Name: 마우스 췌장 섬의 분리 및 세포 내 cAMP를 결정하는 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 33 s
Description: 학습하세요 마우스 췌장 섬 분리 및 cAMP 측정 방법을 통해 당뇨병 연구에서 β세포 기능을 평가하는 기술을. 효소 면역분석법으로 세포 내 신호전달을 정량 분석합니다.

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우리는이 작업에 설명 된 프로토콜에 대한 전문 기술 지원을 르네 L. Pasker 및 Harpreet K. Brar에게 감사의 말씀을 전합니다. 또한, 우리는 우리에게 시간을 허용 자신의 실험실 구성원의 지원과 함께, 위스콘신 - 매디슨 대학의 듀크 대학 앨런 D. Attie 크리스토퍼 B. Newgard의 멘토링을 인정하고 최적화하기 위해 필요한 지원하고자하는 설명 프로토콜. 특히, 우리는 생산적인 토론과 조언을 Attie 연구소의 한스 Hohmeier, Danhong 루, 헬레나 윈필드 Newgard 연구소의 마리아 Rabaglia 감사합니다. 이 작품은 NIH 부여 DK080845 및 청소년 당뇨병 594에 의해 지원되었다 (MEK에 대한) 연구 재단 보조금 17-2011-608

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저자가 공개하는 게 없다.

세계 인구의 19.5 %에 영향을 미칠 것으로 예상 당뇨병의 유병율로, 신규의 연구 기술의 요구 사항을 모두 이해하고 18 당뇨병을 치료하는 데 필수적이다. 본 섬 격리는 시험관 실험에 사용되는 잘 확립 된 프로토콜이며, 약간의 수정을 11,14,16으로 이전에 제시되어 있습니다. 인슐린 분비는 캠프와 같은 업스트림 구성 요소에 초점을 맞추고, 고립 된 섬에 대한 일반적인 다운 스트림 응용 프로그램이지만, 인슐린 생산과 분비를 증강 메커니즘을 묘사하는 데 도움이 될 수 있습니다. 안락사의 선택은 실험 동물의 인도적인 처리뿐만 아니라, 실험 측정의 무결성을 모두 확인하기 위해 신중하셔야합니다. 그 전에 췌장 시간의 최대 금액에 대한 산소를 혈액으로 섬의 관류를 허용하는 섬의 분리를 위해, 마취하에 일어난 과다 출혈은 안락사에 대한 우리의 선호하는 방법입니다인플레이션. CO 2 흡입이 인도적인 프로토콜에 ...

