Name: 에서 초기 단계의 배아의 효율적이고 신속한 분리 애기 장대 씨앗 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: 배우세요 Arabidopsis thaliana 초기 배아 분리법을 통해 식물 발달 생물학 연구를 수행하는 방법을 알아보세요. 이 기술은 1시간 내에 최대 40개의 배아를 효율적으로 분리하여 RNA/DNA 추출 및 유전자 리포터 분석에 활용할 수 있습니다.

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우리는 배아 분리에 대한 자신의 조언을 탈 Nawy 마틴 바이어에게 감사의 말씀을 전합니다. MTR, VG, UG와 CB는 배아 분리 장비를 고안했다. MTR, VG와 CB는 배아 분리 프로토콜을 개발했다. MTR, VG와 CB는 프로토콜을 확립 배아를 격리하고, 생성 된 배아의 cDNA, VG는 PCR, MTR GUS 염색, JJ 물고기 실험을 수행 하였다. MTR, VG, CG 및 UG는 원고를 썼다. 이 작품은 취리히 대학교, 로슈 연구 재단 (MTR까지)의 친목 및 스위스 국립 재단 (UG와 CB까지)에서 교부금에 의해 투자되었다.

절차는 그림 1의 순서도에 요약되어 있습니다. microcapillaries과 악기 설정은 그림 2와 그림 3에 표시되고, 배아 분리의 일반적인 단계는 그림 4에 표시됩니다. 1. 재료 및 버퍼 준비 유리 microcapillaries 1.1 실리콘 코팅 <ol><li> Sigmacote (시그마)의 ~ 5 ml의 15 ML 팔콘 튜브에 microcapillaries를 놓고 여러 번 반전. </li><li> 용액을 제거, 60 ℃에서 알루미늄 호일에 모세 혈관을 포함 팔콘 튜브를 배치하고 3 시간을 위해 그들을 구울 상온에서 보관하십시오. </li></ol> 1.2 ~ 50-100 μm의 직경 microcapillary 정보를 얻을 <ol><li> 수동 분젠 버너를 통해 또는 상용 풀러 (수직 필라멘트 끌어 당기는 사람 또는 micropipette의 풀러)를 사용하여 하나 1mm 직경의 유리 모세관을 당기십시오. </li><li> 다이아몬드를 사용팁 펜이나 원하는 구멍을 만들 뽑아 모세관의 끝 부분을 잘라 블레이드. 스테레오 현미경 제일 모양의 모세 혈관을 선택합니다. 오프닝은 50 ~ 100 μm의 (그림 2)이어야한다. </li></ol> 1.3 슬라이드 준비 <ol><li> 5 분 Sigmacote (~ 1 ML / 슬라이드) 모든 우물을 커버하여 깨끗한 슬라이드를 Siliconize, 제거합니다. 알루미늄 호일 빵 3 시간. 상온에서 보관하십시오. </li><li> 10 % SDS, nuclease가없는 물에 2 × 2 분 (DEPC-DDH 2 O를 압력 가마로 소독), 70 % 에탄올에서 2 분, 100 % 에탄올에 2 분에서 10 분 동안 다 잘 유리 현미경 슬라이드를 씻어 공기 건조. 모든 단계는 멸균 코 플린 단지에서 수행됩니다. 슬라이드는 각각의 사용과 철저한 청소를 제공하는 여러 번 다시 사용할 수 있습니다. </li><li> 직전 배아 분리 확산 ~ 10 0.5 μL MG / ML 소 혈청 알부민 (BSA) 각 잘 공기 건조의 전체 표면에 피펫. </li></ol> 1.4 현미경 및 모세관 설정 &lt;OL&gt; <li> 10X 및 20X 배율 목적으로 거꾸로 현미경을 사용합니다. 빛의 명암을 최적화 (배아는 매우 투명). </li><li> 현미경 옆에있는 모세관 유리를 보유하는 micromanipulator에 놓습니다. 모세관 유리 고무 튜브를 통해 microinjector (그림 3A) 또는 일반 P-200 피펫에 연결되어 있습니다 (그림 3B,이 설정에 대한 자세한 설명은 설명을 참조하십시오). </li><li> ~ 70 ° 각도에서 현미경 슬라이드 (그림 3) 위의 모세 혈관을 배치하고 시야의 구멍을 가지고 위치를 조정합니다. </li><li> 직전 배아 분리를 차지 해제 ~ ~ 10 ㎕의 BSA (1 MG / ML) 코트 모세관을합니다. </li></ol> 1.5 버퍼 표 1은 다운 스트림 응용 프로그램에 따라 분리 및 대상 버퍼를 보여줍니다. <ol><li> ~ 샘플 당 1 ML 절연 버퍼 갓 전에 사용하고 얼음에 보관 준비. </li><li> 얼음 (분자 응용 프로그램) 또는 습기 챔버 현미경 슬라이드 (세포 학적 응용 프로그램)에서 0.5 ML Eppendorf의 낮은 바인딩 튜브 대상 버퍼를 준비합니다. </li></ol> 2. 