Name: 생분해 성 플라스틱 뿌리 덮개 필름을 부셔 가능성이있는 기본 토양 미생물의 분리가 농업에 사용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 38 s
Description: 배우세요 생분해성 멀칭 필름에서 토양 미생물을 분리하고 분해 능력을 평가하는 방법을. 토양 미생물의 정착 과정을 연구하여 농업 실천 개선에 기여합니다.

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박사 스티븐 시의회 의원, 박사 데이비드 리프, 그리고 에린 매 크리는 기꺼이 현미경의 도움을 인정합니다. 이 연구는 NIFA 특수 작물 연구 이니셔티브, USDA SCRI-SREP 그랜트 상 제 2009-02484에서 부여를 통해 투자되었다. 브리아나 Kinash, 케빈 킨, 메간 레온 조셉 McCollum에, 마리아 McSharry 니콜 Sallee은 우수한 기술 지원과 사려 깊은 토론을 제공했다.

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저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

이 절차는이 문서의 토양에서 잠재적 인 BDM의 degraders을 분리하기위한 첫 단계 기술을 대표하는 기술, 성공적 7 개월 토양에 묻혀 BDMS에서 곰팡이를 분리하기 위해 사용되었다. 곰팡이 필름은 곰팡이 성장 억제되지 않은 것과 같은 종류의 신선한 BDM 자료에 reinoculated 때 분리 된 곰팡이가 실제로 식민지 개척자 이었다는 것을 나타내는 성장합니다. 플라스틱 분해 곰팡이와 박테리아의 분리는 잠재적 플라스틱이 저하 될 필요가 흙이나 퇴비 개정안에 대해 개별적으로 또는 조합에서의 사용으로 이어질 수 있습니다. 자신의 기본 토양 환경에서 미생물 종은 격리 존재하지 않습니다. 플라스틱 degraders 심지어 빈 영양 생물 BDMS 성장하지만, 다른 탄소와 에너지 소스를 사용하여,이 분해성 영양소 소스의 식민지에서 키스톤 종 될 수 있습니다. 체외에서 BDM 저하를 평가하지만, 더 실제 토양 microbi을 모방하기위한 노력방법은 여기에 설명 된 ...

