Name: 기능 모티브과 바인딩 파트너 펩타이드 기반의 식별 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 28 s
Description: 학습하세요 HIV-1 Nef 단백질의 기능 모티브를 펩타이드 스캐닝, 세포사멸 분석, 공면역침전법을 사용하여 식별하는 방법을. 이 기법은 펩타이드 기반 억제제 개발과 바이러스 병원성 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 NIH / NIGMS / MBR에 (그랜트 58268), NIH / NCRR / RCMI (부여 G12-RR03034), 조지아 리서치 얼라이언스 자금을 부여 GRA.VAC08.W, NIH / NIAID / NRSA 부여 F31AI091484, 모리 CFAR 교부금 P30에 의해 지원되었다 A1050409. 이 연구는 NIH / NCRR에서 연구 시설 개선 보조금 # C06 RR18386의 지원으로 건설 시설에서 실시되었다. 된 Jurkat 세포 20의 집합 HIV-1 Nef의 펩티드뿐만 아니라, 토끼 반대로 HIV-1 Nef의 항혈청은 NIH AIDS 연구 및 참조 시약 프로그램 (락빌, MD)에서 하였다.

I.는 생물학적 분석에 짧은 펩티드의 사용 I.1. 펩티드를 사용하여 매핑 생물학적 기능 모티프 <ol><li> 네프 스캔 펩티드와 세포 치료 <ol><li> 관심 영역을 스캔 펩티드의 집합을 조달. 우리의 실험, 20mer 펩티드, 10 아미노산 중복와 함께, 전체 HIV-1 Nef의 단백질 (205 AA) 스패닝의 경우, 에이즈 시약 프로그램에서 하였다. 다음과 같은 펩티드는 개별적으로 assayed 있습니다 : </li><li> 10 NG / 세포 배양 매체 펩타이드의 ML을 추가합니다. </li><li> 세포 배양을 인 Jurkat가 접시 당 문화 매체의 10 ML을 추가합니다. </li><li> 37 24 시간 동안 문화를 품어 ° C. </li></ol></li><li> 세포 사멸의 터미널 deoxynucleotidyltransferase - 중재 dUTP 비오틴 닉 엔드 라벨 ​​(TUNEL) 분석 <ol><li> 1X PBS로 세포를 씻어 1X PBS, pH를 7.4에서 4 % 파라 포름 알데히드로 실온에서 30 분간 고정한다. </li><li> 10 1X PBS로 세척하고, 0.1 %로 permeabilize 트리톤 X-100실온에서 분. </li><li> 1X PBS로 두 번 세포를 씻어. </li><li> 컴퓨터 제어 현미경 시스템에 epifluorescence에 의해 스테인드 세포를 계산합니다. </li></ol></li></ol> I.2. 펩티드를 사용하여 경쟁 억제 분석 <ol><li> 전차 단백질 배달 시약 키트를 사용하여 펩티드의 공동 형질 전환 <ol><li> 형질 반응 혼합물 당 ​​100 μL의 최종 볼륨, wtNef-GFP 플라스미드 DNA 1 μg과 야생형 SMR 도메인에서 파생 된 펩티드, 또는 SMR 모티프의 개별 아미노산 알라닌 - 교환을 포함하는 펩티드도 100 NG를 희석 1X PBS. </li><li> 멸균 물 100 μL의 최종 볼륨에 전차 시약의 1 / 10 희석 6 μl를 희석하고 희석 DNA-펩타이드 혼합 결합합니다. </li><li> 전차 / DNA-펩타이드 복합체의 형성을 할 수 있도록 30 분 동안 실온에서 알을 품다. </li><li> 5 분 600 XG에서 원심 분리하여 펠렛 3 × 10 5 된 Jurkat 세포. </li><li> 1X PBS로 두 번 세포를 씻으, 그리고 전차 / DNA-펩타이드 복합체에 resuspend을. </li><li> 서스펜션에 혈청 RPMI 1640 배지 400 μl를 추가하고 2 시간 동안 37 ° C에서 배양 접시에 세포를 품어. </li><li> 각 플레이트에 10 % FBS를 포함하는 신선한 RPMI 1640 배지 1 ㎖를 추가하고, 37에서 48 시간 동안 세포를 품어 ° C. </li><li> 수확 세포와 형광 현미경으로 형질 전환 효율을 결정합니다. </li></ol></li><li> 펩티드 억제 NEF-GFP 분비 형광 플레이트 리더 분석 <ol><li> 수확 된 세포에서 세포 무료 에어컨 미디어를 수집하고, 96 - 웰 블랙의 microtiter 플레이트의 각 웰에 100 μl를 전송합니다. </li><li> 여기 파장 485 nm의 발광 파장 상대 형광 단위 515 m로 TECAN GENEios의 fluorimeter의 미디어 측정 GFP 형광. </li><li> 컨트롤의 GFP 형광의 레벨 (세포 미디어 네프-GFP와 공동 형질과 펩타이드를 스크램블 설정) 100 %. </li><li> 세포 미디어 네프-GFP 분비의 변화를 결정하기 위해 다양한 SMR 펩타이드와 공동 형질에서 GFP 형광의 수준이 비교할 수 있습니다. </li></ol></li></ol> I.3. 미끼로 펩티드를 사용하여 주제 바인딩 파트너를 분리 <ol><li> SMR 펩타이드와 공동 immunoprecipitation의 <ol><li> 37 10 % FBS가 포함 된 RPMI 1640 배지로 된 Jurkat 세포를 성장 T-75 조직 배양 플라스크에 ° C, 4시 20 분 1,000 XG에서 원심 분리하여 펠렛 세포 ° C. 형질 전환 효율을 결정, 형광 현미경으로 접시를 배치하여 이미지를 캡처하고, 이후 전체 및 라벨 세포를 세어 백분율 표시 셀을 결정합니다. </li><li> 1 ML 1X PBS로 세포 펠렛을 resuspend을, 그리고 1.5 ML 에펜 도르프 튜브로 전송할 수 있습니다. 1 분 1,000 XG에서의 microcentrifuge. 부드러운 피펫 1 ML α-FLAG 용해 버퍼에 펠렛을 resuspend을. 