호. 우리는 일반적으로 빈에서 동일한 패턴을 발견했다. 결국, 접종 방법의 선택은해야합니다아마 대상 herbivore 또는 식물 병원체의 틈새 시장을 일치 공장 내에서 endophyte의 의도 위치별로 안내. 미디어 문화에 따라 비록 일반적으로 사용되는, endophyte 감지 및 정량화는 비용이 많이 드는 어려운 및 오류 발생하기 쉬운 수 있습니다. 예를 들어, 10800 식물의 부분 (1,800 배양 접시에 도금)의 총 B.를 최적화하는 실험에서 평가 된 바나나 16 bassiana 예방 접종. 이 중에 4,496 섹션은 putative B.에 의해 식민지되었습니다 bassiana는 등 주로 식민지의 형태에 의해 식별. 분명, 각 식민지의 종의 미세 인증은 바람직하지만 unaffordable 단계이었습니다. 한편, 1176 섹션은 다른 곰팡이에 의해 식민지되었으며 폐기 및 데이터 (16) 누락으로 처리되었다. 확률은 B. 그러나, 존재 bassiana는 가난한 경쟁이나 성장 속도가 느린이었고, 결국 그 섹션에서 부상 할 수있는 경우llowed 충분한 시간. 따라서, 미디어 문화에 따라 endophyte 감지 방법은 잘못된 반응과 거짓 네거티브 필름이 적용됩니다. 따라서, 예를 들어, 더 신뢰할 수있는 탐지 및 정량화 방법의 개발은 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) assays 20,21,24에 따라 사람들은 잘 정당화된다. 접종 실험의 궁극적 인 목표는 herbivory 및 / 또는 질병에 대한 내구성이 전신 저항을 제공하는 효율적인 치료를 개발해야합니다. 그럴듯하지만 아직까지는 untested, 가설은 endophytic 식민지의 범위는 endophyte로 인한 저항의 범위와 긍정적 인 상관 관계를해야한다는 것입니다. 접종 방법을 수정 한 후 자연 다음 단계는 않으므로,이 상관 관계를 조사 할 수 있습니다. 여러 비디오 프로토콜은 연구자 대상 해충이나 병원균 29-31에 적합한 저항 분석을 설계 할 수 있습니다. 궁극적으로, 그것은 inocula의 성공을 결정합니다 어떤이 검정입니다기 방법, 그리고 endophytic 생물학적 방제를위한 관련 가능성.

곰팡이 entomopathogens는 mycopesticides 1로 상당한 잠재력을 지닌 곤충 집단의 중요한 조절기입니다. 최근에, 그러나, 곰팡이 entomopathogens이 endophytes 모두 자연스럽게 다양한 접종 방법 2 반응으로 발생하는 표시되었습니다. endophytic 곰팡이 entomopathogens의 생태 기능은 대부분 알 수없는 남아 있지만, 일부 연구는 식물의 성장 3,4, herbivore 저항 5-8, 질병 저항 9,10에서 그들을 연루 있습니다. 여기에 제시된 방법의 전반적인 목적은 endophytic 생물학적 방제의 후속 평가에 대한 준비, endophyte로 곰팡이 entomopathogen을 소개하는 것입니다. Beauveria bassiana (Balsamo) Vullemin (Ascomycota : Hypocreales)는 최고의 연구 endophytic 곰팡이 entomopathogen 5-9,11-19이며, 상업 mycopesticide로 사용할 수 있습니다. 접종 방법은 확립 테스트 <em&gt; B. endophyte으로 bassiana는 토양 drenches 14,17, 종자 코팅 18 immersions 14 잔뿌리 드레싱 13,15, 루트와 rhizome immersions 11,16,18, 줄기 주사 17, 잎 스프레이 14,17,20와 꽃 스프레이 19 등이 있습니다. 이러한 방법을 사용하여, 연구자들은 B.를 도입 한 bassiana 바나나 11, 콩 7, 카카오 13, 커피 17, 옥수수 7면 7, 날짜 야자 12, 주트 사람 21 아편 양귀비 20, 호박 7 radiata 소나무 18 수수 14, 토마토 7 밀 7에. 최근 증거 endophytic B.를 제안 bassiana는뿐만 아니라 arthropod 해충 5-7,22-27에서 식물을 보호 할 수있는 잠재력을 가지고 있지만, 일부 식물 병원균 9. 일반 콩 (Phaseolus vulgaris의)는 해충에 가장 취약한 작물 사이에 위및 질병. 그것은 그의 공격 지역 28에서 가장 제한 콩 생산 요소로 생각됩니다 400 개 이상의 해충 200 병원균에 의해 영향을받을 수 있습니다. 따라서, 일반적으로 콩은 B.에 의해 endophytic 생물학적 방제의 전체 스펙트럼을 조사하는 훌륭한 모델 작물 될 수 있습니다 bassiana. 이 방향으로 첫 번째 단계로,이 글은 일반적인 콩의 endophyte로 B.bassiana을 소개 접종 방법으로 잎 스프레이와 토양 drenches에 대해 설명합니다.