고장 제품의 수명과 내구성을 단축하기 때문에 성능 저하가 역사적으로, 플라스틱 폴리머의 바람직하지 않은 특성을 고려하고있다. 최근 자연 환경 1,2,3에서 플라스틱 폐기물 제시 한 환경 문제의 인식은 생분해 성 플라스틱에게 기존의 플라스틱 재료에 대한 매력적인 대안을 만들었습니다. 저하 (구조 변경, 조각, 분자량의 감소, 무결성 및 강도 4,5로 정의)를 모두 비 생물 적 과정 (열 응력, 사진 산화, 가수 분해, 부식 및 기계적 응력) 등 일련의 사건,를 통해 발생 생물학적 분해 6. 비 생물 적 프로세스가 조각의 크기와 플라스틱의 특성을 변경할 수 있지만, 미생물이 물과 이산화탄소 (호기성 조건에서) 및 / 또는 메탄 (혐기성 조건 하에서)에 그들의 궁극적 인 광물이 필요합니다. 에 대한 상당한 틈새 시장플라스틱 뿌리 덮개는 토양 수분을 유지하고 토양 온도에게 7,8를 높이기 위해, 잡초 성장을 방지하기 위해 사용되는 생분해 성 플라스틱은 농업에 존재합니다. 혼자 미국에서 에이커의 수천 수백 생분해 성 플라스틱으로 구성된 뿌리 덮개 등의 플라스틱 뿌리 덮개 9 덮여있다. 작물 성장시기에 따라 생분해 뿌리 덮개 (BDMS)의 폐기에 대한 옵션은 매립지에서 폐기 에너지 회수 10 소각, 퇴비화를 통해 저하 또는 경작 11 후 토양의 저하를 이용하실 수 있습니다. 이들 중 가장 노동 집약적 인 운명이 토양에 BDMS 없어야하지만, 이외의 작물 개월 (일반적으로 겨울) 기간 동안 효율적인 분해 및 광물없이, 플라스틱 조각이 남아 농업 장비에 방해가 봄의 경작과 재배하는 동안, 그리고 수 그들은 크게 야생 동물, 식물의 생명 및 미생물 1,2,3,10에 영향을 미칠 환경에서 유지됩니다. <p claSS는 = &quot;jove_content&quot;&gt; 농업 뿌리 덮개 필름 등 많은 플라스틱 제품은, 실제로, 라벨은 &quot;생분해 성&quot;또는 &quot;퇴비&quot;부담되지만, 분해 및 광물 인 - 토양 분해 너무 비효율적 및 / 또는 너무 불완전 할 수는 수 이 제품의 폐기에 대한 대안. 예를 들어, 옥소 생물 분해성 폴리에틸렌은 퇴비의 온도가 25 ° C 12 살 때 ° C 퇴비 및 광물의 절반 이하 그 금액이 발생한 58에 풍화의 1 년 세 이후 개월 만 12.4 %의 광물을 달성했다. 겨울에는 대부분의 지역에서 토양 온도는 아마 더 낮은 미생물의 활동과 그 결과 적은 광물의 결과로, 이러한 온도의 하나보다 낮은 것이다. 분해 속도를 느리게하는 이외에, 용어 &quot;생분해 성&quot;의 오용은 농업 산업을 포함한 소비자 13,14, 이러한 제품의 불신하게되었다. 생분해 변환하는 것입니다이산화탄소 (및 / 또는 메탄) 및 미생물 4 자연적으로 발생하여 물을 14 고분자. 따라서 생분해 화학적으로 측정해야하며 기판과 미생물의 물리적 연결은 물질의 미생물 분해를 의미하지는 않습니다. 농업 BDMS의 지속 가능한 이용을 검토하기위한 노력의 일환으로,이 연구는 식민지와 시중 BDMS을 저하 농업 토양에 기본 미생물을 발견에 초점을 맞추었다. 표준 시험 방법은 화학적 무생물 및 생물 학적 의미 15,16,17하여 생분해 성 플라스틱의 분해를 측정 발표되었다. 그러나, 이러한 방법은 각각의 미생물 종에 의해 플라스틱의 저하를 주소 또는 분리하는 방법을 제공하지 않습니다. 방법은 여기에 더 밀접하게 곰팡이 포자 표본을 접종 한 후 미생물 분해에 저항 플라스틱을 평가하기위한 표준 방법과 유사18,19. 플라스틱의 공식이 알려진 원료의 소스를 사용할 때, 분말 플라스틱은 삭제 영역 13의 시각화에 의해 결정 한천 기반 미디어 및 저하가 중단 될 수 있습니다. 이 메서드는 폴리 우레탄 20와 같은 중합체를 분해 미생물, 폴리 (부틸 렌 숙시 네이트는-CO-아디 페이트) 21 폴리 (젖산) 22를 식별하기 위해 이전에 사용되었습니다. 유사한 방법 플라스틱 유일한 탄소원 6:20,23입니다 액체 배지에서 순수 분말 플라스틱을 중단 포함한다. 이러한 방법은 정의 된 시스템의 장점을 가지고 있지만, 그들은 가난 BDMS의 현장 저하 모방. BDMS가 토양 매트릭스에 걸쳐 작은 입자의 분산이 아니라, 판매 및 필름으로 사용되지 않기 때문에 먼저 표면적은 다르게 배포됩니다. 둘째, BDMS의 화학 메이크업은 순수 고분자 다릅니다. BDMS은 일반적으로 같은 첨가제를 포함충전제, 가소제 및 착색제, 이러한 첨가제함으로써 미생물의 성장과, 광물의 속도에 영향을 미칠 수 있습니다. 본 연구에서 특정 상업 영화의 구성은 그 현장 준비 형태로 독점, 플라스틱 필름 있었기 때문에 이러한 이유로, 그리고 곰팡이와 박테리아를 분리하기 위하여 이용되었다. 