용해 버퍼 : 혼합 50 MM 트리스 • 염산 산도 7.4, 150 MM의 나트륨 CHLoride [염화나트륨] 1 밀리미터 phenylmethylsulfonyl 불화 포유 동물 세포와 조직 추출물 사용 [PMSF], 10 ML / μL 프로테아제 억제제 칵테일 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 % 트리톤 X-100 [PIC, 시그마]. 사용하기 전에 즉시 확인합니다. </li><li> 차동 5 분 2,000 XG에서의 microcentrifuge 현탁액을 펠렛 ~ 10 분 세포 파편과 DNA, 각각 13,000 XG에서. 상층 액 (이하 &quot;해물&quot;라한다)를 수집. </li><li> 해물 단백질의 1 밀리그램 SMRwt 또는 SMRmut 펩타이드 안티-FLAG M2 선호도 젤 (; 시그마 이하 &quot;수지&quot;라고도 함)의 20 μL에 하나의 1 μg을 추가합니다. 여기에 사용 SMRwt 및 SMRmut 모두 펩티드에 포함 된 FLAG 태그 서열을 갖고 있음에주의해야한다. 공동 IP 버퍼 1 ML (α-FLAG 용해 버퍼를 뺀 PMSF 및 PIC)의 최종 볼륨 혼합물을 가져옵니다. 엔드 오버 엔드 회전 ° C 하룻밤에 혼합물을 품어. 음성 대조군으로, 두 펩티드의 부재 수지 해물을 배양한다. </li><li> 펠레T 5,000 microcentrifugation에 의해 수지 - 30 초 8,000 XG. 수지 샘플을 처리하기 전에 2 분 동안 정착 한 후 상층 액을 대기음 할 수 있습니다. 어떤 수지를 전송하지 않도록주의하면서, 좁은 엔드 피펫 팁 또는 해밀턴 주사기 상층 액을 제거합니다. 좁은 엔드 피펫 팁이 부분적으로 닫힐 때까지 플라스틱 피펫 팁의 오프닝을 공략하기 위해 집게를 사용하여 만들 수 있습니다. 500 세척 버퍼의 μL (50 MM 트리스 • 염산 산도 7.4, 150 MM의 염화나트륨).와 수지를 네 번 씻으십시오 세척 버퍼 50 μL의 배 FLAG 펩타이드의 15 μg (시그마)에 바인딩 된 세포 단백질을 용출하고 실온에서 30 분 동안 로커 / 셰이커에 품어. </li><li> Laemmli에 샘플 버퍼 (바이오 래드)에서 비등 다음에 아세톤 침전에 의해 용출액을 집중한다. 4-20% 트리스 - 염산 기준 프리 캐스트 젤 (바이오 래드)을 SDS-PAGE로 단백질을 분리합니다. 쿠마시 브릴리언트 블루 R-250 (바이오 래드)와 젤 얼룩. 참고 : 질량 분광법 식별 실험 ( <stronG&gt; 그림 4A), 각 조건 (SMRwt, SMRmut하거나, 펩티드와 공동-IP)는 사통에서 수행하고, 네 가지의 용출액은 복제 / 총 단백질 입력 4 밀리그램 총 이전 아세톤 침전 풀링 된되었다 조건). </li></ol></li><li> 네프-GFP 단백질과 공동 immunoprecipitation의 <ol><li> 0.02 % 트윈 20 (PBS-T)와 1X PBS 1 ML에 방지 GFP 생쥐 단일 클론 2 μg에 Dynabeads 단백질 G 자석 구슬 (Invitrogen 사)의 50 μl를 섞는다. 4시에 1 시간 동안 1.5 ML Eppendorf의 튜브 엔드 오버 엔드 회전 혼합물을 품어 ° C. </li><li> 자기 풀다운 메뉴가 뜨는을 제거 한 다음 허용하는 1.5 ML MagnaSphere 기술 마그네틱 분리 스탠드 (Promega 사 공사, 매디슨, WI)에 튜브를 삽입하여 버퍼에서 구슬을 분리합니다. 부드러운 피펫을 사용하여 PBS-T의 1 ml의 안티 GFP 코팅 구슬을 씻으십시오. </li><li> M은 15 1X의 RIPA 1 ㎖ + 버퍼 부드러운 피펫 및 배양하여 함께 네프-GFP 형질 전환 된 Jurkat 세포를 용해얼음에있다. RIPA + 버퍼 : 10X RIPA 용해 버퍼, 산도 7.4 [밀리 포아, 베드포드, 매사추세츠】 멸균 물에 희석 1:10 0.02 % 나트륨 아 지드 [시그마] 0.1 % 나트륨 도데 실 황산 [SDS] 1 ㎜ PMSF 10 μL와 / ㎖ PIC는 사용 직전에 추가됩니다. </li><li> 펠렛 10 분 2,000 XG에서 microcentrifugation하여 세포 파편. 상층 액 (이하 &quot;해물&quot;라한다)를 수집. </li><li> 안티 GFP 코팅 비즈 해물 단백질 1 mg의 추가 1X RIPA + 버퍼 1 ML에 최종 볼륨을 가지고, 4 ℃에서 1 시간 동안 엔드 오버 엔드 회전 혼합물을 품어 참고 : 펩타이드 경쟁 연구를 위해, 해물 단백질 1 ㎎을 사전에 방지 GFP 코팅 구슬에 추가되는 1X에서의 RIPA + 버퍼 1 ML에 SMRwt 또는 SMRmut 펩타이드의 2 μg으로 미리 배양 할 수 있습니다. </li><li> 세척 버퍼 1 ㎖에 부유 통해 구슬을 씻으십시오 (50 MM 트리스 • 염산 산도 7.4, 150 MM의 염화나트륨, 0.1 % 트윈 20). 4에서 5 분 ° C.에 대한 엔드 오버 엔드 회전을 품다 비즈 F를 분리ROM 자기 분리 스탠드를 사용하여 세척. 각각 250 mm와 300 mM의 NaCl을을 포함 세척 버퍼로 구슬 두 번째 및 세 번째 시간을 씻으십시오. </li><li> PBS 200 μL에 구슬을 resuspend을, 깨끗한 튜브에 혼합물을 전송하고, 자기 스탠드에 세척에서 구슬을 분리합니다. 95 ° C에서 Laemmli에 샘플 버퍼 5 분 50 μL에 구슬을 삶아, 혼합물을 실온에서 10 분 동안 냉각 할 수 있도록하고 분리 마그네틱 스탠드에 혼합물을 배치하고 상층 액 (이하 &quot;용출액&quot;)를 수집 . </li><li> 8~16% 트리스 - 염산 기준 프리 캐스트 젤에 SDS-PAGE에 의해 용출액의 단백질을 분리합니다. </li></ol></li><li> 질량 분석 <ol><li> 소비세 매시 묻은 젤의 관심의 단백질 밴드. </li><li> 37 45 분 동안 10 mM의 1,4 - 디티 올 트레이 톨 (DTT)에서 샘플을 줄일 ° C. </li><li> 25 45 분 ° C. 55 MM의 요오도 아세트 아미드에 샘플을 Alkylate </li><li> 등급 시도 시퀀싱 하룻밤 샘플을 소화37 psin (Promega 사) ° C. </li><li> C-18 ZipTip (밀리 포아)를 이용하여 시료의 펩티드를 탈염. 