생분해 성 플라스틱 뿌리 덮개 필름을 부셔 가능성이있는 기본 토양 미생물의 분리가 농업에 사용

다음 실험의 전반적인 목표는 생분해성 뿌리 덮개 필름에 서식하고 분해하는 토양 곰팡이와 박테리아를 분리하는 것입니다. 이것은 먼저 토착 토양 미생물에 의한 실질적인 집락화를 허용할 만큼 충분히 긴 토양의 메쉬 백에 생분해성 뿌리 덮개 필름을 배양함으로써 달성됩니다. 배양 후, 뿌리 덮개를 추출하고 희석 도금하여 밀접하게 관련된 각 미생물의 배양 가능한 유형의 단일 격리 군체를 생성합니다.

그런 다음 분리된 미생물을 신선한 표면, 감염되지 않은 생분해성 뿌리 덮개, 탄소원이 있거나 없는 한천 플레이트에 패치합니다. 성장을 비교하기 위해, 결과는 액체 매체에서 확인됩니다. 결과는 주사 전자 현미경을 기반으로 특정 분리물에 의한 집락화 및/또는 분해를 보여주며 겔 투과 크로마토그래피로 확인할 수 있습니다.

미확인 진균 및 박테리아 분리물로 작업하는 것은 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 장갑 착용, 배양 튜브 및 접시 밀봉, 생물 안전 캐비닛에서 작업과 같은 예방 조치를 항상 취해야 합니다. 토양에서 뿌리 덮개 조각을 배양하고 텍스트 프로토콜에 따라 배지와 시약을 준비한 후 새 뿌리 덮개 조각을 4.25cm 정사각형으로 잘라 뿌리 덮개 조각의 오염을 제거합니다. 플라스틱으로 만든 것과 같은 오토클레이브가 불가능한 뿌리 덮개 조각을 위해 변경하거나 저하시키지 않는 경우 오토클레이브하십시오.

텍스트 프로토콜에 따라 생물 안전 캐비닛을 준비한 후, 오염이 제거된 후드에 뿌리 덮개 조각을 일렬로 놓고 뿌리 덮개 조각을 자외선 아래에서 2시간 동안 배양하며, 깨끗하고 살균된 집게를 사용하여 앞줄부터 시작하여 새로 오염이 제거된 표면 위에 손과 팔을 올려 놓지 않도록 뒤쪽으로 작업합니다. 뿌리 덮개 조각을 뒤집어 감염되지 않은 면을 UV 광선에 노출되지만 이전에 뿌리 덮개와 접촉하지 않은 깨끗한 지역에 놓습니다. 양쪽에서 2 시간 동안 UV 처리 한 후 다시 앞에서 뒤로 작업합니다.

멸균 집게를 사용하여 생물 안전 캐비닛에서 뿌리 덮개 조각을 제거하고 호일로 덮인 비커와 같은 멸균 건조 용기에 넣습니다. 멸균 전사 후드 아래 어둠 속에서 실온에 보관하십시오. 무균 기술을 사용하여 한천 판의 표면에 UV 디스에 감염된 뿌리 덮개 조각을 놓고 한쪽 모서리를 먼저 부드럽게 놓고 사각형의 나머지 부분이 한천과 접촉하도록합니다.

비투수성 필름의 경우, 소수성 플라스틱의 초기 집락화를 위한 물과 영양 공급원을 제공하기 위해 뿌리 덮개 조각의 모서리 위에 용융된 반고체 매체의 10마이크로리터 방울 4개를 놓습니다. 뿌리 덮개 조각의 표면을 만지지 마십시오. 피펫 팁을 사용하면 방울이 구슬로 굳어집니다.

덮인 플레이트를 실온에서 밤새 똑바로 세워 배양하여 응고시킵니다. 그런 다음 플레이트를 섭씨 4도의 어둠 속에서 한천 면이 위로 향하게 하여 보관하십시오. 생물 검정에 필요한 모든 재료가 준비되었으며 토양에 묻혀 있는 뿌리 덮개 조각에서 잠재적인 뿌리 덮개 분해 곰팡이를 분리할 준비가 되었습니다.

토양에서 메쉬 백을 파내고 메쉬 백에서 뿌리 덮개 조각을 제거합니다. 멸균 주걱과 집게를 사용하여 표면에 달라붙는 흙을 방해하지 않고 뿌리 덮개에서 과도한 흙을 부드럽게 제거합니다. 0.5g의 물질이 회수될 때까지 BDM 필름을 1cm 정사각형 조각으로 자릅니다.

각 복제 샘플에 대해 0.5g의 뿌리 덮개 조각과 부착된 토양을 25밀리리터로 이동합니다. 9.5ml의 PBS를 함유한 배양 튜브는 토양 전용 대조 튜브 또는 뿌리 덮개가 완전히 분해된 샘플에 0.5g의 토양을 추가하여 생물막을 분해하고 뿌리 덮개 조각에서 세포를 분리합니다. 튜브를 고속으로 30초 동안 소용돌이친 다음 수조에서 10분 동안 초음파 처리한 다음 다시 소용돌이치게 합니다.