<table><tr><tbody><td colspan="4">REAGENTS</td></tr> <tr><td>시약/재료 회사 이름</td><td></td><td>카탈로그 번호</td><td></td></tr><tr><td>Mycotrol SE </td><td>Laverlam</td><td>4167</td><td></td></tr><tr><td>Noble 한천</td><td>Sigma</td><td>A5431-250G</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 G 나트륨 염</td><td>Sigma</td><td>P3032-25MU</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시(100 x 15mm)</td><td>Fisher</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시 (60 x 15 mm)</td><td>Fisher</td><td>08-757-13A</td><td></td></tr><tr><td>감자 포도당 한천</td><td>Difco</td><td>213400</td><td></td></tr><tr><td>일반 표백제 (NaOCl)</td><td>CLOROX</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>스트렙토마이신 설페이트 소금</td><td>시그마</td><td>S6501-25G</td><td></td></tr><tr><td>테트라사이클린</td><td>시그마</td><td>T3258-25G</td><td></td></tr><tr><td>트리플 모과 (NPK)</td><td>ABOCOL</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X-100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Biological safety cabinet</td><td>NuAire</td><td>NU-425-600</td><td></td></tr><tr><td>혈구계</td><td>Fisher</td><td>02-671-10</td><td></td></tr><tr><td>Leica DM LB 현미경</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

endophytes로 곰팡이 entomopathogens 구축 : endophytic 생물학적 방제 향해

Establishing Fungal Entomopathogens as Endophytes: Towards Endophytic Biological Control

Beauveria bassiana는 endophytically 식물을 이식 할 수있는 능력을 곰팡이 entomopathogen입니다. endophyte, B.로 bassiana는 herbivory과 질병으로부터 식물을 보호하는 역할을 재생할 수 있습니다. 이 프로토콜은 B.를 설정하는 두 가지 접종 방법을 보여줍니다 endophytic 생물학적 방제의 후속 평가에 대비 일반 콩 (Phaseolus vulgaris)에 endophytically bassiana. 식물은 B.를 받고 2 주 후면에 표면 소독 종자에서 재배 10 8 conidia / ML (또는 물)의 bassiana 치료는 잎 스프레이 또는 토양 물약으로도 적용했습니다. 2 주 후에 식물 수확을하고 있으며 잎, 줄기 및 뿌리는 endophytic 곰팡이 식민지을 평가하는 샘플입니다. 이 경우, 샘플은 개별적으로 여러 부분으로 절단, 소독 표면되며, 20 일 동안 감자 덱스 트로 오스 한천 미디어에서 incubated. 미디어로 곰팡이 성장을 관찰 할 때마다 2-3일 검사를식물 섹션과 sociated와 B의 발생을 기록 bassiana는 endophytic 식민지의 범위를 측정합니다. 접종의 성공 분석은 B.의 발생을 비교 트리트먼트와 컨트롤에서 특정 식물의 부분에서 bassiana (예 : 잎, 줄기 또는 뿌리). 접종 방법뿐만 아니라, 실험의 구체적인 결과가 대상 작물 종이나 다양한에 따라 달라질 수 있습니다, 곰팡이 entomopathogen 종 변형 또는 사용 분리 및 식물의 성장 조건.