알파 CHC 매트릭스 (애질런트 테크놀로지스, 산타 클라라, CA)를 이용하여 시료의 펩타이드를 혼합 MTP 대상 프레임 III (브루 커 달 토닉 주식 회사, 빌리, MA)에 그들을 발견. </li><li> 브루 커 달 토닉 ULTRAFLEX III TOF / TOF를 사용하여 (MALDI-TOF/TOF) 질량 분광법 분석의 비행 직렬 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 시간을 수행 할 수 있습니다. </li><li> MS / MS 데이터 마스코트 알고리즘 (사용 NCBI 비 중복 및 스위스 보호 해주는 데이터베이스에 비교 <a href="http://www.matrixscience.com" target="_blank">www.matrixscience.com을</a> ). </li></ol></li><li> 면역 블롯 분석 <ol><li> 4~20% 또는 8-16% 트리스 - 염산 기준 프리 캐스트 젤 (바이오 래드)을 SDS-PAGE로 단백질 샘플을 분리합니다. 니트로 셀룰로오스 막에 전기 영동 밴드를 전송합니다. </li><li> 5 분, 트리스 막 씻어 (바이오 래드 TBS) 염분 버퍼. 0.1 % 트윈 2 (TTBS에 5 % 탈지 우유 TBS를 차단1) 실온에서 흔들어 1 시간. </li><li> 4 ° C에서 하룻밤 진탕 5 % 탈지 우유에 특정 기본 항체를 사용하여 immunoblotting을위한 멤브레인을 처리합니다. 실온에서 1 시간 동안 5 % 탈지 우유 차 HRP 결합 된 IgG의 (H + L) 항체 다음 20 분 동안 TTBS로 세척 할 것. 30-60 분 동안 TTBS로 세척 할 것. </li><li> 서양 더럽히는 루미놀 시약 (산타 크루즈 바이오 테크놀러지 주식, 산타 크루즈, 캘리포니아)에 의해 단백질 밴드를 감지합니다. 사진 필름에 필터를 노출합니다. 참고 : 일부 실험에서는, 스트립 시약이 다른 기본 및 보조 항체 후속 하이브리드와 멤브레인 (피어스, 록 퍼드, IL) 제거하는 데 사용되었다. </li><li> 어도비 포토샵 5.0.2에 X-선 필름을 스캔합니다. ImageJ에 소프트웨어 (건강의 국립 연구소, 베데스다, MD)를 사용하여 농도계 분석을 수행합니다. </li></ol></li></ol> II. 기능 분석에 항체 억제의 사용 II.1. Antibod의 공동 형질 전환이거는 전차 단백질 배달 시약 키트를 사용 <ol><li> 형질 반응 혼합물 당, 1X PBS 100 μL의 최종 볼륨, wtNef-GFP 플라스미드 DNA 1 μg 및 안티 mortalin 항체 또는 항-α-tubulin에 항체 하나의 1 μg을 희석. 참고 : 이전에 항-α-tubulin에 항체의 공동 형질이 exNef 분비에 아무런 감지 효과가없고, 따라서이 실험에서 효과가 대조군 역할을 한 것으로 나타났습니다. </li><li> 멸균 물 100 μL의 최종 볼륨에 희석 전차 시약의 6 μl를 희석하고 희석 DNA 항체 혼합 결합합니다. </li><li> 전차 / DNA 항체 복합체의 형성을 할 수 있도록 30 분 동안 실온에서 알을 품다. </li><li> 5 분 600 XG에서 원심 분리하여 펠렛 3 × 10 5 된 Jurkat 세포. </li><li> 1X PBS로 두 번 세포를 씻으, 그리고 전차 / DNA 항체 복합체에 resuspend을. </li><li> 서스펜션에 혈청 RPMI 1640 배지 400 μl를 추가하고 C를 품어37 문화 접시에 ELL 학생 ℃에서 2 시간 동안 C. </li><li> 각 플레이트에 10 % FBS를 포함하는 신선한 RPMI 1640 배지 1 ㎖를 추가하고, 37에서 48 시간 동안 세포를 품어 ° C. </li></ol> II.2. 항체 억제의 NEF-GFP 분비 형광 플레이트 리더 분석 <ol><li> 수확 된 세포에서 세포 무료 에어컨 미디어를 수집하고, 96 - 웰 블랙의 microtiter 플레이트의 각 웰에 100 μl를 전송합니다. </li><li> 여기 파장 485 nm의 발광 파장 상대 형광 단위 515 m로 TECAN GENEios의 fluorimeter의 미디어 측정 GFP 형광. </li><li> 컨트롤의 GFP 형광의 수준 (세포 미디어 네프-GFP 및 안티-α-tubulin에 항체와 공동 형질) 100 %로 설정합니다. </li><li> 세포 미디어 네프-GFP 분비의 변화를 확인하기 위해 안티 - mortalin 항체와 공동 형질에서 GFP 형광의 수준이 비교할 수 있습니다. </li></ol>

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</ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

exosomal 인신 매매 통로 exNef 분비 엔지니어링 소설 억제제에 도움이 될 것입니다 조작은 NEF의 능력을 기본 메커니즘을 이해. exNef 분비의 억제는 CD4 T 세포 고갈과 CIA 해당 드라이브 HIV / AIDS 발병을 감소해야한다. 이 목표를 향해, ​​우리는 우리가 exNef 분비의 유전학을 분석하고, 관련된 세포 단백질을 결정하기 시작 허락 소설 시약 및 방법론의 숫자를 개발했습니다. 이 방법은 직접 exNef 분비, SMRwt 펩타이드를 대상으로하는 최초의 억제제 개발했다. 우리의 작업의 주요 발견은 우리의 경우 전체 길이 단백질에서 발견 모티브에서 파생 된 특정 짧은 펩티드, HIV-1 Nef의, 생물학적 기능을 유지뿐만 아니라, 또한 경쟁의 전체 길이 단백질의 기능을 억제 할 수 있습니다. 이 펩티드는 생물학적 기능을 유지하기 때문에,이 기능 영역을 식별하는 데 사용할 수 있습니다전체 길이 단백질합니다. 두 가지가 필요합니다 : 그 단백질의 전체 길...