여기서 세균 고립감에 대한 적절한 수정주의와 단순화를 위해, 아래의 방법은, 곰팡이에 대해서만 설명합니다. 토양의 한 겨울의 최근 연구 24 세 시판 BDMS 한 실험 영화는 하나의 성장시기에 대한 미국의 세 가지 다른 지역에서 농업 현장에서 사용되었으며, 이후 메쉬 (250 미크론) 가방에 넣고 매장 같은 사이트에서. 250 미크론 메시 오프닝 뿌리와 대부분의 토양 군을 제외하고, 토양 잠식 25,26을 최소화하면서 곰팡이 균사가 침투 할 수 있습니다. 나일론 물자는 토양에서 백 저하를 방지합니다. 다음의 발굴, Fungal 분리는 BDM 조각에서 회수 한천을 제외한 탄소 소스와 5cm 사전 disinfested했다 새롭고, 사용되지 않고는 BDM 필름의 X 5cm 표면 disinfested 사각형을하지 않고 최소 배지에서 성장을 평가 하였다. 필름으로 사용되는 대부분의 플라스틱은 무결성의 손실없이 압력 가마로 소독 할 수없는, 그래서 UV 빛이 플라스틱에 존재하는 모든 미생물 세포를 죽이는 데 사용되었다. ISO 846 19 70 %의 에탄올과 이후 건조 표면 disinfesting 권장하지만이 방법을 사용하는 경우, 하나는 영화의 어떤 구성 요소 또는 첨가제에 악영향을 에탄올에 의해 영향을받지 않습니다 있는지 확인해야합니다. BDMS은 아마도 햇빛을 견딜 수 있도록 제조되어 있기 때문에, UV는 오염 제거 방법으로 선택되었다. 혼자 최소 배지에서보다 더 BDM 조각에서 자란 균주 추가 연구를 위해 선정되었다. 그것은 일반적으로 농업 적 및 의학적하지 않음으로써 대사 활용되지 않기 때문에 한천, 해조류에 의해 생성 된 다당류, 미생물 미디어를 공고히하는 데 사용됩니다수있는 미생물하지만, 한천 가수 분해 효소는 토양 28에서 분리 한 해양 세균 (27)와 한천 가수 분해 박테리아에서 분리되었다. BDM 고분자 한천 잠재적 인 영양 소스로 이러한 고분자를 포함하는 환경에서 진화하지 않은 토양 곰팡이에 의해 분비 효소 드문 기판 것으로 예상하지만, 두 기판 (7 단계) 여기에 설명 된 플레이트 생물 검정에 존재하는 둘. 탄소 소스로 BDMS 아니라 한천을 사용하는 곰팡이는 BDM 필름 (실험)) 한천 (대조군), II 제외 i)없이 추가 탄소원을 포함하는 한천 응고 매체에 성장을 비교하여, 전용 한천을 사용하여 곰팡이 구별 할 수 있습니다 및 ⅲ) 포도당 (양성 대조군). 모든 균주의 성장은 최소 배지 플러스 포도당에 예상되고, 곰팡이가 발생하지 포도당 함유 판은 실험에 사용 된 특정 최소 배지에서 성장을 할 수 없습니다. 적합한 한쌍알 BDM degraders 한천 - 응고 최소 배지 + 그들이 혼자 한천 응고 최소 배지에 성장보다 더 BDM 영화에 성장합니다. 최소 배지 접시에 성장하는 곰팡이 한천 degraders 또는 oligotrophs이고, 또한 생물 검정 플레이트에 BDM 영화와 관련된 배지에서 성장할 것으로 예상된다,하지만 영화 자체 (그들은 serendipitously 또한 BDM 고분자를 분해하지 않은 경우)에. 한천 활용되지 BDMS의에 의한 미생물의 성장을 보는 가능성을 제거하기 위해, 우리는 정의 국물 매체 (9 단계)에서 생물 검정과 한천 플레이트에 BDM 식민지에 대한 우리의 초기 분석을 따랐다. BDM 조각은 생물 검정 튜브에 알려진 유일한 탄소 소스를 나타낸다. 초기 심사 후, 그리고 분리의 글리세롤 주식을 되살리는에, 일부는 알려진 탄소 소스를 포함하지 않는 액체 정의 된 배지에서 부족한 만 볼 균사를 형성했다. 이러한 결과는 인수 균주 중 일부는 oligot 있다고 제안rophs - 탄소, 질소, 및 수성 환경이나 공기 29,30,31에있는 휘발성 물질로 기존에 하나 용해 다른 영양소의 매우 작은 양의 청소 성장할 생물. 18S 리보솜 DNA 분석을 통해 종 식별이 뷰를 지원으로 일치하는 균주의 대부분은 곰팡이 장군은 이전 oligotrophy 32 전시 보도했다. 일반적으로 saprophytes 있습니다 Oligotrophs은 환경 30의 범위에서 기판 활용 신진 대사 기능의 넓은 범위를 필요로합니다. 따라서, BDMS (아마도 특이한 효소 기능을 필요로하는)​​에서 우리가 격리 같은 곰팡이가 빈 영양 용량을 보여, 그리고 공기 지문, 먼지 또는 추적 휘발성 물질로부터 피부 오일 등의 미량 오염 물질에 성장할 수 있었던 것은 놀라운 일이 아니다. oligotrophs의 분리로 인해, 우리는 BDM 표면에 그 성장 혼자 BDM 고장을 추론하는 데 사용할 수 없습니다 결론을 내렸다. 방법은 여기에 SC에 우리의 노력을 반영하는 기술선의의 BDM 고장을위한 농업 토양에서 REEN 기본 BDM의 식민지 개척자.