씨앗 해부 및 배아 추출 종자 개발 2.1 동기화 <ol><li class="jove_content"> 꽃 거세와 다른 꽃과 노출 암술의 접촉을 피하면서 그 성장 챔버 2 일 보관 후, 그들 (예 : 11) 수분. </li><li class="jove_content"> 취소 씨의 현미경 조사하여 성장 조건에 따라 개발 단계를 테스트합니다. 4 DAP는 구상 굴복 - 우리의 성장 조건에 씨앗 (DAP) 수분 후 2.5 일 수집 (21에서 16 시간 빛 ° C, 18, 어두운 8 시간 ° C 및 70 % 습도) 주로 2-4 배아와 씨앗은 3.5 수집 나왔고 배아. </li></ol> 2.2 씨의 해부 및 파열 <ol><li> 의 제거를포셉과 인슐린 바늘 입체 현미경 하에서 15 siliques (~ 2.5 DAP)에서 eeds. </li><li> 얼음에 배치 2 ㎖ 둥근 바닥 에펜 도르프 튜브에 20 ㎕의 절연 버퍼에 씨앗을 담가. </li><li> 조심스럽게 씨앗 추출물 흐린 때까지 배아를 풀어 플라스틱 유봉 (DEPC-DDH 2 O로 세척, 10 % SDS로 미리 청소하고 70 % 에탄올로 세척)에 씨앗을 분쇄. 적용 할 힘은 재판시 모든 사용자에 의해 결정되어야한다. </li><li> 유봉을 씻어 샘플을 희석 분리 버퍼 300 μL와 유봉을 씻어. </li><li> 스핀 다운 5 초 동안 5,000 XG에서 추출합니다. 부드럽게 위아래 2 ~ 3 번 pipetting하여 펠렛 추출물을 resuspend을. </li><li> 30 μm의 나일론 메쉬 (PartecCelltricks에서 예를 들어, 튜브 어댑터에 장착)와 추출물을 필터링합니다. 추가 200 μL 절연 버퍼 메쉬를 씻어. </li></ol> 3. 배아 분리 3.1 슬라이드 준비 <ol> &lt;리&gt; 장소 거꾸로 현미경의 무대에 깨끗하고, BSA 코팅 및 실리콘 처리 다 잘 슬라이드 위아래로 부드럽게 pipetting하여 필터링 씨 추출물을 resuspend을 1 또는 2 우물에 40-50 μL 씨 추출물 2 방울을 피펫 . 한 번에 1 ~ 2 방울을 선별하여 샘플의 증발을 방지합니다. </li><li> 이전으로 준비 다른 슬라이드의 잘에 신선한 격리 버퍼의 장소 50 μL (1 차 세척 드롭). 증발을 방지하기 위해 덮인, 습기 챔버에이 슬라이드를 유지합니다. </li></ol> 3.2 스크린, 청소, 수집 <ol><li> 10X 배율 목적으로 원하는 단계에서 배아 종자 추출물의 방울을 화면. 필요한 경우, 20 배 배율로 단계를 확인합니다. 태아는 일반적으로 슬라이드의 바닥에 가라. </li><li> 수동 텅스텐 바늘, 인슐린 바늘 또는 이와 유사한 장비와 배아 주위에 파편을 제거합니다. </li><li> micromanipulator에, T를 사용하여 배아 근처 모세관 유리를 이동가능한 적은 솔루션으로와 배아까지 아케. </li><li> 여러 개의 배아를 (예를 들어, 모두 한 방울의) 수집 및 1 차 세척 드롭 (분자 응용 프로그램) 또는 대상 버퍼 (세포 학적 응용 프로그램)에서 그들을 놓습니다. 각 수집 라운드 최소 볼륨 (모든 수집 라운드의 총 볼륨이 &lt;5 μL이어야한다)에서 수집해야 5-10 분, 배아 내에서 유지되어야한다. </li><li> 배아의 원하는 양 (중앙, 가능하면 기억을 용이하게하기 위해) 1 차 세척 드롭 수집 될 때까지 검사와 컬렉션을 반복합니다. </li><li> 세척 드롭 (파편이 이월 된 경우, 기억하기 전에 바늘을 제거)에서 한 번에 모든 배아를 채취. </li><li> 50 μL의 2 차 세척 드롭으로 배아를 놓습니다. 3.2.6 반복합니다. </li><li> 대상 버퍼에 배아를 놓습니다. 전송은 모세관 끝의 유일한 접촉, 그리고 침수를 포함해야합니다. </li><li> microcapil를 교체다음 샘플을 위해 라히. </li></ol>