B. bassiana는 P.을 endophytically - 이식 할 수있었습니다 증명 접종 트리트먼트 (그림 1)에 대응 vulgaris. 잎 스프레이와 토양 drenches 모두 B.에 의해 endophytic 식민지 결과 처리 식물의 80 %에 bassiana (그림 2). 그러나, 식민지의 정도는 평가 공장 부분 및 사용 접종 방법에 의존한다. 잎은 스프레이 예방 접종에 가장 응답했습니다. 뿌리는 반면에, 만 물약 예방 접종에 응답했습니다. 마지막으로, 줄기 모두 접종 방법에 유사하게 대응했다. B.는 bassiana는 제어 공장 섹션 중 하나에 발견되지 않았습니다. B. 이외의 치료, endophytes의 독립 bassiana는 평가 플랜트 섹션의 15 %에서 증가하지만, 그 주변 부분을 침공하고 결과에 영향을 줄 수 전에이 미디어 판에서 로그 해부했다. 치료 및 제어 식물 두 주 예방 접종 후 가시적 구분할 수 있었다. 어떤 차이는 자신의 건조 무게와 높이 감지되지 않았습니다. <img src="/files/ftp_upload/50360/50360fig1.jpg" alt="그림 1"/> 1 그림. Beauveria bassiana의 콩 식물의 endophytic 식민지 (. Phaseolus vulgaris CV Calima)에 접종 트리트먼트 대표 결과 왼쪽 상단 :. 제어없이 성장과 접시. 오른쪽 상단 : 전체 판을 오염 공장 섹션에서 곰팡이 endophyte. 왼쪽 하단 : B. bassiana 두 개의 공장 섹션에서 성장. 오른쪽 하단 : Endophytic B. bassiana conidia와 conidiophores은 현미경으로 본 적 있어요. <img src="/files/ftp_upload/50360/50360fig2.jpg" alt="그림 2" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50360/50360fig2highres.jpg"/> 그림 2. BEA의 endophytic 식민지에 접종 트리트먼트 효과변형 가나와 예방 접종 후 Beauveria bassiana 두 주에 의해 N 식물 (Phaseolus vulgaris 이력서. Calima가). 비율 식민지는 교양 섹션의 수로 나눈 식민지 식물 섹션의 수를 나타냅니다.

이 프로토콜은 곰팡이 entomopathogen을 소개하는 두 접종 방법을 보여줍니다<em&gt; Beauveria bassiana</em&gt; 일반 콩에 endophyte로 (<em&gt; Phaseolus vulgaris</em&gt;), endophytic 생물학적 방제의 후속 평가에 대한 준비 인치

Endophytes로 곰팡이 Entomopathogens 구축 : Endophytic 생물학적 방제 향해

 Beauveria bassiana is a fungal entomopathogen with the ability to colonize plants endophytically. As an endophyte, B. bassiana may play a role in ...

