기능 모티브과 바인딩 파트너 펩타이드 기반의 식별

이 비디오는 기능적 HIV one NPH 단백질 모티프를 식별하고 펩타이드 기반 억제제를 개발하는 데 사용되는 4가지 실험 세트를 제시합니다. 전장 단백질에서 발견되는 모티프에서 유래한 특정 짧은 펩타이드는 생물학적 기능을 유지하고 자가사멸 모티프를 식별하기 위해 전장 단백질의 기능을 경쟁적으로 억제합니다. HIV에서는 하나의 NEF 저크 고양이 세포가 NEF 스캐닝 펩타이드에 노출되고 세포 사멸을 유도하는 펩티드를 확인하기 위해 터널 세포 사멸 분석이 수행됩니다.

NEF 분비 모티프의 변형을 포함하는 두 번째 펩타이드 세트. 분비 변형 영역 또는 SMR은 NPH 분비 감소로 나타나는 경쟁적 억제로 인한 GFP 기능 상실과 함께 세포로 형질 주입됩니다. GFP는 nef의 분비 수정 영역 또는 SMR과 상호 작용하는 세포 요인을 확인하기 위해 형광 측정법으로 평가됩니다.

Coun 강수는 SMR 야생형 NPH를 미끼로 사용하여 수행됩니다. 마지막으로, 이러한 상호 작용이 분비에 영향을 미치는지 여부를 테스트하기 위해 식별된 결합 파트너에 대한 항체를 세포에 transfection합니다. NF 모티프 분비를 길항하는지 여부를 평가하기 위해 얻은 결과는 NEF의 두 가지 기능적 자사멸 모티프와 기능적 NEF 분비 모티프 및 분비에 필요한 세포 결합 파트너를 길항하는 억제 펩타이드를 식별합니다.

이 4가지 실험 세트의 전반적인 목표는 표적 단백질에서 기능적 모티프의 식별을 가속화한 다음 해당 데이터를 사용하여 이러한 기능적 모티프의 펩타이드 염기 억제제를 개발하는 것입니다. 이 프로토콜 세트는 발병기전에서 neph 주도 분비의 역할을 이해하고 exo somal trafficping pathway를 조작하는 neff의 능력에 기반을 둔 메커니즘을 해독하는 것과 같은 HIV 발병기전과 관련된 주요 질문에 답하는 데 도움이 되는 데 우리 그룹에 유용했습니다. 오늘 시연할 사람은 제 연구실의 연구 강사인 Ming Bo Huang 박사입니다.

이 실험의 관심 영역을 스캔하는 펩타이드 세트로 이 절차를 시작합니다. 전체 HIV 1 NPH 단백질에 걸쳐 10개의 아미노산이 겹치는 20개의 MER 펩타이드를 AIDS 시약 프로그램에서 얻었습니다. NPH 세포사멸 모티프를 식별하려면 다음과 같이 NEF 스캐닝 펩타이드를 개별적으로 사용하여 세포사멸 분석을 수행하고, 저크 햇 35mm 플레이트당 펩타이드 1밀리리터당 10나노그램을 함유한 배양 배지 1밀리리터를 추가하고, 세포 배양물을 추가하고, 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양합니다.

배양 후 말단 deoxy nucleotide transferase 매개 DUTP, 비오틴 흠집 및 라벨링 또는 터널 분석을 수행하여 세포사멸을 평가합니다. 이를 위해 먼저 PBS로 세포를 세척한 다음 PBS를 흡인하고 PBS에 4%파라폼 알데히드를 첨가하고, 실온에서 30분 동안 배양하여 세포를 고정한 후 세포를 고정하고, PBS로 세척한 후 Triton X 100을 첨가하고, 실온에서 10분 동안 배양하여 침투시킵니다. 세포의 고정 및 투과 후 터널 시약을 첨가하고 투과성 후 섭씨 37도에서 1시간 동안 세포를 배양합니다.

PBS로 세포를 두 번 헹굽니다. 그런 다음 컴퓨터 제어 현미경 시스템에서 epi 형광에 의한 염색된 세포의 비율을 결정합니다. 첨부 문헌에 기술된 바와 같이 chariot protein delivery 시약 키트를 사용하여 NPH, GFP 플라스미드 및 SMR 펩타이드의 다양한 변이로 jca 세포를 transection한 후, 배지를 수확하여 형광 현미경으로 transfection 효율을 측정합니다.