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</ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

우리는 효과적인 급속 배아 분리 프로토콜을 개발, 쉽게 다른 실험실로 전송 될 수 있습니다. 여기에 설명 된 장비는 거꾸로 현미경, 미세 조작기, 유리 microcapillaries, 수직 필라멘트 풀러와 microinjector (그림 3A)으로 구성되어 있습니다. 설치가 전사 체학 분석 17 한 동물 세포 분리에 대해 설명한 것과 비슷합니다. 우리는 또한 성공적으로 유리 microcapillaries를 수동으로 불꽃을 통해 늘어 (와 다이아몬드 블레이드로 절단) 대신 microinjector의 표준 실험실 피펫 (Pipetman P-200) (그림 3B)를 통해 운영 하였다보다 기본적인 설치를했습니다. 이 경우 microcapillary은 고무 튜브를 통해 피펫에 부착되었다. 10 μL filtertips은 그들을 밀폐하기 위해 파라 필름 (parafilm)으로 포장 된 접합을 만드는 데 사용...

현화 식물의 배아는 배젖, 두 번째 수정 이벤트에서 파생 된 영양 조직으로 둘러싸여 있습니다. 모두 배아와 배유가 종피의 여러 세포 층에 의해 둘러싸여 있습니다. 종합적으로 이러한 조직은 과일 내부 개발 종자를 형성한다. 따라서, 조직 및 애기 장대 배아의 세포 별 분석은 강력하게 자신의 어려움으로 인해 손상됩니다. 그럼에도 불구하고, 늦은 구형 또는 이후 단계에서 배아는 비교적 잘 입체 현미경 하에서 미세 텅스텐 바늘을 사용하여 수동으로 해부 의무, 또는 그들을 추출하는 집게를 사용하여 초기에 약간의 압력을 적용하여 있습니다. 이러한 기술은 성공적으로 사체 또는 마이크로 어레이 하이브리드, 바이 설 파이트 시퀀싱, 또는 RNA 시퀀싱 (예 1-3)으로 epigenome 프로파일 분석에 사용 하였다. 반면, 초기 구상 단계에 수정란에서 배아의 연구는 기술적으로 도전 남아있다. 지금까지 몇 연구 담당자가고정 씨앗 섹션 4 좋은 도구 5를 사용하여 종자 내에서 개별 배아의 수동 추출에서 배아 조직 중 하나 레이저 캡처 microdissection을 (LCM)를 사용하여 젊은 배아 orted 사체 분석. 그러나 LCM 장비 초기 단계에서 일반적으로 사용되는 수동 배아 추출되지 않습니다 것은 시간이 쉽게 양도 할 수 없습니다 뛰어난 절개 기술을 소모하고 필요로하는 것입니다. 게놈 넓은 분석뿐만 아니라, 현장에서 유전자 발현 분석도 애기 장대의 젊은, 전체 마운트의 배아에서 수행하기가 어렵습니다. 어느 정도 젊은 배아는 씨앗 부드러운 압력에 의해 현미경 슬라이드에 해제 할 수 있습니다 (예를 들어 6,7 참조) 면역 염색하여 리포터 유전자 분석 또는 단백질 검출에 사용됩니다. 이 기술은, 그러나, 따라서 정량 분석​​을 방해, 높은 처리량 배아 분리를 허용하지 않습니다. 그러므로, 우리는 효율적이고 빠른 프로토콜을 개발쉽게 양도 및 다운 스트림 응용 프로그램의 다양한 적합한 설정이 간단하고 애기 장대 씨앗에서 초기 배아 분리합니다. 적절한 분리 버퍼에 플라스틱 유봉을 사용하여 에펜 도르프 튜브에 젊은 siliques에서 해부 - 기본 원칙은 부드럽게 씨앗을 분쇄하는 것입니다. 종자 추출물은 다 잘 슬라이드에 방울에 배치되어 거꾸로 현미경을 사용하여 원하는 단계에서 출시 된 배아의 존재 여부를 검사합니다. 배아는 유리 microinjector 또는 표준 실험실 피펫에 부착 microcapillary 사용하여 수집됩니다. 분자 응용 프로그램의 경우, 배아는 최소한의 볼륨에서 대상 버퍼로 전송하기 전에 새로운 절연 버퍼의 방울에 반복 릴리스 회 세척한다. 세포 학적 응용 프로그램 (기자 분석, 면역 염색, FISH)의 경우, 세척 단계는 생략 할 수 있습니다. 방법은 여러 가지 장점을 제공합니다 : (i)는 세포 학적 응용을위한 45 분 ~에 25-40 배아를 산출분자 응용 프로그램 (세척 단계 포함) lications 3-4 시간에서, (II) 그것은 특정 배아 단계의 분리는, (III)는 (IV), 쉽게 단순 설정에 따라 다른 사람과 실험실에 양도 할 수 있습니다 , 업그레이드에 대한 의무가 기본 설정을위한 저렴한 장비를 필요로하고, (v)이 성공적으로 RNA 염기 서열 8, 유전자의 특정 DNA 메틸화 분석 9, 기자 분석 (10 Raissig 등. 등 다양한 다운 스트림 응용 프로그램에 사용 된 의 준비.) 및 FISH (J. Jaenisch, U. Grossniklaus, C. Baroux되지 않은,)는 그림 5를 참조하십시오.