안녕하세요. 저는 국제열대농업센터(CIAT) SEA의 곤충학자 Ush Parsa입니다. 저는 마찬가지로 국제열대농업센터 소속인 ViiV Artiz이며, 저는 미국 농무부(USDA)의 Fernando Vega입니다. 이 영상의 전반적인 목적은 곰팡이 병원균의 정착을 촉진하고 검증하는 방법을 시연하는 것입니다.내생균으로서, 자연계에서 병원성 곰팡이에 감염된 곤충이나 응애를 발견하는 것은 흔한 일이며, 이러한 곰팡이 엔토모파토젠(entomopathogens)을 생물학적 살충제로 사용해 온 오랜 역사가 있습니다. 최근에는 곰팡이 엔토모파토젠이 식물에 감염되어 있으면서도 겉으로 드러나는 증상을 일으키지 않는 경우가 가끔 발견되고 있습니다. 이러한 발견은 농업 해충에 대항하는 보호 내생균으로서의 활용 가능성을 시사합니다.이러한 잠재력을 탐구하기 위해서는 먼저 표적 작물에서 곰팡이 병원균을 내생균으로 안정적으로 정착시킬 수 있는 접종 방법을 개발하는 것이 필수적입니다. B Bassiana는 가장 잘 연구된 곰팡이 병원균 중 하나이며, 살충제 형태의 상업적 제품으로 쉽게 구할 수 있습니다. 이 곰팡이는 바나나, 커피, 메이스를 포함한 많은 식물 종에서 내생균으로 검출된 바 있습니다.최근의 증거에 따르면 B bassiana는 절지동물 해충뿐만 아니라 일부 식물 병원균으로부터 식물을 보호할 잠재력을 가지고 있습니다. 이러한 광범위한 보호 작용을 설명하는 메커니즘은 아직 충분히 밝혀지지 않았습니다. 그럼에도 불구하고, 해충이나 병원균에 대한 유전적 저항성이 없는 작물에 유망한 대안이 될 수 있으며, 특히 fas vulgaris와 같이 여러 적의 공격을 동시에 받는 일반적인 작물 사례에 있어 더욱 그러합니다.이는 400종 이상의 해충과 200종의 병원균의 영향을 받을 수 있으며, 이러한 공격은 여러 지역에서 콩 생산을 제한하는 가장 결정적인 요인으로 생각됩니다. 이러한 이유로, 일반 콩이 Endo bbar의 보호 잠재력을 조사하기 위한 좋은 후보 작물이 될 수 있다고 판단하였습니다. 이 방향으로 나아가는 첫 단계로서, Arvid는 Bana를 내생균으로 정착시키기 위한 접종 방법으로 엽면 살포와 토양 관주의 효능을 입증합니다.TOMA라고 불리는 강낭콩 품종의 종자를 0.5% sodium hypochlorite에 2분간 침지하여 표면 살균한 후, 70% ethanol에 2분간 침지하고 멸균 증류수로 3회 세척하여 살균 성공 여부를 확인합니다. 세척액 100 µL 샘플을 PDA 배지가 담긴 100 mm Petri plate에 도말하고 25 °C의 암실에서 10일 동안 배양합니다. 이 대조군에서 균 성장이 관찰되면 실험을 중단하고 다시 시작해야 합니다.종자는 토양과 모래를 2:1 비율로 혼합하여 증기 멸균한 직경 11.5 cm 화분에 3립씩 파종합니다. 식물은 발아 일주일 후부터 25 °C, 상대 습도 50%, 광강도 9,200 lux의 조건에서 12시간 광주기로 제어된 환경에서 재배합니다. 식물의 활력을 보장하고 경쟁을 제거하기 위해 화분당 한 개체만 남기고 솎아줍니다.2~3일마다 필요에 따라 관수하고, 식재 후 10일과 20일에 6 g/L 농도의 NPK 비료 수용액으로 시비합니다. 균주의 유전적 균일성을 확보하기 위해, 분리주는 단일 콜로니 배양물로부터 증식시켜야 합니다. 진균의 기원이 균종이 발생한 곤충인 경우, 표본을 층류 정화대(laminar flow hood)로 옮긴 후 백금이를 사용하여 포자를 형성하는 균사의 소량을 PDA 배지로 접종합니다.표적 진균이 깨끗한 배양물에서 성장하고 포자를 형성하고 나면, 오염 물질을 제거하기 위해 새로운 배지 플레이트로 여러 번 계대 배양하는 과정이 필요할 수 있습니다. 소량의 포자를 0.1% Triton X 100 수용액 1 mL에 현탁하고 볼텍싱합니다. Triton X 100은 계면활성제로, 물의 표면 장력을 낮추어 포자가 분산되도록 돕습니다. 이 현탁액 100 µL를 2.5% noble agar가 얇게 도말된 100 mm 페트리 플레이트에 도포하며, 이를 통해 실체 현미경으로 포자를 관찰할 수 있습니다.플레이트를 암실 내 상온에서 24시간 동안 배양한 후, 발아한 단일 펜 배지를 PDA 배지 플레이트로 옮겨 배지 플레이트 전체를 덮고 포자를 형성할 때까지 3~4주 동안 배양합니다. 