항 레트로 바이러스 치료의 도래와 함께, 서구 세계에서 에이즈 전염병이 둔화하지만, 축소하지 않으며, HIV의 확산은 전 세계에 걸쳐 중요한 건강 부담을 계속하고있다. 변두리에 효과적인 RV144 태국 재판을 제외하고, HIV 백신은 지금까지 감염으로부터 보호하기 위해 실패를 보여 주었다. 따라서, 추가, 잠재적 인 치료 표적에 대한 연구는 여전히 보증합니다. CD4 T 세포 고갈과 함께, 지속적인 일반화 된 면역 활성화는 HIV 감염의 특징이다. 이 만성 면역 활성화 (CIA)은 세포의 매출 활성화와 차별화 된 림프 모집단, 휴대 피로와 노화, 및 활성화 유도 세포 죽음 (AICD) 1,2,3을 통해 T 세포와 B 세포의 살해의 증가로 연결하고, 그것은 잘 질병의 진행 4,5,6,7,8,9,10,11,12의 가장 강력한 예측 인자 중 하나로 설정됩니다. 그러나 메커니즘은 CIA와 CD4의 기초HIV 감염의 고갈 T-세포가 완전히 밝혀 할 수 남아 있습니다. 우리 실험실과 다른 사람의 증거는 HIV 단백질 네프는 (네거티브 규제 요인) HIV-1에 감염된 세포 13,14에서 exosomes에있는 그것의 분비를 유도 상기 질병의 진행을위한 모델 (그림 1)로 우리를 이끌었다. 이러한 네프 함유 exosomes (exNef)는 감염되지 않은 CD4 T 세포 15,16 등의 세포 계통의 여러 세포 사멸을 유도. 또한, 단핵구에서 / 대 식세포 exNef 바꾼다 유전자 발현 패턴, 예를 들면 사이토 카인의 발현, 그리고 예약되지 않은 면역 활성화의 상태를 유도하기 위해 나타납니다. 증거의이 몸은 CIA와 CD4 T 세포 고갈 exNef에 중요한 역할을 제안합니다. exosomal 인신 매매 통로 exNef 분비 엔지니어링 소설 억제제에 도움이 될 것입니다 조작은 NEF의 능력을 기본 메커니즘을 이해. exNef 분비의 억제는 CD4 T 세포 고갈을 감소한다그리고 CIA 드라이브 HIV / AIDS 발병합니다. HIV / AIDS 질병의 진행이 모델에 내장 된 다음 데이터에 대한 우리의 모델을 주도 증거를 수집하기 위해, 우리는 우리가 exNef 분비의 유전자를 분석 할 수 소설 시약 및 방법론의 숫자를 개발하고,을 결정하기 시작 세포 단백질이있었습니다. 초기 연구에서, 우리는 네프 단백질 방관자 세포의 apoptosis를 유도하고 네프 형질 전환 및 HIV에 감염된 세포에서 extracellularly 15 릴리스되고있는 것으로 나타났습니다. SDF-1α (대안 접합 알파 계수-1 유래 기질 세포)에서 유래 펩타이드는 이전에 많은 전장 분자 (17)의 결합 및 신호 활동을 유지하기 위해 표시했다. 우리는 네프의 펩티드는 전체 단백질의 세포 사멸 활동의 일부, 이러한 펩티드 반드시 네프 세포 사멸 도메인 (들)을 포함하는 것을 유지할 수 있다는 추측. 이러한 펩티드를 확인하고 그 결과 네프하려면세포 사멸 도메인 (들), 우리는 NIH AIDS 연구 및 참조 시약 프로그램에서 20 HIV-1 Nef의 스캔 펩티드의 집합을 얻었다. 이 20-AA 펩티드는 이웃의 10 아미노산 중복 각각은, 그들의 마지막 아미노산 즉, N20 걸쳐 네프 아미노산 1-20 N30 걸쳐 네프 아미노산 11-30, 등 16의 숫자로 지정됩니다. 우리는이 세포의 전체 길이 네프 단백질 유도 세포 사멸의 두 가지 10-AA 도메인을 중복 특정 펩티드 extracellularly T-세포를 노출 것을 발견했다. 이러한 네프 파생 된 세포 사멸 펩티드의 후속 분석은 실제로 이러한 펩티드 경쟁력 CXCR4와 자연의 리간드 SDF-1α 사이의 바인딩을 억제 할 수 바인딩 속도론과 T 세포의 표면에 케모카인 수용체 CXCR4와 상호 작용하는 능력을 공개했다. 마지막으로, CXCR4와 네프에서 파생 된 세포 사멸 펩티드 &#39;상호 작용은 세포 사멸에 이르는이 T-세포의 스트레스 반응을 유발하는 것으로되었다. 이 증거는 우리에게 QUIC 허용광년지도 네프의 기능 영역, 예 알라닌 스캔 돌연변이와 같은 표준 DNA 돌연변이 기술을 사용하여 더 이상 걸렸을 것입니다 프로세스입니다. 