형광 및 명시야 이미지를 캡처하고 세포의 비율을 결정합니다. 그런 다음 NPH GFP 분비 억제를 평가하기 위해 형질주입하고, 100마이크로리터의 cell-free conditioned medium을 96웰 블랙 마이크로타이터 플레이트의 개별 웰로 옮깁니다. 여기 파장이 485나노미터이고 방출 파장이 515나노미터인 형광계를 사용하여 상대 형광 단위로 배지의 GFP 형광을 측정합니다.

읽기가 완료되면 데이터를 PC로 전송합니다. 대조 배지의 GFP 형광 수준을 100%로 설정한 다음 이를 다양한 SMR 펩타이드와 함께 형질 주입된 세포의 배지에서 GFP 형광 수준과 비교하여 NPH GFP 분비의 변화를 확인합니다. 모티프 바인딩 파트너를 분리하기 위한 co IP는 어려운 단계입니다.

배양 중에 비드가 적절하게 교반되었는지 확인하고 각 세척 단계에서 비드에서 가능한 한 많은 액체를 제거하십시오. T 75 조직 배양 플라스크 펠릿 세포에서 섭씨 37도에서 10%FBS를 함유하는 RPMI 1640 배지에서 섭씨 4도에서 20분 동안 1000배 G로 원심분리하여 저크 햇 세포를 성장시킵니다. 세포 펠릿을 1ml의 PBS에 재현탁시키고 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.

1분 동안 1000회 G로 회전합니다. 그런 다음 펠릿을 1ml의 Anti-Flag lysis에 다시 현탁시킵니다. 부드러운 피펫팅으로 완충 차등 마이크로 원심분리기.

2000 번 G에서 5 분 동안 그리고 13, 000 번 G에서 10 분 동안 중단됩니다. 세포 파편과 DNA를 각각 펠렛화하기 위해 이하, 용해물이라고 하는 상층액을 수집합니다. 단백질 농도를 결정한 후, 20 마이크로리터의 Anti-Flag M 2 친화성 겔에 용해물 단백질 1mg과 SMR 야생형 또는 SMR 돌연변이 펩타이드 1마이크로그램을 첨가합니다.

이 친화성 겔은 이하에서 수지가 혼합물을 co IP 완충액에서 1 밀리리터의 최종 부피로 가져 오는 것으로 지칭됩니다. 또한 펩타이드가 없는 경우 용해물이 수지와 결합되는 음성 대조군을 준비합니다. 혼합물을 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 종단 간 회전으로 배양합니다.

다음날 5, 000에서 8, 30 초 동안 000 번 G에서 마이크로 원심 분리로 수지를 펠릿화합니다. 탈수 후 레진이 튜브에 침전될 수 있도록 샘플을 취급하기 전에 1-2분 동안 기다립니다. 끝이 좁은 피펫 팁 또는 Hamilton 주사기로 상층액을 제거하며 수지가 옮겨지지 않도록 주의합니다.

레서스로 수지를 4번 세척하고 500마이크로리터의 세척 버퍼에 현탁시킨 다음 마이크로 원심분리를 합니다. 결합된 세포 단백질을 용리합니다. 세척 완충액의 50 마이크로리터에 있는 관에 과잉 3 x 깃발 펩티드의 15 마이크로그램을 추가하고 5, 000에서 8, 30 초 동안 G 배양 후에 실내 온도에 30 분 동안 로커 셰이커에 배양하십시오.

튜브가 2분 동안 가라앉도록 한 후 용출된 단백질을 포함하는 상층액을 수집하고 저장합니다. 아세톤 침전에 의해 EIT를 농축한 후 laly 샘플 버퍼에서 샘플을 끓입니다. 그런 다음 40-20%triss, HCL 기준 프리캐스트 젤에 SDS 페이지로 단백질을 분리하여 kumasi brilliant blue R two 50으로 젤을 염색합니다.