이 방법은 후속 실험을 위해 곰팡이의 순수 배양액을 확보하는 과정을 제공합니다. 본 시연에서는 상용 제품인 Microt에서 얻은 Beauveria bassiana GH HA 균주의 순수 배양액을 사용합니다.접종원은 무균 조건에서 준비합니다. 층류 정화대(laminar flow hood) 내에서 멸균된 스패튤라를 사용하여 배지 표면에서 약 1g의 진균 성장물을 긁어내어 멸균된 0.1% Triton X 10mL에 현탁합니다. 현탁액을 1분 동안 볼텍싱(vortex)하고 멸균된 치즈클로스로 여과하여 균사체에서 포자를 분리합니다. 이 단계를 통해 얻은 포자 현탁액은 접종을 위해 최종 농도가 10⁸ spores/mL가 되도록 조정해야 합니다.먼저, kedia의 계수를 용이하게 하기 위해 연속 희석을 통해 스톡의 농도를 추정합니다. Hema Cytometer에서 스톡 100 µL를 0.1% Triton X 900 µL에 희석하고 볼텍싱하여 10배 희석액을 만듭니다. 이 과정을 총 3회 더 반복하여 10,000배 희석액을 얻습니다.첫 번째 희석액에는 Kedia가 매우 많이 존재하며, 마지막 희석액에는 쉽게 셀 수 있을 만큼 적은 수가 존재하게 됩니다. Hema cytometer의 두 챔버 각각에 10,000배 희석액 10 µL를 넣고 현미경 아래에 배치하여 kedia를 측정합니다. Hema Cytometer의 격자 영역은 9개의 큰 정사각형으로 구성되어 있으며, 각 정사각형은 각각 100 nL 또는 0.0001 mL를 수용합니다.시료 내 ED 농도를 추정하기 위해, 각 챔버의 네 모서리에 있는 큰 사각형 구역 내의 ED 수를 세어 평균을 낸 뒤, 그 평균값을 0.0001로 나눕니다. 이 농도에 희석 배수 10,000을 곱하면 스톡 농도가 산출되며, 이제 스톡을 조정해야 할 최종 부피를 계산합니다. 밀리리터당 10 38 edia의 접종액을 얻기 위해 다음 공식을 적용합니다.최종 부피는 스톡 부피에 스톡 농도를 곱한 값을 최종 농도로 나눈 값과 같습니다. 본 시연에서는 원하는 농도를 얻기 위해 스톡의 최종 부피를 195.5 milliliters로 조정해야 합니다. 접종원을 사용하기 전, 운하의 생존력을 평가하는 발아 테스트를 수행하는 것이 중요합니다.이 테스트를 위해, 1/10,000 희석액 100 µL를 2.5% noble egg 또는 배지가 담긴 100 mm 페트리 플레이트에 접종합니다. 멸균된 유리 막대를 사용하여 샘플을 배지 표면에 도말한 후, 25 °C의 암소에서 24시간 동안 배양합니다. 발아관이 성장한 배지의 비율을 추정하여 현미경으로 생존력을 평가합니다.무작위로 추출한 100개의 캐나다 샘플 3개에 대해, 평균 발아율이 90% 이상인 경우에만 캐나다 현탁액을 접종에 사용할 수 있습니다. 본 시연에서는 평균 발아율이 97%인 것을 확인하였습니다. 식물이 첫 번째 본잎 단계에 도달했을 때 적용하는 엽면 살포와 토양 관주라는 두 가지 접종 방법을 시연하겠습니다. 식재 후 약 14일 뒤에 엽면 살포법을 수행하며, 수동 분무기를 사용하여 잎이 포화될 때까지 잎의 뒷면이나 윗면에 현탁액을 분사합니다. 토양으로 액체가 흘러내리는 것을 방지하기 위해 각 화분의 윗부분을 알루미늄 호일로 덮습니다. 살포 후에는 균의 침입을 용이하게 하기 위해 습도를 높게 유지하도록 각 식물을 비닐봉지로 24시간 동안 덮어둡니다.토양 관주 접종법은 토양 수분 용량 상태에서 수행됩니다. 식물을 토양 포화 상태까지 관수한 후 약 24시간이 지나면, 10 milliliters의 균현탁액을 토양 표면에 처리합니다. 대조군 식물의 기부에는 해당 처리군과 동일한 방식으로 멸균된 0.1% Tritton X를 처리합니다.식물을 생장 챔버로 옮기고 처리당 3반복의 난괴법(randomized complete block design)으로 배치하였습니다. 접종 2주 후, 한 블록씩 정착 여부를 평가하였습니다. 식물을 조심스럽게 수확하고 각 식물을 흐르는 수돗물로 개별 세척하였습니다.엽편 두 개, 뿌리 두 부분, 줄기 두 부분을 샘플링합니다. 엽편은 식물의 첫 번째 진성엽에서 무작위로 선택하여 정사각형 모양으로 다듬습니다. 줄기 샘플은 식물의 중간 부분과 토양 표면 근처에서 약 3 cm 길이로 채취합니다. 