euglycemia의 엄격한 관리는 조절되지 않는 제 1 형과 제 2 형 당뇨병 1의 병리의 모든 특징입니다과 같은 신경 병증, 신장 병증, 망막 병증과 같은 합병증을 방지하기 위해 필수적입니다. 제 1 형 및 2 형 당뇨병을 모두 감소 β-세포 기능 및 질량은 혈당 농도를 2 교란. 인슐린을 생산하는 β-세포, 손상된 β-세포의 인슐린 분비 및 형식 주변 인슐린 신호 2 형 당뇨병의 엄청난 손실 면역 매개 성 제 1 형 당뇨병의 결과를 함께 고혈당, 이상 지질 혈증, 결국 결과 증가 간 포도당 생산을 촉진하는 반면 각각의 β-세포 3 β-세포 질량과 인슐린 분비 능력의 상실. 모두 제 1 형 및 2 형 당뇨병의 진행에 기본 β-세포의 메커니즘을 이해하는 것은 희망이 질병을 예방하고 치료하는 새로운 치료로 상승을 줄 것이다. 체외 TI의그러한 INS-1과 같은 MIN6 ssue 배양 모델은, β-세포 라인을 불멸화 특정 β-세포의 기능을 이해하는데 유용한 도구가 될 수있다. 그러나, 베이 내의 상이한 세포 유형 간의 상호 작용 자체는 β-세포의 기능을 조절할 수있다. 예를 들어, 글루카곤의 주변 분비 영향 (α-세포에서 방출)과 인슐린 분비를 증가 및 감소에 소마토스타틴은 (δ-세포에서 방출), 각각 내분비 응답 4 셀 전지 근접의 중요성을 보여줍니다. 또한, β-세포 사이의 간극 결합 인슐린 5의 출시를 주다. 진보는 더 나은 포도당 고립 된 섬의 생리적 반응을 복제 인슐린 라인을 생성하는되었습니다 있지만 또한, (예를 들어, INS-1 유래 13분의 832 및 3분의 832 세포주), 자신의 포도당 응답은 여전히 정상 쥐와 다르다 6,7 섬. 또한, 이들 클론 인슐린 종 세포주 응답글루카곤 유사 펩타이드 -1 (GLP-1)의 효능을 서로 극적 다를뿐만 아니라, 통상의 아일렛 6 개있다. 따라서, 불후의 세포 라인 에이전트에게 캠프의 생산에 영향을 미치는 시금에 가장 적합한 모델을 대표하지 않을 수 있습니다. 인슐린 유래 세포 라인과는 대조적으로, 전체 동물 모델에서 유일하게 β-세포의 기능을 연구하는 것은 합병증의 자신의 세트를 제공합니다. 내분비 조직 작업에서 가장 큰 과제 중 하나는 방출 호르몬의 정확한 농도를 측정한다. 구체적으로, 간은 인슐린 대사에 중요한 역할을하고, 췌장의 혈류가 간으로 직접 진행한다. 따라서, 혈장 인슐린 둘레 정확하게 췌장 자체 또는 인슐린 분비 (8)의 속도에 다른 처리의 영향에서 분비되는 인슐린의 양을 묘사 할 수 없습니다. 또한, 글루카곤의 신 대사는 섬의 α-세포에서 글루카곤 9 출력의 신뢰성을 제한 할 수 있습니다. 따라서, 생체 외 실험에 대한 기본 마우스 섬을 분리하는 것은 섬이 생체 내에서 만들어 측정을 보완하기 위해 특정 자극에 응답하는 방식에 대한 정확한 이해를 제공합니다. 마우스 섬의 분리를위한 의정서는 (성공을 증가하는 데 도움이 될 수 있습니다 약간의 수정) 그룹의 수 (10, 11)에 의해 사용되는 잘 확립 된 프로토콜입니다. 또한, cAMP의 생산의 결정은 β-세포의 인크 레틴 반응성 직접 판독을 허용한다. 캠프 측정, 단백질 함량 및 인슐린 분비와 함께 또한 β-세포 기능에 결함이 캠프 10 근위부 또는 원위부 놓여 있는지 여부를 확인하는 데 도움이 같은 캠프 샘플 준비에서 정량화 할 수있다. 이 프로토콜의 마지막 캠프의 내용과 인슐린 분비 응용 프로그램이 다른 가운데, 제약 및식이 성분의 영향을 이해하기위한 매우 강력한 도구가 될 수 있습니다의, 캠프 및 인슐린 분비에. 단독 포도당의 자극 이외에, 다른 화합물이 캠프 및 인슐린 분비 10,11 변화를 측정하는데 사용될 수있다. 인슐린은 우리가 절연 아일렛 같은 글루카곤 및 소마토스타틴 같은 다른 호르몬,뿐만 아니라 사이토 카인, 에이코 사 노이드, 및 사이 클릭 아데노신 모노 포스페이트 것으로 분석 차 호르몬이지만 마지막으로, 또한 과도 자극 분석 또는 정량함으로써 역시 측정 할 수있다 문화 매체 (12)에서 자신의 수준. 마지막으로, 다른 많은 다운 스트림 애플리케이션 등 섬 이식, PCR이나 마이크로 어레이 분석 정량 실시간에 대한 RNA 분리, 단백질로, 추구 할 수 있도록 외부에서이 원고의 범위, 기술 콜라게나 분리 방법 섬 격리 섬 보존 할 수 있지만, 웨스턴 블로 팅, 섬 매립 및 면역 형광 이미징 및 섬 세포 repli의 척도로서 [3H] - 티미 딘 설립을위한 격리이전 조브 기사 13-16에서 설명 된 일부 양이온. 전반적으로, 프로토콜에 설명 된 섬 격리 절차에 따라 치료법을 개발 및 β-세포의 기능을 강화하기위한 신약 개발을 촉진하기위한 중요하고 유용한 정보를 연구자를 제공 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>활성 섬 분리에 적합한 Clostridium histolyticum의 콜라겐 분해 효소</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7657</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9378</td><td></td></tr><tr><td>Hanks Balanced Salt Solution 10X</td><td>Invitrogen (Gibco)</td><td>14065-056</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 (powder)</td><td>Invitrogen (기브코)</td><td>31800-022</td><td></td></tr><tr><td>소 세럼에서 알부민 (BSA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A7888</td><td></td></tr><tr><td>3/0 실크 봉합사</td><td>세밀 과학 도구</td><td>18020-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 펜치</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>0.8 mm 펜치&nbsp; &nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>곡선 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>14061-10</td><td></td></tr><tr><td>Vannas-T&uuml; bingen 스프링 가위 - 스트레이트/샤프/8.5cm/5mm 커팅 엣지</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>해부 가위</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>14002-14</td><td></td></tr><tr><td>5 ml BD Luer-Lok 주사기</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>1 ml BD 주사기</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>30 G BD 바늘 1/2" 길이</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>27 G BD 바늘 1/2" 길이</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>숫돌</td><td>미세 과학 도구</td><td>29008-01</td><td></td></tr><tr><td>2-2-2-트리브로모에탄올</td><td>시그마-알드리치</td><td>T48402-25G</td><td></td></tr><tr><td>2-메틸-2-부탄올</td><td>시그마-알드리치</td><td>240486-100mL</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨(NaCl)</td><td>시그마-알드리치</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>시그마-알드리치</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>인산일칼륨(KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>중탄산나트륨(NaCHO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&#183; 2H2O</td><td>시그마-알드리치</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&#183; 7H2O</td><td>시그마-알드리치</td><td>M9397</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>인비트로겐(Gibco)</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>열 비활성화 소 태아 혈청(H.I. FBS)</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>SH30088.03HI</td><td></td></tr><tr><td>3-이소부틸-1-메틸크산틴(IBMX)</td><td>시그마-알드리치</td><td>5879-100MG</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 췌장 섬의 분리 및 세포 내 camp를 결정하는 방법