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>SIGMA</td><td>SL2-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>RNAse OUT</td><td>Invitrogen (life technologies)</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>First- strand buffer</td><td>Invitrogen (life technologies)</td><td>18064-022</td><td>Superscript II 패키지에 포함</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Invitrogen (life technologies)</td><td>18064-022</td><td>Superscript II 패키지에 함유</td></tr> 소 <tr><td>혈청 알부민(BSA) 100x =10 mg/ml </td><td>New England Biolabs Inc.</td><td></td><td>다른 공급업체들도 작업할 것입니다</td></tr><tr><td>. 얇은 벽 캡슐 1.0 mm</td><td>세계 정밀 기기</td><td>TW100F-4</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind 튜브 0.5 ml</td><td>Vaudaux-Eppendorf</td><td>0030108.035</td><td></td></tr><tr><td>CellTrics&#916; 30 &#956; m</td><td>PARTEC</td><td>04-0042-2316</td><td></td></tr><tr><td>5웰 10mm 직경 슬라이드</td><td>전자 현미경 과학</td><td>63421-10</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus 슬라이드</td><td>Thermo Fisher</td><td>J1800AMNZ</td><td>Menzel-Gl&#228; ser</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amaresco</td><td>0497</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Applichem</td><td>A2937</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Fluka</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>SDS 펠릿</td><td>Roth</td><td>CN30.3</td><td></td></tr><tr><td>Micro Pestle</td><td>VWR</td><td>431-0094</td><td></td></tr><tr><td>Microfine 인슐린 주사기</td><td>BD</td><td>U-100</td><td></td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Schaurlau</td><td>ET00102500</td><td></td></tr><tr><td>집게 N5</td><td>Dumont</td><td>0108-5</td><td></td></tr><tr><td>생물분석기 피코 칩</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Nikon TMS (일본),</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Micromanipulator</td><td>Leitz</td><td></td><td>라이카</td></tr><tr><td>Micomanipulator 포스트 마운트 LH1 프로브</td><td>Leica microsystems</td><td>39430101</td><td>다른 브랜드도 작업을 수행합니다</td></tr><tr><td>수직 필라멘트 풀러</td><td>Sutter 기기</td><td>P-20 모델</td><td>다른 모델도 적합합니다 </td></tr><tr><td>Cell Tram vario</td><td>Vaudaux-Eppendorf</td><td>5176.000.033</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>2100</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 형광측정기</td><td>Invitrogen(생명 기술</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