주근 샘플은 뿌리의 중간 부분과 뿌리 끝에서 1 cm 떨어진 지점에서 비슷한 길이로 채취합니다.각 시료는 멸균 후드 내에서 0.5% sodium hypochlorite로 2분 동안, 이어서 70% ethanol로 2분 동안 개별적으로 표면 멸균한 후, 멸균 증류수로 3회 세척하고 건조시킵니다. 이후 멸균된 거름종이 위에서 멸균된 시료를 조심스럽게 절개하여, 소독제와의 접촉으로 인해 내생균이 제거되었을 수 있는 바깥쪽 가장자리 부분을 제거합니다. 다듬어진 시료는 잎의 경우 평균 6x6 mm, 줄기와 뿌리의 경우 길이 6 mm의 작은 조각으로 자릅니다.절편들을 각 2 mg/L의 tetracycline, streptomycin 및 penicillin 항생제가 첨가된 PDA가 들어있는 60 mm 페트리 접시에 도말합니다. 마지막으로, 접시를 파라핀으로 밀봉하고 25 °C의 암소에서 배양합니다. 각 블록을 처리한 후 헹굼물을 교체하며, 표면 살균이 성공적으로 이루어졌는지 확인하기 위해 100 µL의 시료를 100 mm 페트리 접시의 PDA 배지에 도말하여 25 °C에서 10일 동안 배양합니다.이 대조군에서 성장이 관찰되면, 해당 블록은 폐기하고 분석 대상에서 제외합니다. 곰팡이 성장을 관찰하고 기록하기 위해 20일 동안 2~3일마다 플레이트를 검사합니다. 군락이 형성된 식물 절편은 주변 절편의 오염을 방지하기 위해 각각 절단하여 새로운 배지 플레이트로 옮깁니다.B bassiana의 성장은 가장자리가 크림색 또는 옅은 노란색으로 변하는 특징적인 흰색의 조밀한 균사체를 기반으로 기록됩니다. 모호한 경우, 균락 형성 평가 당일에 샘플을 현미경 광원의 물 한 방울에 마운트하여 해당 종의 특징인 전반적인 스카니아(scania) 및 지그재그 형태의 케디아 포스(kedia force)가 있는지 검사합니다. 또한, 처리군이 식물 성장에 미치는 영향도 추정합니다.먼저 식물의 기부부터 생장점의 끝까지 식물 높이를 측정합니다. 그런 다음 식물을 조심스럽게 뽑아 수돗물로 세척하고, 45 °C에서 3일 동안 건조시켜 건조 중량을 측정합니다. 본 시연을 위해 전체 실험을 두 번 수행하여 대표성 있는 결과를 얻었습니다.두 가지 접종 방법 모두 처리된 식물의 80% 이상에서 Bana에 의한 물리적 정착을 유도하였습니다. 하지만 정착 정도는 평가된 식물 부위와 사용된 접종 방법에 따라 달랐습니다. 잎에서 가장 좋은 반응을 보였습니다.반면, 뿌리는 관주 접종에만 반응하였으며, 분무 접종에는 반응하지 않았습니다. 마지막으로 줄기는 두 접종 방법 모두에 유사하게 반응하였습니다. 대조군 식물 부위에서는 처리된 내생균 외에 Bana가 검출되지 않았으나, 평가된 식물 부위의 15%에서 Bana가 군집을 형성하였습니다. 하지만 이들은 인접한 부위로 침투하여 결과에 영향을 주기 전에 배지 플레이트에서 절제되었습니다.접종 2주 후 처리군과 대조군 식물은 외관상 구분이 불가능했으며, 건조 중량과 초장에서도 유의미한 차이가 검출되지 않았습니다. 내생 병원균을 최종 효과로 확립하는 실험의 특정 결과에는 많은 요인이 영향을 미칠 수 있습니다. 본 영상에서 보여주듯이 접종 방법이 그중 하나이며, 실험 가능한 생물학적 요인으로는 선택한 작물 종 또는 품종, OMA 병원균 종 또는 분리주의 선택 등이 있습니다. 조절을 고려해야 할 다른 요인으로는 접종원의 농도, 접종 시 식물의 연령 및 식물의 생육 조건 등이 있습니다.이 실험들의 궁극적인 목표는 INE 또는 질병에 대해 지속적인 전신 저항성을 제공하는 효율적인 처리 방법을 개발하는 것이어야 합니다. 내생균(Endophyte) 매개 저항성을 테스트할 준비가 되었다면, Journal of Visualized Experiments에 게시된 Herbal Resistance Mechanisms의 특성을 다룬 영상을 시청하시기를 권장합니다. 내생균은 식물에서 매우 흔하게 발견되며, 표적 진균 병원균을 내생균으로 지속적으로 정착시키고 검출하는 능력에 영향을 미칠 가능성이 높다는 점에 유의하십시오.이 시연 영상이 유용하게 활용되기를 바랍니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 기원합니다.