첨부 문서에 기술된 바와 같이 chariot protein delivery 시약 키트를 사용하여 NGFP와 Antifa tubulin 또는 antimortality antibody로 JCA 세포를 항체 억제 요람 형질주입 평가하기 위해 수확된 세포에서 cell-free conditioned medium을 수집합니다. 100마이크로리터를 96웰 블랙 마이크로타이터 플레이트의 개별 웰로 옮깁니다. 그런 다음 상대 형광 단위에서 여기 파장이 485나노미터이고 방출 파장이 515나노미터인 형광계를 사용하여 배지에서 GFP 형광을 측정합니다.

플레이트를 읽은 후, 데이터를 PC로 전송하고 항 지방 튜불린 대조군에서 GFP 형광 수준을 100 %로 설정하십시오.이를 항 사망 항체로 transfection된 세포 cot에서 배지의 GFP 형광 수준과 비교하여 NEF GFP 분비의 변화를 결정하기 위해 HIV one NPH 단백질 펩타이드 스캐닝 분석을 이 비디오에 설명된 대로 수행했습니다. Y축은 터널 표지된 세포의 비율을 나타내고 x축은 여기에서 볼 수 있듯이 치료 상태를 나타내며, 세포사멸을 유도하는 HIV 1개의 NEF의 두 개의 분리된 영역이 확인되었습니다. 이는 neph 펩타이드에 노출된 세포의 터널 라벨링이 증가한 것으로 나타납니다.

세포사멸의 피크는 SMR 야생형 펩타이드, 저크, CAT T 세포, 유아용 침대에서 배양 배지에 의한 네프 분비의 경쟁적 억제를 평가하기 위해 모티프 1 및 모티프 2로 표시되며, NPH GFP 클론 및 다양한 SMR 펩티드는 하나 이상의 야생형 NPH 서열 모티프를 함유하는 배지 펩티드에서 GFP 형광에 의해 나타난 바와 같이 엑소 오말 NPH 분비의 경쟁적 억제를 평가하기 위해 엑소 오말 NEF의 분비를 억제했습니다 이 지역 내의 어떤 아미노산든지의 알라닌 대체는 펩티드의 효과를 크게 감소시키는 동안. 이는 SM R 야생형 펩타이드가 neff의 apoptotic motif의 11개 아미노산 스크램블 버전인 exo omal nph를 억제한다는 것을 시사합니다. 이전에 기술되어 Sigma Genesis에서 얻은 SM 중 하나는 음성 대조군으로 사용되었으며 exo omal NEP 분비에 영향을 미치지 않았습니다.

kumasi 염색된 SDS 페이지 젤의 이 이미지는 60, 65, 75 및 250 킬로달톤 크기의 SMR 야생형 펩타이드에 의한 4개 단백질의 공동 면역침전을 보여줍니다. 음성 대조군 SMR 돌연변이 펩타이드는 이러한 단백질을 포획하지 않았으며, 이러한 단백질은 친화성 수지와 비특이적으로 상호 작용하지 않았습니다. SMR 야생형 펩타이드가 없는 경우, 이러한 결과는 coun 침전된 단백질이 SMR 야생형 펩타이드의 SMR 모티프와 특이적으로 상호 작용하고 있음을 시사합니다.

플레이트 리더 분석은 neph 발현 플라스미드를 사용한 항 인간 항체의 cot transfection이 exo omal NPH 분비를 완전히 폐지했음을 보여줍니다. 관련 없는 항체는 exo omal ne 분비에 영향을 미치지 않았습니다. 이러한 결과는 외오말 네프 분비를 위해 온전한 NM 재능 상호작용이 필요하다는 것을 시사합니다.

결론적으로, 이 비디오를 시청한 후에는 describe 기술을 사용하여 표적 단백질의 기능적 모티프를 식별하고 해당 데이터를 사용하여 이러한 기능적 모티프의 펩타이드 염기 억제제를 개발하는 방법을 잘 이해했을 것입니다. co IP 절차를 시도하는 동안 배양 세척을 실행할 때 세심한 주의를 기울이고, 배양 중에 비드가 적절하게 교반되었는지 확인하고, 각 세척 단계에서 비드에서 가능한 한 많은 액체가 제거되었는지 확인하는 것이 중요합니다. 또한 세포 및 용해물 수지 세척 중에는 항상 수지가 원심분리 후 침전되도록 합니다.

좁은 끝 피펫 팁을 사용하고 4회 세척하여 배경을 허용 가능한 수준으로 적절하게 줄입니다.