에서 초기 단계의 배아의 효율적이고 신속한 분리<em&gt; 애기 장대</em&gt; 씨앗

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

배유 - - 임산부 씨 integuments (또는 종피)에 의해 둘러싸여 현화 식물에서 배아 영양 조직 내에서 개발하고 있습니다. 결과적으로, 초기 단계 (구상 단계 1 셀)에서 식물의 배아의 분리가 기술적으로 상대적인 어려움으로 인해 도전합니다. 초기 단계에서 효율적인 수동 박리 강력 젊은 애기 씨의 작은 크기와 주변 조직에 배아의 부착에 의해 손상된다. 여기, 우리는 다운 스트림 응용 프로그램에 따라 1 시간에서 4 시간 40 배아까지 항복, 젊은 애기 태아의 효율적인 분리를 허용하는 방법을 설명합니다. 배아는 약간 에펜 도르프 튜브에 플라스틱와 유 봉, 250-750 씨앗을 분쇄하여 분리 버퍼에 해제됩니다. 유리는 표준 실험실 피 펫 중 하나에 연결 microcapillary (고무 튜브를 통해) 또는 유압 제어 microinjector은 방울 곳에서 배아를 수집하는 데 사용됩니다거꾸로 광학 현미경에 다 잘 슬라이드 라. 필요한 전문 기술은 간단하고 쉽게 양도 할 수 있으며, 기본 설정 값 비싼 장비를 필요로하지 않습니다. 수집 된 배아는 RT-PCR, RNA 서열, DNA 메틸화 분석, 현장 하이브리드 화 (물고기)의 형광 면역 염색 및 리포터 유전자 분석과 같은 다운 스트림 응용 프로그램의 다양한 적합합니다.

세척이 분자 응용 프로그램에 대한 예를 들어, 수행하는 경우에 우리의 배아 분리 절차 (그림 1) 4 시간 40 배아까지의 분리를 허용하거나, 시간 미만의 세척은 생략 세포 학적 응용 프로그램의 예 경우. 그림 2는 표시 높고 낮은 품질 microcapillary 팁과 그림 3은 배아 분리 시스템의 설정을 보여줍니다. 그림 4는 거꾸로 현미경에서 배아 분리의 과정을 표시합니다. 우리는 성공적으로 몇 가지 최근 기사에 게시 된 다양한 애플리케이션을위한 우리의 절차를 적용했다. 이 방법은 원래 초기 배아 사체에 대한 부모의 기여도를 분석하기 위해 개발되었다. 두 개의 서로 다른 애기 accessions (란츠 베르크 erecta (L 어)와 컬럼비아 (골-1)) 사이의 교차를 통해...

우리의 개발 초기 단계에서 배아를 분리하는 효율적이고 간단한 방법을보고<em&gt; 애기 장대</em&gt; 씨앗. 최대 40 배아 다운 스트림 응용 프로그램에 따라 1 시간에서 4 시간으로 격리 할 수​​ 있습니다. 절차는 DNA 메틸화, 리포터 유전자 발현, 면역 염색 및 형광 사체에 적합합니다<em&gt; 현장에서</em&gt; 교잡 분석.