<table><tbody><tr><td>감자 포도당 한천</td><td>Becton Dickinson</td><td>8X05491</td><td></td></tr><tr><td>한천</td><td>Fisher</td><td>BP 1423-2</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Acros 유기물</td><td>200-287-4</td><td></td></tr><tr><td>글루 타르 알데히드</td><td>Electon 현미경 과학</td><td>16216-10</td><td>독성</td></tr><tr><td>분 자체</td><td>Fisher</td><td>M-8892</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>E200</td><td></td></tr><tr><td>Contrex</td><td>Decon 연구소, Inc.</td><td>5204</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Pechiney 플라스틱 포장</td><td>S37440</td><td></td></tr><tr><td>완충제 및 매체용 미네랄 염</td><td>Fisher</td><td>다양한</td><td>공급 업체에서 이러한 시약을 판매합니다</td></tr></tbody></table>.

생분해 성 플라스틱 뿌리 덮개 필름을 부셔 가능성이있는 기본 토양 미생물의 분리가 농업에 사용

Isolation of Native Soil Microorganisms with Potential for Breaking Down Biodegradable Plastic Mulch Films Used in Agriculture

상업적으로 이용 가능한 생분해 뿌리 덮개 (BDM) 필름을 식민지 농업 토양에 기본 곰팡이를 격리 및 플라스틱을 저하 가능성에 대한 평가 하였다. 일반적으로 플라스틱의 공식이 알려진 원료의 소스를 사용할 때, 분말 플라스틱은 삭제 영역의 시각화에 의해 결정 한천 기반 미디어 및 저하가 중단 될 수 있습니다. 그러나,이 방법은 제대로 BDMS의 현장 저하 모방합니다. 첫째, BDMS은 토양 매트릭스에 걸쳐 작은 입자로 분산되지 않습니다. 둘째, BDMS 순수 고분자 상업적으로 판매되는 것이 아니라 미생물의 성장에 영향을 미칠 수있는 첨가제 (예를 들어, 필러, 가소제 및 염료)를 포함하는 필름으로하지 않습니다. 여기에 설명 된 절차는 토양 묻혀 뿌리 덮개 필름에서 얻은 분리에 사용 하였다. 발굴 BDMS에서 얻은 곰팡이 균주가 더 탄소원 전자를 포함하지 정의 배지 위에 누워 새로운 disinfested BDMS의 조각에 성장을 개별적으로 테스트 하였다한천 XCEPT. BDMS에서 자란 균주 더 BDMS이 유일한 추가 탄소원 있었다 액체 배지에서 테스트되었습니다. 약 10 주 후, 곰팡이 식민지와 BDM 저하는 주사 전자 현미경에 의해 평가되었다. 균주 리보솜 RNA 유전자 염기 서열 분석을 통해 확인 하였다. 이 보고서는 곰팡이 분리하는 방법을 설명하지만 박테리아는 대체 미디어 박테리아에 적합한 이러한 방법을 사용하여 분리 하였다. 우리의 방법론은 플라스틱 원료를 사용할 수 알 수 없거나하지하는 그대로 플라스틱 필름이나 제품의 고장을 조사 연구에 유용합니다. 그러나 우리의 접근 방식은 BDM 저하의 속도를 비교하기위한 정량적 방법을 제공하지 않습니다.

최근 연구 24, 4, &quot;생분해 성&quot;이라는 세 가지 상용 BDMS 각각 플러스 실험 영화와 기존의 플라스틱 제어, 마운트 버논, 워싱턴에서 2010 년 봄에 토마토 생산을위한 뿌리 덮개로 토양에 배치 된을 복제 녹스빌, 테네시, 그리고 러벅, 텍사스. 2010 년 가을, BDM 영화 사각형은 네 복제 플롯에 뿌리 덮개를 풍화 각에서 절단되고, 기본 토양은 뿌리 덮개 샘플을 절제했던 영역 바로 아래에서 제거되었습니다. 각 단계에 설명 된대로 BDM 광장은 나일론 메쉬 가방 안에 토양에 끼워 된 풍 화. 토양 전용 컨트롤도 포함되어 있습니다. 가방은 같은 플롯과 이전 뿌리 덮개로 덮여 행의 토양 7.5 cm에서 매장 및 7 개월 후 2011 년 봄 경작 때까지 자리에 남아 있었다. 백은 다음 삽으로 플롯에서 해제 플락 비닐 봉투에 배치하고, 다음날 배달 얼음 팩의 실험실로 발송되었다. &lt;P 클래스 = &quot;jove_content는&quot;&g...