또한 이러한 짧은 네프 파생 펩티드는 전체 길이 단백질 세포 사멸 도메인의 생물학적 기능을 유지 것을 보여 주었다. 세포 네프의 역할을 확인하는 데, T-세포 즉, 세포 사멸, 우리는 네프는 세포에서 분비 된 방법의 더 나은 이해를 모색하고 있습니다. 변이 네프 구문의 시리즈를 사용하여, 우리는 HIV 네프 모두의 N-말단 지역에서 매우 보존 네프 단백질 모티프를 매핑하고, exNef 분비 13 중요한 그 붉은 털 원숭이 해당 SIV 맥 (유인원 면역 결핍 바이러스) 네프. 이러한 주제 중 하나 분비 수정 지역 (SMR, 66VGFPV70)는 자사의 다섯 가지 아미노산의 하나 크게 exNef 분비를 감소 또는 폐지의 알라닌 교체로, 특히 중요했습니다. 활동 주제의 C를 통해 세포에 전달 될 때hariot 단백질 배달 시약, FLAG 펩타이드 시퀀스 (SMRwt)에 부착 된 SMR을 포함하는 펩타이드는 18 세포 네프 - 형질 전환 및 HIV에 감염된 모두에서 exNef 분비를 억제하는 것으로되었다. 펩티드와 우리의 이전 경험을 바탕으로, 우리는 분자와 exNef 분비 네프 SMR의 역할을 기본 메커니즘을 해명이 펩티드를 사용하기로 결정했다. 우리의 &quot;미끼 단백질&quot;로 SMRwt 펩티드를 사용하여, 우리는 감염되지 않은 T 세포 용 해물 (18)로부터 SMR의 휴대 전화 바인딩 파트너를 공동 immunoprecipitated. FLAG 펩타이드 시퀀스는 안티-FLAG 친 화성 수지를 사용하여 SMRwt 펩타이드를 캡처하는 편리한 손잡이를 제공했다. SMRwt 펩타이드의 돌연변이 알라닌하는 단일 발린이 exNef 분비의 억제를 폐지하기에 충분했다 우리의 이전 연구 결과는 우리가 SMR에 대한 특정하지 공동 immunoprecipitated 단백질을 배제하는 데 편리하고, 매우 구체적인 제어 펩타이드 (SMRmut)를 확인했다. s의 펩티드를 사용하여오히려 전체 길이 단백질보다 관심 pecific 도메인은 우리가 네프 19 다른 도메인에 바인딩 세포의 여러 요소의 검사를 우회 할 수있었습니다. 일단 우리는 논리적 인 다음 단계는 확인 된 휴대 전화 바인딩 파트너 생물학적 기능 18 중요하다는 것을 보여주고 있었고, SMR 결합 파트너를 확인했다. 이 작업을 수행하는 표준 절차는 생물학적 기능을 표적 단백질의 특정 miRNA의 또는 siRNA를하고, 이후 분석 결과를 사용하여 최저 단백질 수준이다. 우리는이 경우 SMR-결합 단백질에 대상의 생산을 감소 목표의 mRNA의 번역을 억제 miRNA의 넉다운을 수행. 대상 단백질이 감소 간접 효과, 그리고 아마도 타겟 단백질이 결과적 인치 역할을하는 생물학적 기능에 대한 지연 효과를 가지고, 우리는 직접의 활동을 방해하는지 확인하기 위해 덜 일반적인 항체 억제 기술을 채택대상 단백질은 생물학적 기능을 줄이거 나 제거합니다. 이 절차에서는 항체 표적 단백질에 대해 제기는 전차 시약을 사용하여 세포로 형질 전환하고, 목적 단백질도 기능을 자사의 사이트에서 봉쇄를, 또는 관련 바인딩 도메인을 차단과 직접 상호 작용합니다. 이 절차를 통해 대상 단백질의 억제가 직접 그 기능을 방해하고, 또한 생물학적 기능에 목적 단백질의 중요성을 확인하여 RNA의 최저 절차를 보완 할 수 있습니다. 전차 시약은 세포로 펩티드와 단백질을 제공하는데 효과적이지만,이 과정은 시간이 많이 소요하고, 실험의 종류를 제한하는 등 장기간 또는 반복 노출과 생체 내 동물 연구에서 수행 할 수 있습니다. 따라서, 우리는 수동적으로 세포에 의해 수행 될 수있는 펩타이드를 생성하는 SMRwt 펩타이드 (SMRwt-CPP) 18 세포 관통 펩티드 (CPP) 시퀀스를 추가문화 미디어. 이 버전은 억제 exNef 분비에 이전만큼 효과적이었다. 이러한 게시 된 실험 증거는 경쟁 억제를 통해 전체 길이 단백질의 기능을 적대하고, 이러한 주제를 바인딩 단백질을 분리하기 위해 특정 기능을 모티프 포함하는 작은 펩티드의 능력을 보여줍니다. 하나는 이러한 기술은 많은 실험 프로토콜에 도움이 될 것을 기대합니다. 그들은 또한 많은 세포 과정의 엔지니어링 소설 펩티드 억제에 효과가한다 CPP 시퀀스 결합하여 성능을 더욱 향상시킬 수 있습니다 기능.