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

이 절차의 전반적인 목표는 어린 식물 배아를 분리하는 것입니다. 이것은 먼저 씨앗을 해부함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 격리 완충액에서 씨앗을 부드럽게 분쇄하는 것입니다.다음으로 배아를 스크리닝한 다음 도립 현미경 하에서 미세 흡인에 의해 수집합니다. 마지막 단계는 세척 후 최소한의 부피로 모든 배아를 회수하여 목적지 완충액으로 옮기는 것입니다. 궁극적으로 배아는 전사체 또는 후성유전체를 분석하기 위한 RNA 또는 DNA 추출에 사용되거나 유전자 리포터 분석 또는 형광 현장 혼성화와 같은 세포학적 분석에 사용될 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 식물 배아를 대량으로 그리고 특정 발달 단계에서 분리할 수 있다는 것입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 빠르고 효율적으로 적용하는 데 문제가 없습니다. 시작하려면 실체 현미경에서 이전에 실리콘화되어 당겨지고 절단된 가장 좋은 모양의 모세관을 선택합니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 개구부는 매끄럽고 약 50-100미크론이어야 합니다. 다음으로, 세제 세척 후 10% SDS에서 10분 동안 코플린 항아리에 있는 실리콘화된 다중 웰 유리 현미경 슬라이드를 세척합니다. 슬라이드를 2분 동안 두 번 씻습니다.뉴클레아제에서 70% 에탄올에서 2분 동안 100% 에탄올에서 2분 동안 물을 제거한 다음 자연 건조합니다. 그런 다음 약 0.5 마이크로 리터의 밀리리터 10 밀리그램, 소 혈청 알부민 또는 BSA를 각 웰의 전체 표면에 피펫으로 펴고 자연 건조시킵니다. 다음으로, 배아 분리 현미경을 준비합니다.10배 및 20배 배율 대물렌즈가 있는 도립 현미경을 사용합니다. 유리 모세관을 마이크로 인젝터에 연결하여 마이크로 모세관을 코팅합니다. 약 6마이크로리터의 BSA를 흡수하여 방출하십시오.원하는 발달 단계에서 교배 또는 자가 수정 발바닥을 따라 매끄럽게 수집합니다. 수분 후 2.5일이 여기에 사용되며 2-4개의 세포 배아를 포함합니다. 10-15 LIC의 씨앗을 집게와 인슐린이 있는 실체 현미경으로 제거합니다. 바늘.얼음 위에 놓인 2ml의 둥근 바닥 eend 튜브에 20마이크로리터의 분리 버퍼에 씨앗을 담그십시오. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 미리 세척된 플라스틱 절굿공이로 씨앗을 부드럽게 부수어 씨앗 추출물이 흐려질 때까지 배아를 방출합니다. 적용 권한은 평가판에서 모든 사용자가 결정합니다.유봉을 300마이크로리터의 분리 완충액으로 헹구어 유봉을 세척하고 샘플을 희석합니다. 원심분리 후 5초 동안 5, 000 chi에서 추출물을 스핀다운합니다. 펠릿화된 추출물을 위아래로 2-3회 피펫팅하여 부드럽게 재현탁합니다.튜브 어댑터에 장착된 30미크론 나일론 메쉬로 추출물을 여과하고 튜브를 스윙합니다. 추가로 200마이크로리터의 격리, 완충액 및 스윙으로 메쉬를 헹굽니다. 다시. 배아 분리를 위한 슬라이드를 준비하려면 도립 현미경의 스테이지에 깨끗한 BSA 코팅 및 실리콘 처리된 다중 웰 슬라이드를 놓습니다.