라벨 플라스틱 필름은 &quot;생분해 성&quot;뿌리 덮개로 농업 사용을 위해 상업적으로 사용할 수 있습니다. 경작 매력적인 처리 방법을 나타냅니다 있지만, 현장 조건에서 분해가 제대로 이해된다. 본 연구의 목적은 현장 매장 한 후 플라스틱 뿌리 덮개 필름을 식민지 기본 토양 곰팡이와 박테리아를 분리하는 방법을 개발하는 것이 었습니다.

Fungi native to agricultural soils that colonized commercially available biodegradable mulch (BDM) films were isolated and assessed for potential to ...

다음 실험의 전반적인 목표는 생분해성 멀칭 필름에 정착하여 이를 분해하는 토양 곰팡이와 박테리아를 분리하는 것입니다. 이를 위해 먼저 생분해성 멀칭 필름을 메쉬 백에 넣어 토양 속에 충분한 시간 동안 배양함으로써 토착 토양 미생물이 상당 수준으로 정착하도록 합니다. 배양 후 멀칭 필름을 추출하여 희석 도말법으로 배양하면, 밀접하게 연관된 배양 가능한 각 미생물 유형의 단일 분리 콜로니를 얻을 수 있습니다.그런 다음 분리된 미생물을 탄소원 유무에 따른 한천 배지와 더불어, 소독된 생분해성 멀칭재의 신선한 표면에 도말합니다. 성장을 비교하기 위해 액체 배지에서 결과를 확인합니다. 주사 전자 현미경(SEM)을 통해 특정 분리 균주에 의한 군집 형성 및 분해 결과를 확인할 수 있으며, 이는 겔 투과 크로마토그래피(GPC)로 검증할 수 있습니다.미확인 곰팡이 및 박테리아 분리균을 다루는 것은 위험할 수 있으므로, 본 절차를 수행하는 동안에는 반드시 장갑 착용, 배양 튜브 및 접시 밀봉, 생물안전작업대 내 작업 등의 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오. 텍스트 프로토콜에 따라 토양에서 멀치 조각을 배양하고 배지와 시약을 준비한 후, 멀치 조각을 오염 제거하기 위해 새로운 멀치 조각을 4.25 centimeter 정사각형으로 자릅니다. 플라스틱 재질과 같이 오토클레이브가 불가능한 멀치 조각의 경우, 성질이 변하거나 분해되지 않는 범위 내에서 오토클레이브를 실시하십시오.텍스트 프로토콜에 따라 생물안전작업대를 준비한 후, 멸균된 후드 내에 멀치 조각들을 행으로 배치하고 UV 램프 아래에서 2시간 동안 배양합니다. 이때 멸균된 깨끗한 핀셋을 사용하며, 새로 멸균된 표면 위로 손이나 팔이 지나가지 않도록 앞줄부터 시작하여 뒷줄 방향으로 작업합니다. 멀치 조각들을 뒤집어, UV 광선에 노출되었으나 이전에 멀치와 접촉하지 않은 깨끗한 영역에 멸균된 면이 아래로 향하게 놓습니다. 다시 앞줄부터 뒷줄 순으로 작업하여 각 면을 2시간씩 UV 처리합니다.멸균 핀셋을 사용하여 생물안전작업대에서 멀치 조각을 꺼내어 호일로 덮은 비커와 같이 멸균된 건조 덮개 용기에 넣습니다. 이를 멸균 이송 후드 내의 암실 및 실온 상태로 보관합니다. 무균 조작법을 사용하여 UV 멸균된 멀치 조각의 한쪽 모서리부터 한거늘 천천히 한천 배지 표면에 내려놓고, 나머지 정사각형 부분이 배지에 부드럽게 닿도록 굴려줍니다.비투과성 필름의 경우, 소수성 플라스틱의 초기 군집 형성을 위한 수분 및 영양원을 공급하기 위해 반고체 상태의 용융 최소 배지 10 µL 방울 4개를 멀치 조각의 모서리 위에 떨어뜨립니다. 멀치 조각의 표면을 만지지 마십시오. 피펫 팁을 사용하면 방울이 비즈 형태로 굳어집니다.덮개가 덮인 플레이트를 실온에서 하룻밤 동안 똑바로 세워 배양하여 굳힙니다. 그 다음 플레이트의 한천 쪽이 위로 향하게 하여 4 °C의 암소에 보관합니다. 이제 바이오어세이에 필요한 모든 재료가 준비되었으므로, 토양에 매립되었던 멀치 조각으로부터 잠재적인 멀치 분해 곰팡이의 분리를 시작할 준비가 되었습니다.토양에서 메시 백을 파내고 메시 백에서 멀치 조각들을 제거합니다. 멸균된 스파출라와 핀셋을 사용하여 표면에 붙어 있는 토양을 건드리지 않고 멀치에서 과잉 토양을 조심스럽게 제거합니다. BDM 필름을 1 cm² 크기의 정사각형 조각으로 잘라 0.5 g의 재료를 얻을 때까지 반복합니다.각 반복 시료 전이 시, 0.5 g의 멀치 조각과 부착된 토양을 9.5 mL의 PBS가 포함된 25 mL 배양 튜브에 옮깁니다. 바이오필름을 분해하고 멀치 조각에서 세포를 분리하기 위해, 토양 전용 대조군 튜브 또는 멀치가 완전히 분해된 시료에는 토양 0.5 g을 추가합니다. 튜브를 고속으로 30초 동안 볼텍싱한 후, 항온 수조에서 10분 동안 초음파 처리하고 다시 볼텍싱합니다.이를 통해 멀치 조각에 부착되어 있던 미생물 세포의 균질한 현탁액을 얻을 수 있습니다. 시료의 연속 희석을 위해, 배양 튜브 하나에 4.5 milliliters의 멸균 PBS를 준비하고, 원래의 현탁액 튜브에서 시료를 취해 딥웰 플레이트의 웰 3개에 각각 450 microliters의 PBS를 채웁니다.0.5 milliliters를 4.5 milliliters의 멸균 PBS에 옮긴 후 30초 동안 고속으로 볼텍싱하여 5.0 × 10⁻³ 희석액을 만듭니다. 이 희석액 50 microliters를 96 웰 플레이트의 PBS 450 microliters에 추가하고, 피펫팅으로 10회 부드럽게 섞어줍니다. 이 과정을 5.0 × 10⁻⁶ 희석까지 반복합니다. 박테리아 성장을 억제하기 위해 클로람페니콜이 포함된 PDA 플레이트의 한천 표면에 각 희석액 100 microliters를 화염 멸균된 굽은 유리 막대로 고르게 도말합니다. 액체가 충분히 흡수되도록 플레이트를 세운 상태로 30분 동안 보관합니다.그 다음, 미확인 분리균에서 포자가 유출되는 것을 방지하기 위해 플레이트를 파라필름(paraform)으로 밀봉합니다. 생물안전작업대(biosafety cabinet) 내에서 플레이트를 뒤집어 20 °C의 암소에서 5일 동안 배양하여, 빠르게 자라는 진균과 느리게 자라는 진균 모두가 콜로니를 형성하도록 합니다. 멸균된 이쑤시개를 사용하여 희석 플레이트에서 단일 분리 콜로니를 확인합니다.