<table><tbody><tr><td>10개의 아미노산이 겹치는 20mer 펩타이드 세트</td><td>NIH AIDS 연구 및 참조 시약 프로그램</td><td>4641</td><td></td></tr><tr><td>TUNEL 분석</td><td>Roche</td><td>11 684 809 910</td><td></td></tr><tr><td>Chariot 단백질 전달 시약</td><td>활성 모티프</td><td>30100</td><td></td></tr><tr><td>Tecan GENEios 형광측정기</td><td>(Tecan Group, Switzerland)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96웰 블랙 마이크로타이터 플레이트</td><td>코닝</td><td>3792</td><td></td></tr><tr><td>anti-FLAG M2 Affinity Gel</td><td>Sigma</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G 마그네틱 비드 </td><td>Invitrogen</td><td>100.03D</td><td></td></tr><tr><td>MagnaSphere Technology 마그네틱 분리 스탠드(2위치)</td><td>Promega Corp., Madison, WI</td><td>Z5332</td><td></td></tr><tr><td>C-18 ZipTip </td><td>Millipore</td><td>ZTC18S096</td><td>C18 수지 (0.6 & l 또는 0.2 &mu; L 침대 볼륨). 올리고뉴클레오티드 또는 작은(< 50kDa) 수용액 내 단백질/펩타이드</td></tr><tr><td>MALDI TOF/TOF,</td><td>Bruker Daltonics, ultraflex III, TOF/TOF</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

기능 모티브과 바인딩 파트너 펩타이드 기반의 식별

Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners

우리의 경우 HIV-1 Nef의에, 전체 길이 단백질에서 발견 모티브에서 파생 된 특정 짧은 펩티드는 생물학적 기능을 유지뿐만 아니라, 경쟁의 전체 길이 단백질의 기능을 억제 할 수 있습니다뿐만 아니라. 20 네프 스캔 펩티드, 각 이웃의 10 아미노산 겹치는 길이 20 아미노산의 세트는 세포 사멸의 유도에 대한 책임 네프에서 모티브를 식별하는 데 사용되었다. 이러한 세포 사멸 주제를 포함하는 펩티드는 전체 길이 네프 단백질에 비해 수준에서 세포 사멸을 유도. 네프의 분비 수정 지역 (SMR)에서 파생 된 두 번째 펩티드, exosomes에있는 네프의 분비 (exNef)에 관련된 세포 단백질과 상호 작용하는 능력을 유지했다. 이 SMRwt 펩타이드는 네프의 SMR 주제에 구체적으로 바인딩 세포 단백질을 분리하기 위해 공동 immunoprecipitation의 실험에서 &quot;미끼&quot;단백질로 사용되었다. 단백질 형질 항체 억제는 물리적 상호 작용 내기를 중단하는 데 사용되었다싸우는 네프 및 mortalin, 고립 된 SMR-결합 단백질의 하나이며, 효과는 형광 기반의 exNef 분비 분석으로 측정 하였다. SMR 모티브를 결합 세포 단백질에 대한 전체 길이 네프을 outcompete하는 SMRwt 펩타이드의 능력은, 그것 exNef 분비의 첫 억제합니다. 따라서, 전체 길이 단백질에서 발견 모티브에서 파생 된 특정 짧은 펩티드의 고유 한 특성을 활용하여 여기에 설명 된 기술을 채용하여, 하나는 단백질의 기능 모티프의 식별 및 병원성 기능의 펩타이드 기반 억제제의 개발을 가속화 할 수 있습니다.

펩티드를 사용하여 생물학적 기능 모티프를 매핑. 두 개의 영역이 세포 사멸을 유도 네프 단백질에서 발견되었다. 펩타이드 기반의 세포 사멸은 N60 (aa40-60)과 N70 (AA50-70)에서 정점 및 펩타이드 N100 (aa80-100)에서 배경 수준으로 감소, 펩타이드 N50 (aa30-50)과 (그림 2) 처음 관찰되었다. AA50-60을 중심으로 주요 주제 1 (M1) 피크, 전체 길이 네프 단백질의 세포 사멸 수준의&gt; 80 %를 유도합니다. 둘째, 작은 세포 사멸 피크 펩티드에게 N180 (aa160-180)과 N190을 (aa170-190)에 걸쳐 관찰되었다. aa170-180을 중심으로이 부 주제 2 (M2) 피크, 전체 길이 네프 단백질 16의 세포 사멸 레벨 ~ 30 %를 유도합니다. 경쟁 저해 분석 펩티드를 사용하여. 그림 3에서 그대로 SM...

exosomes에있는 HIV-1 Nef의의 분비를 기본 메커니즘을 해부하는 방법이 설명되어 있습니다. 네프 단백질 형질 전환에서 파생 된 특정 짧은 펩티드의 구조, 기능 및 네프의 분비 수정 지역의 바인딩 파트너를 결정하는 데 악용되었다. 이러한 절차는 많은 역학적 연구에서 일반적으로 관련이 있습니다.

Specific short  peptides derived from motifs found in full-length proteins, in our case HIV-1  Nef, not only retain their biological function, but can ...