슬라이드 위에 모세관을 놓고 필드에 구멍이 있도록 위치를 조정합니다. Resus 후, 40-50 마이크로리터의 종자 추출물 두 방울을 하나 또는 두 개의 웰에 부드럽게 위아래로 피펫팅하여 여과된 종자 추출물을 현탁시킵니다. 한 번에 하나 또는 두 방울만 스크리닝하면 샘플의 증발을 방지하고 이전과 같이 준비된 다른 슬라이드의 웰에 50마이크로리터의 새로운 분리 버퍼를 넣습니다.첫 번째 세척 방울로 사용됩니다. 증발을 방지하기 위해 이 슬라이드를 덮개가 있는 습한 챔버에 보관하십시오. 필요한 경우 10배 확대 대물렌즈를 사용하여 원하는 단계에서 배아에 대한 종자 추출물 방울을 스크리닝합니다.20배 배율로 스테이지를 확인합니다. 배아는 보통 미끄럼틀 바닥으로 가라앉습니다. 이 절차의 가장 중요한 측면은 최소한의 파편으로 배아를 수집하는 것입니다.이것은 텅스텐 바늘로 청소하고, 잠재적인 운반 파편에 대해 세척 방울을 조심스럽게 제어하고, 필요한 경우 wass를 반복하여 달성할 수 있습니다. 텅스텐 바늘, 인슐린 바늘 또는 이와 유사한 장비를 사용하여 배아 주변의 파편을 수동으로 제거합니다. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 유리 모세관을 배아 근처로 이동하고 가능한 한 적은 용액으로 배아를 흡수합니다.여러 개의 배아를 모아 첫 번째 세척에서 방출합니다. 방울. 세포학적 응용을 위한 분자 응용의 경우, 배아는 목적지 완충액으로 직접 이동할 수 있습니다. 각 채취 회차는 5분에서 10분 이내에 보관해야 하며, 배아는 최소한의 부피로 채취해야 합니다.첫 번째 세척 방울에 원하는 양의 배아가 모일 때까지 스크리닝 및 수집을 반복합니다. 파편이 세척 방울로 옮겨지면 방울에서 모든 배아를 한 번에 회수하기 전에 바늘로 제거하십시오. 배아를 50마이크로리터의 두 번째 세척 방울로 방출하고 회상을 반복합니다.마지막으로, 목적지 버퍼에서 배아를 방출합니다. 전달에는 표시된 모세관 팁의 침수가 아닌 접촉만 포함되어야 합니다. 다음은 세척 후 마지막 한 방울에 있는 몇 가지 배아입니다.분리된 식물 배아는 이제 배아 CD NA를 제어하기 위한 다양한 다운스트림 응용 분야에 사용할 수 있습니다. 염기서열분석 전의 라이브러리. 배아 특이적 전사체를 증폭하여 보여주었습니다. 다음은 CD NA에서 PCR 증폭 결과입니다. 2개에서 4개의 세포 배아를 한 번 세척한 라이브러리, 게놈 DNA에서 배아 분리는 배아 발현이 낮은 리포터 유전자 분석에 매우 유용한 것으로 입증되었으며, 여기에 표시된 모계 종피 검출을 혼란스럽게 하는 곳은 Madea 프로모터의 제어 하에 GUS 리포터 유전자를 발현하는 배아입니다.마지막으로, C의 형광 2 혼성화는 슬라이드의 아크릴아마이드 패드에 내장된 고립된 배아의 핵 구조를 연구하기 위해 적용되었습니다. centromere repeats 및 nuclear lower organizing region에 대한 프로브를 사용하는 예가 여기에 나와 있습니다. 이 기술을 완전히 익히면 세포학 응용 분야의 경우 1시간 이내에 30개의 배아를 분리할 수 있으며, 모든 세척 단계를 포함한 분자 응용 분야의 경우 3시간 이내에 배아를 분리할 수 있습니다.실제로, 이 기술을 통해 식물 연구 커뮤니티는 배발생에서 유전 및 후성유전학적 메커니즘을 탐구할 수 있습니다.