establishing-fungal-entomopathogens-as-endophytes-towards-endophytic

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

여기서는 농업에서 해충 방제를위한 "최적의"곤충 병원성 균류 인 Metarhizium anisopliae 의 분리, 확인, 스크리닝 및 선택을 포함한 효과적인 제균제 개발에 관한 지식 기반 개발과 관련된 여러 단계를보고합니다 .

개발<em&gt; 메타 리지 움 anisopliae</em&gt; Mycoinsecticide로서의 : 분리에서 현장 성능까지

여기서 우리는 토양 샘플에서 entomopathogenic 균류 (EPF)를 분리하고 선택하는 데 사용 된 식사 벌레 (Tenebrio molitor)-미끼 시스템을 기반으로 프로토콜을 제시합니다. 효과적인 코니디아 번호(ECN) 포뮬러는 현장에서 해충 미생물 조절을 위한 생리적 특성에 기초하여 높은 스트레스 내성 EPF를 선택하는 데 사용된다.

토양 샘플에서 내토모 병원성 곰팡이의 격리 및 선택 및 곤충 해충에 대한 곰팡이 독성의 평가

Entomopathogenic 진균은 농업 곤충 해충의 생물학적 방제제로서 중요성을 얻고있다. 이 연구에서, 곤충 해충에 대한 상업적 적용을 위해 Metarhizium robertsii 및 M. pinghaense 둘 다의 남아프리카 단리물의 충분한 수의 탄력적 감염성 프로파굴레의 대량 생산은 농산물 곡물 제품을 사용하여 성공적으로 수행되었다.

곤충 해충에 대한 상업적 적용을위한 Entomopathogenic Fungi, Metarhizium robertsii 및 Metarhizium pinghaense의 대량 생산

엔토모병원성 진균 콜로니는 테네브리오 미끼, 갤러리아 미끼 및 선택적 인공 배지, 즉 클로람페니콜, 티아벤다졸 및 시클로헥시미드(CTC 배지)로 보충된 효모 추출물이 풍부한 감자 덱스트로스 한천을 사용하여 열대 토양 샘플로부터 분리된다.

토양 샘플에서 엔토모병원성 곰팡이를 분리하는 방법의 비교

Entomopathogenic 선충류는 박테리아와 공생하며 함께 선천적 인 면역 체계를 손상시켜 곤충을 성공적으로 감염시킵니다. 선충류 감염의 유전 적 기초에 대한 연구를 촉진하기 위해 엔토모 병원성 선충류를 유지하고 유 전적으로 조작하는 방법이 설명됩니다.