이 영상은 기능적인 HIV-1 Nef 단백질 모티프를 식별하고 펩타이드 기반 억제제를 개발하는 데 사용되는 4가지 실험 세트를 소개합니다. 전체 길이 단백질에서 발견된 모티프에서 유도된 특정 짧은 펩타이드들은 생물학적 기능을 유지하면서 전체 길이 단백질의 기능을 경쟁적으로 억제하여 세포 사멸 모티프를 식별합니다. HIV-1 Nef의 경우, Jurkat 세포를 Nef 스캐닝 펩타이드에 노출시킨 후 TUNEL 세포 사멸 분석을 수행하여 세포 사멸을 유도하는 펩타이드를 식별합니다.NEF 분비 모티프의 변이를 포함하는 두 번째 펩타이드 세트입니다. 분비 수정 영역(secretion modification region, SMR)을 세포에 transfection하며, 이때 NPH GFP의 기능 상실은 nph의 분비 감소로 나타나는 경쟁적 억제로 인해 발생합니다. nef의 분비 수정 영역(SMR)과 상호작용하는 세포 인자를 식별하기 위해 형광 분석법으로 GFP를 평가합니다.SMR 야생형 NPH를 미끼(bait)로 사용하여 공침전(co-precipitation)을 수행합니다. 마지막으로, 이러한 상호작용이 분비에 영향을 미치는지 테스트하기 위해, 확인된 결합 파트너에 대한 항체를 세포에 형질전환시킵니다. 이들이 NF 모티프 분비를 길항하는지 평가하여, NEF 내의 두 가지 기능적 세포사멸 모티프와 기능적 NEF 분비 모티프 및 분비에 필요한 세포 내 결합 파트너를 길항하는 억제 펩타이드를 확인합니다.이 네 가지 실험 세트의 전반적인 목표는 표적 단백질 내 기능적 모티프(functional motif)의 식별을 가속화하고, 해당 데이터를 활용하여 이러한 기능적 모티프에 대한 펩타이드 기반 억제제를 개발하는 것입니다. 이 프로토콜 세트는 neff 유도 분비가 병인론에서 갖는 역할을 이해하고, 엑소좀 수송 경로를 조작하는 neff의 능력 이면에 숨겨진 메커니즘을 해독하는 등 HIV 병인론과 관련된 핵심 질문들에 답하는 데 있어 저희 연구팀에 매우 유용했습니다. 오늘은 제 실험실의 연구 강사인 Dr. Ming Bo Huang이 해당 절차를 시연할 예정입니다.본 실험의 관심 영역을 스캐닝하는 펩타이드 세트로 이 절차를 시작하십시오. HIV-1 NPH 단백질 전체를 포괄하며 10개의 아미노산이 중첩되는 20mer 펩타이드를 AIDS 시약 프로그램에서 확보하였습니다. NPH 세포사멸 모티프를 식별하기 위해, 다음과 같이 NEF 스캐닝 펩타이드를 개별적으로 사용하여 세포사멸 분석을 수행하십시오. 35 mm 플레이트의 Jurkat 세포 배양물에 10 ng/mL 농도의 펩타이드가 포함된 배양액 1 mL를 첨가하고, 37 °C에서 24시간 동안 배양하십시오.배양 후, 세포 사멸(apoptosis)을 평가하기 위해 dUTP, biotin nick 및 labeling을 이용한 terminal deoxy nucleotide transferase 매개 TUNEL 분석을 수행합니다. 이를 위해 먼저 PBS로 세포를 세척한 다음, PBS를 흡입하여 제거하고 PBS에 희석된 4% Paraform aldehyde를 첨가하여 상온에서 30분 동안 배양하여 세포를 고정합니다. 세포 고정이 완료되면 PBS로 세척하고 Triton X 100을 첨가한 후, 상온에서 10분 동안 배양하여 투과화(permeabilization) 시킵니다. 세포 고정 및 투과화 단계가 끝나면, 투과화 처리 후 TUNEL 시약을 첨가하고 37 °C에서 1시간 동안 세포를 배양합니다.PBS로 세포를 두 번 헹굽니다. 그런 다음 컴퓨터 제어 현미경 시스템의 상부 형광(epi fluorescence) 관찰을 통해 염색된 세포의 백분율을 결정합니다. 동봉된 문서에 설명된 대로 chariot 단백질 전달 시약 키트를 사용하여 NPH, GFP 플라스미드 및 다양한 SMR 펩타이드 변이체로 jca 세포를 형질전환한 후, 배지를 수확하여 형광 현미경으로 형질전환 효율을 결정합니다.형광 및 명시야 이미지를 캡처하고 세포의 백분율을 결정합니다. 그 다음 NPH GFP 분비 억제 정도를 평가하기 위해, 세포가 없는 조건 배지 100 µL를 96-웰 블랙 마이크로타이터 플레이트의 개별 웰로 옮깁니다. 들뜸 파장 485 nm 및 방출 파장 515 nm의 형광 광도계를 사용하여 배지 내의 GFP 형광을 상대 형광 단위로 측정합니다.판독이 완료되면 데이터를 PC로 전송합니다. 대조군 배지의 GFP 형광 수준을 100%로 설정하십시오. 그런 다음 이를 다양한 SMR 펩타이드가 공 transfection된 세포 배지의 GFP 형광 수준과 비교하여 NPH GFP 분비의 변화를 결정합니다. 모티프 결합 파트너를 분리하기 위한 co IP는 까다로운 단계입니다.배양 과정 동안 비드가 적절히 교반되도록 하고, 각 세척 단계에서 비드로부터 가능한 한 많은 액체를 제거하십시오. 10% FBS가 포함된 RPMI 1640 배지에서 37 °C의 T 75 조직 배양 플라스크에 jerk hat 세포를 배양합니다. 4 °C에서 1000 ×g로 20분간 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다. 세포 펠렛을 1 mL의 PBS에 재현탁하여 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.1000 ×g에서 1분 동안 원심분리합니다. 그 후, 마이크로 원심분리기를 사용하여 펠렛을 1 mL의 Anti-Flag 용해 완충액에 넣고 파이펫팅으로 부드럽게 재부유시킵니다.현탁액을 2000 ×g에서 5분간, 그리고 13,000 ×g에서 10분간 원심분리합니다. 세포 잔해와 DNA를 각각 침전시킨 후, 이후 용해물(lysate)로 지칭할 상층액을 수집합니다. 단백질 농도를 결정한 후, 용해물 단백질 1 mg과 SMR 야생형 또는 SMR 돌연변이 펩타이드 1 µg을 Anti-Flag M2 어피니티 겔 20 µL에 첨가합니다.