이것은 뿌리 덮개 조각과 관련된 미생물 세포의 균일한 현탁액을 생성해야 합니다. 샘플의 연속 희석용. 1개의 배양 튜브에 4.5ml의 멸균 PBS를 준비하고 원래 현탁액 튜브에서 샘플당 450마이크로리터의 PBS로 딥 웰 플레이트의 3웰을 채웁니다.

30초 동안 고속으로 볼텍싱한 후 5.0 곱하기 10에 음의 3차 희석을 얻기 위해 0.5 밀리리터를 멸균 PBS의 4.5 밀리리터로 옮기고, 5.0 곱하기 10에서 음의 6까지의 희석이 완료될 때까지 부드럽게 상하 10회 반복하여 96 웰 플레이트 믹스에서 PBS의 450 마이크로리터에 50 마이크로리터를 첨가합니다. 화염 멸균 된 구부러진 유리 막대를 사용하여 박테리아 성장을 억제하기 위해 클로람페니콜이 포함 된 PDA 플레이트의 한천 표면을 가로 질러 각 희석액에서 100 마이크로 리터를 고르게 펴십시오. 액체가 스며들 수 있도록 접시를 똑바로 세워 30분 동안 보관하십시오.

그런 다음 미확인 분리물에서 포자가 빠져나가는 것을 방지하기 위해 파라폼으로 플레이트를 밀봉합니다. 거꾸로 된 플레이트를 섭씨 20도의 어둠 속에서 5일 동안 배양하여 빠르게 자라는 곰팡이와 느리게 자라는 곰팡이가 모두 생물 안전 캐비닛에 군체를 형성할 수 있도록 합니다. 단일 멸균 이쑤시개를 사용하여 단일 분리된 집락에 대한 희석 플레이트를 검사합니다.

군체를 부드럽게 만진 다음 곰팡이 최소 매체, 곰팡이 최소 매체 및 플라스틱 및 포도당 최소 매체 플레이트의 한천을 만져 플라스틱 필름 위에 한천 구슬을 접종합니다. 이쑤시개로 한천 점 표면을 부드럽게 문지른 다음 플라스틱 필름을 가로질러 문지릅니다. 4개가 될 때까지 동일한 소스 콜로니에서 접종을 반복합니다.

5일 동안 어둠 속에서 섭씨 20도의 플레이트를 배양한 후 각 플레이트에 줄무늬를 복제합니다. 플레이트를 비교하여 한천 외에 탄소가 첨가되지 않은 최소 배지에서 자라는 것보다 뿌리 덮개 조각에서 더 잘 자라는 분리물을 식별합니다. 이들은 잠재적인 뿌리 덮개 분해제입니다.

GMM 플레이트는 매체에 포도당이 포함된 양성 대조 플레이트이기 때문에 가장 많은 성장을 포함해야 합니다. 이 시점에서 토양 분리물은 완전히 순수하지 않을 수 있으므로 멸균 이쑤시개를 사용하여 곰팡이에서 접종물을 긁어내고 뿌리 덮개를 식민지화한 다음 감자 포도당 한천에 분리하기 위해 줄무늬를 만든 다음 플레이트를 밀봉하고 5일 동안 배양합니다. 5일간의 부화 후, 하나의 고립된 군체가 생겨날 것이다.

이러한 새로운 정제된 콜로니가 원래의 잠재적으로 불순한 분리물에서 관찰된 것과 유사한 플레이트 생물학적 분석에서 뿌리 덮개 콜로화를 보여주는지 확인합니다. 이 최종 확인 분석에서 액체 생물학적 분석을 사용하여 플레이트 생물학적 분석 검증에 의해 잠재적인 뿌리 덮개 분해제가 확인되면 뿌리 덮개 아래에도 한천이 부족합니다. 조각은 이 엄격하게 준비된 배지에서 미생물 성장을 위한 진정한 유일한 탄소원으로, 미생물 분리물의 각 복제에 대해 다른 탄소가 추가되지 않은 곰팡이 배지에 대한 표면 디스감염 뿌리 덮개 조각에서 분석을 시작합니다.

접종을 위해 3개의 튜브를 준비합니다. 하나, 여기에 5밀리리터의 최소 배지가 있는 실험용 튜브에는 미리 결정된 크기의 뿌리 덮개 조각이 들어 있는 FMM이라고 표시되어 있습니다. 둘째, 탄소원이 없는 5ml의 최소 매체를 사용한 네거티브 컨트롤.

그리고 셋째, 액체를 함유한 포도당 5밀리리터를 함유한 양성 대조군. 여기서는 GMM이라고 표시되어 있습니다. 또한 테스트할 각 뿌리 덮개를 포함하는 최소 배지의 복제 튜브를 준비하되 접종하지는 않습니다.