Entomopathogenic Nematodes 배양 및 유전자 조작

토양의 불투명도로 인해 구성 미생물 간의 상호 작용은 세포 분해능으로 쉽게 시각화 될 수 없습니다. 여기에서는 곰팡이 - 미생물 상호 작용을 조사하기위한 새로운 기회를 제공하는 두 가지 미세 유체 도구가 제시됩니다. 이 장치는 다재다능하고 사용하기 쉬우므로 세포 수준에서 높은 시공간 제어 및 고해상도 이미징이 가능합니다.

세포 수준에서 곰팡이 - 미생물 상호 작용을 조사하기위한 미세 유체 도구

현재 논문은 식물 관련 내생균의 분리, 분리물의 장기 보존, 형태학적 특성 분석 및 후속 분자 식별 및 균유전체 분석을 위한 전체 DNA 추출을 위한 상세하고 적절한 프로토콜을 제공하는 것을 목표로 합니다.

Mycoheterotrophic 식물에서 내생균 균류를 식별하기 위한 분리, 특성화 및 전체 DNA 추출

이 프로토콜은 단일유전학적 곤충인 겨자 진딧물(Lipaphis erysimi (Kalt .))에 대한 곤충병원성 곰팡이(EPF)의 효과를 평가하기 위해 최적화된 분리형 잎 생물검정 시스템을 제공합니다. 이 방법은 페트리 접시 실험 중 데이터 수집 프로세스를 간략하게 설명하여 연구원이 겨자 진딧물 및 기타 단일유전 곤충에 대한 EPF의 독성을 일관되게 측정할 수 있도록 합니다.

Parthenogenetic 곤충, 겨자 진딧물, Lipaphis erysimi (Kalt.)에 대한 곤충 병원성 곰팡이의 무균 효과 평가

여기에서 우리는 숲 나무 천공충에서 곤충병원성 균류를 얻기 위한 프로토콜과 딱정벌레목 모델 곤충을 사용하여 곤충병원성 활성을 평가하는 대체 방법을 제시합니다. 이 방법은 자연 산림에서 나무를 뚫는 곤충 해충으로부터 곤충 병원성 곰팡이 자원을 탐사하는 데 효율적이고 편리합니다.

Isolation, Behavioral Identification, and Pathogenicity Assessment of Entomopathogenic Fungi from a Forest Wood Borer(포레스트 우드 보어의 곤충병원성 곰팡이의 격리, 행동 식별 및 병원성 평가)

병원균 Sclerotinia sclerotiorum 및 생물 살충 Bacillus isolates 를 모델 시스템으로 사용하여 진균 병원체에 대한 길항 작용을 나타내는 미생물 천연 제품을 식별하기 위해 박층 크로마토그래피, 직접 생체 자폐 분석 분석 및 액체 크로마토그래피-질량 분석법을 사용하는 방법을 설명합니다.

박층 크로마토그래피에 의한 생물제어를 위한 천연물의 생물학적 분석 유도 식별-직접 생체 자폐 촬영

한천이 함유된 유리 용기에서 변형된 분리엽 방법을 사용하여 고추 총채벌레를 대량 사육하기 위한 분리잎 생물학적 분석 프로토콜이 확립되어 높은 생존율과 동기화된 발달을 보장했습니다. 이 시스템은2nd instar 유충에 대한 곤충병원성 곰팡이 독성을 효율적으로 스크리닝할 수 있으며 실험실, 온실 및 현장 평가를 위한 신뢰할 수 있는 총채벌레 공급을 제공합니다.

곤충병원성 진균의 독성 스크리닝을 위한 고추총채벌레(Scirtothrips dorsalis Hood) 사육 시스템 구축

학습하세요 Beauveria bassiana를 Phaseolus vulgaris에 내생균으로 접종하는 두 가지 방법을. 잎면살포와 토양관수법으로 농업해충 방제를 위한 생물학적 방제 잠재력을 평가하는 기초 연구를 수행합니다.

Endophytes로 곰팡이 Entomopathogens 구축 : Endophytic 생물학적 방제 향해

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