이 친화성 겔은 이후 레진으로 지칭하며, 혼합물의 최종 부피가 co IP 버퍼 내에서 1 mL가 되도록 맞춥니다. 또한, 펩타이드 없이 용해물과 레진만 결합한 음성 대조군을 준비합니다. 혼합물을 4 °C에서 end-over-end 회전시키며 밤새 배양합니다.다음 날, 5,000 내지 8,000 ×g에서 30초 동안 마이크로 원심분리를 하여 레진을 펠릿화합니다. 원심분리 후, 레진이 튜브 바닥에 가라앉을 수 있도록 샘플을 다루기 전 1~2분 정도 기다립니다. 레진이 옮겨지지 않도록 주의하며 끝이 좁은 피펫 팁이나 Hamilton 시린지를 사용하여 상층액을 제거합니다.레진을 500 µL의 세척 버퍼에 현탁한 후 원심분리하는 과정을 4회 반복하여 세척합니다. 결합된 세포 단백질을 용출시키기 위해, 50 µL의 세척 버퍼에 녹인 15 µg의 과량 3x FLAG 펩타이드를 튜브에 넣고 로커 셰이커에서 상온으로 30분 동안 배양합니다. 배양 후 5,000~8,000 ×g에서 30초 동안 원심분리합니다.튜브를 2분 동안 그대로 두어 침전시킨 후, 용출된 단백질이 포함된 상층액을 수집하여 보관합니다. 아세톤 침전법으로 EIT를 농축한 후, 샘플을 laly 샘플 버퍼에 넣어 가열합니다. 그런 다음 40~20% triss, HCL criterion precast gel에서 SDS page로 단백질을 분리하고, kumasi brilliant blue R two 50으로 젤을 염색합니다.항체 억제를 평가하기 위해, 동봉된 문서에 기재된 대로 chariot 단백질 전달 시약 키트를 사용하여 JCA 세포에 NGFP와 Antifa tubulin 또는 anti mortality 항체를 공동 형질전환합니다. 수확한 세포로부터 세포가 없는 조건 배지를 수집합니다. 96웰 블랙 마이크로타이터 플레이트의 개별 웰에 100 µL씩 옮깁니다. 그 다음, 들뜸 파장 485 nm 및 방출 파장 515 nm의 형광 광도계를 사용하여 배지 내 GFP 형광을 상대 형광 단위로 측정합니다.플레이트를 판독한 후, 데이터를 PC로 전송하고 anti-fat tubulin 대조군의 GFP 형광 수준을 100%로 설정하십시오. 이를 anti mortality 항체가 함께 transfection되지 않은 세포 배양액의 GFP 형광 수준과 비교하여 NEF GFP 분비의 변화를 결정합니다. HIV-1 Nef 단백질의 apoptotic motif를 매핑하기 위해, 이 비디오에서 설명한 대로 펩타이드 스캐닝 분석을 수행하였습니다. Y축은 TUNEL 표지된 세포의 백분율을 나타내며, X축은 여기에 표시된 바와 같이 처리 조건을 나타냅니다. HIV-1 Nef에서 apoptosis를 유도하는 두 개의 서로 다른 영역이 확인되었습니다. 이는 Nef 펩타이드에 노출된 세포의 TUNEL 표지가 증가한 것으로 나타납니다.SMR 야생형 펩타이드에 의한 NEF 분비의 경쟁적 억제를 평가하기 위해 세포 사멸의 피크를 모티프 1과 모티프 2로 표시하였습니다. NPH GFP 클론과 다양한 SMR 펩타이드가 공동 형질전환된 Jurkat T 세포의 배양 배지를 사용하여, 배지 내 GFP 형광으로 나타나는 외분비성 NPH 분비를 분석하였습니다. 하나 이상의 야생형 NPH SMR 서열 모티프를 포함하는 펩타이드는 외분비성 NEF의 분비를 억제한 반면, 이 영역 내의 어떤 아미노 acid라도 알라닌으로 교체하면 펩타이드의 효능이 크게 감소했습니다. 이는 SMR 야생형 펩타이드가 외분비성 NPH를 억제함을 시사하며, NPH는 NEF 사멸 모티프의 11개 아미노 acid 스크램블 버전입니다. 이전에 기술되었으며 Sigma Genesis에서 구입한 SM1을 음성 대조군으로 사용하였으며, 이는 외분비성 NEP 분비에 아무런 영향을 미치지 않았습니다.Coomassie 블루로 염색된 이 SDS-PAGE 겔 이미지는 60, 65, 75, 250 kilodalton 크기의 4가지 단백질이 SMR 야생형 펩타이드에 의해 공동 면역침전된 것을 보여줍니다. 음성 대조군인 SMR 돌연변이 펩타이드는 이러한 단백질들을 포착하지 않았으며, 해당 단백질들은 친화성 수지와 비특이적으로 상호작용하지 않았습니다. SMR 야생형 펩타이드가 없을 때와 비교하여, 이러한 결과는 공동 침전된 단백질들이 SMR 야생형 펩타이드의 SMR 모티프와 특이적으로 상호작용하고 있음을 시사합니다.플레이트 리더 분석 결과, anti mortal 항체와 neph 발현 플라스미드를 함께 형질전환(cot transfection)했을 때 exo omal NPH 분비가 완전히 억제됨을 확인하였습니다. 관련 없는 항체는 exo omal ne 분비에 아무런 영향을 미치지 않았습니다. 이러한 결과는 exo omal neph 분비를 위해 온전한 NM talent 상호작용이 필요함을 시사합니다.결론적으로, 본 영상을 시청한 후 여러분은 표적 단백질의 기능적 모티프를 식별하기 위해 기술된 기법들을 사용하는 방법과 해당 데이터를 활용하여 이러한 기능적 모티프의 펩타이드 기반 억제제를 개발하는 방법에 대해 충분히 이해하게 되었을 것입니다. co IP 절차를 수행할 때는 배양 및 세척 단계를 실행하는 데 세심한 주의를 기울이는 것이 매우 중요하며, 배양 중에 비드가 적절히 교반되도록 하고 각 세척 단계에서 비드로부터 가능한 한 많은 액체를 제거해야 합니다. 또한 세포 및 용해물 레진 세척 시에는 원심분리 후 항상 레진이 가라앉을 때까지 기다려야 합니다.좁은 끝 파이펫 팁을 사용하고 네 번 세척하여 배경 신호를 허용 가능한 수준으로 충분히 낮추십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

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기능 모티브과 바인딩 파트너 펩타이드 기반의 식별

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