이 제어 튜브는 신선한 포자를 성장시키고 수집한 후 오염으로 인한 미생물 성장을 보여줍니다. 텍스트 프로토콜에 따르면, 멸균 이송 후드에서 이전에 준비된 배양관에 100만 개의 포자 또는 효모 세포를 접종하고, 뚜껑을 밀봉한 후 섭씨 20도에서 흔들리지 않고 어둠 속에서 배양합니다. 성장을 위해 매주 샘플을 관찰하십시오.

뿌리 덮개 조각에서 곰팡이의 균사체 성장은 접종 후 첫 주 이내에 볼 수 있으며, 특히 사상 곰팡이가 뿌리 덮개 조각에 직접 부착될 가능성이 높기 때문에 600나노미터의 광학 밀도 판독으로 플랑크톤 효모 모니터 성장을 위한 뿌리 덮개 조각의 가장자리에서 볼 수 있습니다. 눈으로 성장을 평가하고 광학 현미경 및/또는 주사 전자 현미경으로 최소 매체 대조군으로 확인합니다. 너무 작아서 광학 밀도의 변화를 등록할 수 없는 미세한 흰색 플렉스를 찾으십시오.

분광 광도 측정 방법 사용. 페이스트르 피펫을 사용하여 굴곡을 흡인하고 차동 간섭을 사용하여 관찰합니다. 대조 현미경 검사: 양성 대조군인 Weed Guard Plus라는 셀룰로오스 뿌리 덮개와 Biore라고 하는 전분 기반 플라스틱 뿌리 덮개 모두에서 플레이트 생물학적 분석에서 세 가지 잠재적인 뿌리 덮개 분해 분리물을 분리했습니다.

그들은 68일 동안 액체 생물 분석에서 배양하고 주사 전자 현미경을 투여하기 전에 수확했습니다. 예상대로. XX 및 YY를 제외한 모든 샘플에서 곰팡이 hyphy가 관찰되었으며, 셀룰로오스 대조군 뿌리 덮개의 분리물에 대해 막대 모양의 세포가 관찰되었습니다.

FMM에서는 성장이 관찰되지 않았으며, 여기에서 볼 수 있듯이 UN에서 볼 수 있듯이 식물 유래 섬유의 뿌리 덮개 잔류 기관 요소와 뿌리 덮개에 대한 접종 된 대조군은 일부 섬유의 행에서 보이는 약간의 찌 자국으로만 감지 할 수 있었지만 셀룰로오스 대조군 뿌리 덮개의 3 개의 접종 된 샘플 모두에서 곰팡이 hyphy가 관찰되었습니다. 기관 요소는 SS 샘플에서만 명백하게 볼 수 있었으며, 이는 셀룰로오스 물질의 소화가 분리 된 SS 아래의 리그 화 된 기관 요소를 드러냈다는 것을 시사하며, DNA는 18 s 리보솜을 사용하여 DNA를 사용하여 잠정적으로 확인되었으며, 전분 기반 플라스틱 뿌리 덮개에 대한 소다 순서 내에서 소다 마이입니다. 분리물에서는 유의미한 성장이 관찰되지 않았으며, 분리물의 배양 튜브에서 소용돌이칠 때 보이는 단일 백색 스펙만 제어하며, VV 및 ZZ는 분리물 vv에 대한 미분 간섭 대비 현미경을 사용하여 관찰되었습니다.

사양은 포자 덩어리였으며 초기 접종에서 잔류한 것으로 추정됩니다. 격리 zz. 덩어리는 직경이 약 0.2mm인 느슨한 hyphy 메쉬로 구성되어 있었는데, 이는 원래의 포자 접종물이 발아했지만 여기에 표시된 질량 이상으로 자라지 않았음을 시사합니다.

여기에서 볼 수 있듯이 전분 기반 플라스틱 뿌리 덮개에 대한 UN 접종 통제에서 볼 수 있듯이 울퉁불퉁한 질감이 관찰됩니다. 흰색 특징의 정체는 알 수 없지만 여기에 표시된 분리 VV에 의해 식민지화된 필름에는 없습니다. 백색 입자와 범프는 모두 분리된 zz에 의해 식민지화된 필름에서 사라졌습니다.

또한, 후자의 샘플은 BDM 표면 분리체를 가로질러 균열이 균일하게 발생하는 것을 보여주었습니다. VV 및 ZZ는 at s 리보솜 DNA를 사용하여 각각 hypo 순으로 Penicillium 및 ACE로 잠정적으로 확인되었습니다. 이 방법은 농업 산업을 위한 플라스틱 뿌리 덮개의 생분해에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 환경에서의 생분해가 문제가 되는 다른 플라스틱에도 적용할 수 있습니다.

예를 들어, 해양 환경에 버려질 수 있는 플라스틱이 있습니다. 식품 산업에 사용됩니까? 나는.