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연구

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Biology

생물학

이 동영상은 Arabidopsis 14 일 된 모종의 조직에서 그대로 protoplasts를 분리하는 절차를 보여줍니다. 격리 protoplasts 적어도 96h 위해 그대로 유지하고 대신 한 달 된 성숙한 식물의 모종으로부터 격리되는 감안할 때,이 절차는 그대로 protoplasts가 필요한 assays을 신속.

14 일 된 모종의 조직에서 Protoplasts의 분리 Arabidopsis thaliana</em

각인은 식물과 동물의 복제에 현상입니다. DNA의 methylation은 각인의 메커니즘에서 중요한 역할을합니다. 배젖를 분리 및 각인 유전자의 methylation 상태를...

에 각인 유전자의 DNA Methylation의 결정 Arabidopsis 배젖

우리는 애기 장대 씨앗에서 씨앗 코트 침구 분석 (SCBA)를 조립하는 절차를 제시한다. SCBA는 유전자와 체외에서 탐색 할 수있는 강력한 도구가 될 수 있도록 표시 방식 휴면 종자의 빛 신호에 대한 응답으로 배유 컨트롤 종자 발아. SCBA는 배유가 배아의 성장에 영향을 미칠 것으로 의심되는 모든 상황에서 적용 할 수있는 원리입니다.

유전자 탐구하는 종피 침구 분석<em&gt; 체외</em&gt; 어떻게 배젖 컨트롤 종자 발아에<em&gt; 애기 장대</em

목표는 콩과 식물이 아닌 애기장대 모델을 보완하기 위해 초기 식물 배아 발생의 조절을 조사하는 데 모델 콩과 식물 Medicago truncatula를 쉽게 사용할 수 있음을 설명하는 것입니다. 포드 형태학은 접합 배발생 단계와 관련이 있으며 조직 배양을 사용하여 배아를 수집하는 프로토콜도 제공됩니다.

모델 콩과 식물에서 초기 배아 발달의 규정 유학을위한 접합체 및 체세포 배아를 얻기위한 프로토콜<em&gt; Medicago truncatula</em

이 프로토콜 embryogenesis 애기 에 난 허가 뒤에 현미경으로 배아 패턴 형성의 검사를 통해 관찰 하는 방법을 설명 합니다.

애기 에서 Embryogenesis를 특성화 하는 방법

우리는 epifluorescence 현미경을 사용하여 애기장대 이중 수정에 있는 정액 핵 형태에 근거하여 성공또는 실패한 수정을 결정하는 방법을 보여줍니다.

애기장의 정자 핵 형태를 추적하여 수정 상태의 평가 이중 수정

아라비도프스탈리아나(Arabidopsis) 종자의 표면 살균을 위한 고처리량 프로토콜이 제공되어 진공 펌프로 구성된 간단한 흡입 장치로 액체 처리 단계를 최적화합니다. 수백 개의 종자 시료는 하루에 표면 살균될 수 있습니다.

애기장염 씨앗의 표면 살균을 위한 높은 처리량, 견고하고 매우 시간 유연한 방법

여기에서 우리는 난자의 수용성을 증가시키는 Arabidopsis thaliana에서 꽃가루 튜브 안내 및 수신을 관찰하기 위한 SIV(semi-in vitro) 방법의 개선을 설명합니다. 고처리량 SIV 겸 중격 방법은 배우자 마커 라인 및 유전적으로 인코딩된 바이오센서와 결합하여 수정의 동적 과정을 모니터링할 수 있습니다.

Arabidopsis 꽃가루관 수용 및 이중 수정의 실시간 이미징 semi-In vitro cum septum 방법을 사용한

Arabidopsis thaliana에서 꽃가루 수화 프로필을 측정하는 개선된 방법이 여기에 설명되어 있습니다. 새로운 방법은 더 높은 분해능을 제공하고 비침습적이며 재현성이 높습니다. 이 프로토콜은 수분의 초기 단계를 조절하는 과정을 보다 세밀하게 해부하기 위한 새로운 도구를 나타냅니다.

Arabidopsis thaliana에 대한 고분해능, 단일 입자, 생체 내 꽃가루 수화 생물학적 분석

이 프로토콜은 Arabidopsis thaliana 종자에서 배유 세포층의 온전한 샘플을 준비하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 주사 바늘 및 정밀 겸자와 같은 일반적인 실험실 장비만 필요하며 개발 중인 종자와 성숙한 종자 모두에서 배유 세포의 고해상도 형광 라이브 셀 이미징을 가능하게 합니다.

Preparation of intact tissue for microscopic analysis of the endosperm cell layer in Developing and mature Arabidopsis seeds(개발 및 성숙한 애기장대 종자에서 배유 세포층의 현미경 분석을 위한 온전한 조직의 준비)

배우세요 Arabidopsis thaliana 초기 배아 분리법을 통해 식물 발달 생물학 연구를 수행하는 방법을 알아보세요. 이 기술은 1시간 내에 최대 40개의 배아를 효율적으로 분리하여 RNA/DNA 추출 및 유전자 리포터 분석에 활용할 수 있습니다.

에서 초기 단계의 배아의 효율적이고 신속한 분리

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