콜로니를 살짝 터치한 다음, 곰팡이 최소 배지, 플라스틱이 포함된 곰팡이 최소 배지, 그리고 포도당 최소 배지 플레이트 순으로 한천(agar) 부위를 터치하여 플라스틱 필름 위의 한천 비드에 접종합니다. 이쑤시개로 한천 도트 표면을 부드럽게 문지른 다음 플라스틱 필름 위로 쓱 훑어줍니다. 동일한 기원 콜로니로부터 총 4개가 될 때까지 접종 과정을 반복합니다.플레이트를 20 °C의 암소에서 5일 동안 배양한 후, 각 플레이트에 다시 도말합니다. 플레이트를 비교하여 한천 외에 추가된 탄소원이 없는 최소 배지보다 멀치 조각에서 더 잘 성장하는 분리균을 식별합니다. 이들이 잠재적인 멀치 분해균입니다.GMM 플레이트는 배지에 glucose가 포함된 양성 대조군 플레이트이므로 성장이 가장 활발해야 합니다. 이 시점에서 토양 분리균이 완전히 순수하지 않을 수 있으므로, 멸균된 이쑤시개를 사용하여 멀치를 군락화하고 있는 균류로부터 접종원을 긁어내어 PDA(potato dextrose agar)에 분리 도말한 다음, 플레이트를 밀봉하고 5일 동안 배양하십시오. 5일간의 배양 후면 단일 분리 콜로니가 형성될 것입니다.새로 정제된 이 콜로니들이 플레이트 생물 분석에서 원래의 불순물이 섞였을 가능성이 있는 분리주에서 관찰된 것과 유사하게 멀치 군락 형성을 보이는지 확인하십시오. 플레이트 생물 분석을 통해 잠재적인 멀치 분해균이 식별되면, 멀치 아래에 한천이 없는 이 최종 확인 분석인 액체 생물 분석을 사용하여 검증하십시오. 엄격하게 준비된 이 배지에서는 멀치 조각이 미생물 성장을 위한 유일한 탄소원입니다. 분석을 시작하려면, 미생물 분리주의 각 반복구에 대해 다른 탄소가 추가되지 않은 곰팡이 배지에 표면 소독된 멀치 조각을 넣으십시오.접종을 위해 세 개의 튜브를 준비합니다. 첫 번째는 미리 정해진 크기의 멀치 조각이 포함된 5 mL의 최소 배지(여기서는 FMM으로 표시됨)가 들어 있는 실험군 튜브입니다. 두 번째는 탄소원이 포함되지 않은 5 mL의 최소 배지가 들어 있는 음성 대조군 튜브입니다.셋째, 5 mL의 포도당 함유 액체를 포함한 양성 대조군입니다. 여기서는 GMM으로 표시합니다. 또한, 테스트할 각 멀칭재가 포함된 최소 배지의 반복 실험 튜브를 준비하되, 접종은 하지 마십시오.이 대조군 튜브는 신선한 포자를 배양 및 수집한 후 오염으로 인해 발생한 미생물 성장을 확인하는 데 사용됩니다. 텍스트 프로토콜에 따라, 멸균 전사 후드 내에서 이전에 준비한 배양 튜브에 10^6개의 포자 또는 효모 세포를 접종하고, 캡을 밀봉한 후 20 °C의 암소에서 진탕 없이 배양합니다. 매주 샘플의 성장을 관찰하십시오.멀칭 조각 위 곰팡이의 균사 성장은 접종 후 첫 주 이내에 관찰될 수 있으며, 특히 멀칭 조각의 가장자리에서 두드러집니다. 사상균은 멀칭 조각에 직접 부착될 가능성이 높으므로, 플랑크톤성 효모의 성장은 600 nanometers에서의 흡광도(OD) 측정값을 통해 모니터링하십시오. 최소 배지만을 사용한 대조군에서 육안으로 성장을 평가하고, 광학 현미경 또는 주사 전자 현미경으로 이를 확인하십시오. 흡광도 변화를 기록하기에는 너무 작아 보이지 않는 미세한 흰색 조각들이 있는지 확인하십시오.분광 광도법을 사용하여 분석합니다. 플레이트 바이오어세이에서 양성 대조군인 cellulosic mulch인 weed guard plus와 전분 기반 플라스틱 mulch인 Biore 모두로부터 멀치 분해 가능성이 있는 3종의 분리균을 분리한 후, 파스퇴르 피펫으로 이를 흡입하여 미분 간섭 대비 현미경으로 관찰합니다.이들을 액체 생물 분석법으로 68일 동안 배양한 후 수확하여 주사 전자 현미경으로 관찰하였습니다. 예상대로, XX와 YY를 제외한 모든 샘플에서 균사가 관찰되었으며, 셀룰로오스 대조군 멀칭의 분리균에서는 막대 모양의 세포가 관찰되었습니다.여기 UN 접종 대조군에서 나타난 바와 같이, FMM 단독 대조군에서는 성장이 관찰되지 않았습니다. 잡초 방지 및 멀칭 잔류물 처리군의 경우, 식물 유래 섬유의 도관 요소는 일부 섬유의 열에서 보이는 약간의 곰보 모양 자국으로만 검출된 반면, 셀룰로오스 대조군 멀칭의 접종된 세 가지 샘플 모두에서는 균사가 관찰되었습니다. 도관 요소는 SS 샘플에서만 뚜렷하게 보였으며, 이는 셀룰로오스 물질의 분해로 인해 그 아래의 목질화된 도관 요소가 드러났음을 시사합니다. 분리주 SS는 18 s ribosomal DNA를 사용하여 전분 기반 플라스틱 멀칭의 sodas 목에 속하는 soda mye로 잠정적으로 확인되었습니다. 분리주들의 최소 배지 단독 대조군에서는 유의미한 성장이 관찰되지 않았으며, 분리주 VV와 ZZ의 배양 튜브를 흔들었을 때 보이는 단일한 흰색 입자들은 분리주 VV에 대해 미분 간섭 대비 현미경을 사용하여 관찰되었습니다.해당 반점은 포자 덩어리였으며, 아마도 초기 접종 시 남은 잔여물로 추정됩니다. 분리균 zz의 경우, 이 덩어리는 직경 약 0.2 millimeters의 느슨한 균사 망으로 구성되어 있었으며, 이는 원래의 포자 접종원이 발아했으나 여기에 표시된 덩어리 너머로 성장하지 않았음을 시사합니다.전분 기반 플라스틱 멀칭재의 UN 접종 대조군에서 보는 바와 같이, 울퉁불퉁한 질감이 관찰됩니다. 흰색 특징물의 정체는 알려지지 않았으나, 여기에 표시된 분리주 VV가 군락을 형성한 필름에서는 나타나지 않습니다. 분리주 zz가 군락을 형성한 필름에서는 흰색 입자와 돌기 모두 사라졌습니다.또한, 후자의 시료에서는 BDM 표면 분리균 전반에 걸쳐 균열이 균일하게 발생한 것이 확인되었습니다. VV와 ZZ는 rDNA를 이용하여 각각 Penicillium과 hypo 목의 ACE로 잠정 식별되었습니다. 이 방법은 농업 분야의 플라스틱 멀칭 필름 생분해에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 환경 내 생분해 여부가 논의되는 다른 모든 플라스틱에도 적용될 수 있습니다.예를 들어, 해양 환경으로 유입될 수 있는 플라스틱의 경우입니다. 식품 산업에 사용되는 것들인가요? I.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

폐수에서 침전된 고형물을 모방한 합성 슬러지가 파종된 밀봉된 무산소 반응기인 혐기성 소화조로 시작하십시오.슬러지에는 혼합 미생물 군집인 중온성 혐기성 미생물이 포함되어 있습니다.이 미생물은 적당한 온도에서 번성하며 슬러지 유기물의 소화를 촉진합니다.슬러지를 지속적으로 혼합하여 박테리아 활동을 유지하고 소화를 촉진합니다.나중에 생분해성 폴리머인 바이오플라스틱을 슬러지에 첨가합니다.배양하는 동안 가수분해 박테리아가 바이오플라스틱에 부착되어 수용성 화합물로 전환됩니다.그런 다음 발효 박테리아는 이러한 화합물을 단쇄 유기산인 휘발성 지방산으로 변환합니다.메탄을 생성하는 미생물인 메탄 생성 물질은 이러한 산을 활용하여 메탄 가스와 이산화탄소를 생성하여 바이오가스를 형성합니다.바이오가스는 출구를 통해 반응기를 빠져나가 가스 샘플링 백에 수집됩니다.이 공동 소화 방법을 사용하면 바이오 플라스틱과 슬러지를 재생 가능한 바이오가스로 효율적으로 소화할 수 있습니다.

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오염은 모든 생물군석에 영향을 미칩니다. 해양 환경은 특히 지구상에서 가장 민감한 생태계 중 하나인 산호초에 영향을 미쳤습니다. 생물 정화는 오염 물질을 분해하는 유기체의 용량입니다. 여기에서, 우리는 산호에 대한 생물 정화 능력과 잠재적 인 프로바이오틱 특성을 제시하는 미생물을 분리하고 테스트하는 방법론을 설명합니다.

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여기에서, 우리는 재석회화 물질의 분해에 관여하는 곰팡이 균주를 찾기 위해 토양 생물 다양성을 스크리닝하기위한 프로토콜을 제시합니다. 첫째, 휴믹산 또는 리그노셀룰로오스 상에서 성장할 수 있는 곰팡이 균주가 분리된다. 그들의 활성은 효소 분석과 탄화수소 및 플라스틱과 같은 오염 물질에 대해 테스트됩니다.

석회화 물질의 분해에 관여하는 곰팡이에 대한 토양 생물 다양성으로부터의 분리 및 스크리닝

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iChip 기술은 토양에서 새로운 미생물 발견 속도를 높이는 저렴하고 간단한 현장 격리 장치를 사용합니다. 새로운 미생물은 다른 응용 분야 중에서도 토양 미생물 군집 또는 천연 제품 발견과 관련된 추가 연구에 사용할 수 있습니다.

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우리는 글루코사민과 흙에서 추출한 muramic 산성의 aldonitrile 아세트산 유도체의 GC-기반의 분석을위한 메소드 프로토콜을 설명합니다. 화학적 메커니즘의 해설 들어, 우리는 또한 유도체와 전자 이온화 따라 형성된 이온 조각의 구조를 확인하기위한 전략을 제시한다.

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