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

조절되지 않는 혈당은 당뇨병의 특징이며, 신경 병증, 신장 병증, 망막 병증과 같은 합병증을 촉진합니다. 당뇨병, 면역 매개 형 1과 비만 연결된 제 2 형 모두, 당뇨병의 병태 생리 및 치료 메커니즘을 서술하기위한 연구의 증가 유행으로 매우 중요하다. 췌장의 랑게르한스 섬의 β-세포가 적절하게 혈중 포도당 농도에 반응하여 인슐린을 분비하는 책임이 있습니다. 포도당 및 다른 영양소는, β-세포가 특정 호르몬에 의해 자극 또한, 세포 내 환상 아데노신 모노 포스페이트의 생산을 증가 β-세포 수용체의 식사 행동에 대한 응답으로 창자에서 분비되는 인크 레틴을, (라고 캠프). 감소 β-세포 기능, 대용량 및 인크 레틴 응답은 2 형 당뇨병의 병태 생리에 기여하는 잘 이해하고, 또한 점점 위스콘신 연결되고있다일 1 형 당뇨병. 본 마우스 섬 격리 및 캠프 결정 프로토콜은 질병의 진행 및 치료 적 개입, 세포 내 cAMP의 생산의 조절을 통해 행동 수용체를 인크 레틴 수용체에 의해 매개 또는 관련되는 특히 증진 메커니즘을 묘사하는 데 도움이 도구가 될 수 있습니다. 전용의 cAMP 측정이 설명 될 것이지만, 기술 된 아일렛 분리 프로토콜은 포도당, 인슐린 분비, [3 H] - 티미 딘 혼입 단백질 풍부하고, mRNA 발현을 자극 포함한 다른 많은 다운 스트림 애플리케이션을 허용 깨끗한 제제를 생성한다.

격리 기간 동안 높은 섬 수익률을 보장하기 위해, 프로토콜에 설명 된 수술 기법을주의 깊게 추적 관찰을해야한다. 여기에 제시된 기술은 각 실험실에 맞게됩니다 만, 성공적인 분리로 이어질 것입니다 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 담관이 쉽게 접근 할 수 있도록하기 위해서는, 장기가 마우스의 오른쪽 (도 1)로 변위하는 것을 추천합니다. 더욱이, 이러한 제한은 적은 무게가 팽창되기 때문에 췌장 저항의 작은 양으로 팽창하는 것을 허용 할 것이다. 섬 수익률을 극대화하는 또 다른 중요한 단계는 Oddi의 괄약근 (그림 2A-C)에 가까운 담관 결찰입니다. 멀리 Oddi 하구로부터 결찰하는 주요 췌관들이 콜라겐 분해 효소 용액의 양을 감소시킴으로써 부분적 팽창이 발생할 수있다. 또한, 팽팽 매듭 부위 들어가는 콜라게나 제 용액을 방지 할 것이다. &lt;P 클래스 = &quot;jove_content&quot;&gt; 담관에 적절한 절개가 충분히 멀리 간하지만 최대...

랑게르한스의 고립 된 마우스 독도를 이용하여 체외 β-세포 기능을 시금 당뇨병의 병태 생리 및 치료의 연구에 중요한 구성 요소입니다. 많은 다운 스트림 응용 프로그램을 사용할 수 있지만,이 프로토콜은 특히 β-세포의 기능을 결정하는 중요한 매개 변수로 세포 내 순환 아데노신 monophosphate (캠프)의 측정에 대해 설명합니다.

마우스 췌장 섬의 분리 및 세포 내 cAMP를 결정하는 방법

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

본 절차의 전반적인 목적은 다양한 실험적 처리에 따른 cyclic AMP 생성의 차이를 측정하기 위해 건강한 islet을 분리하는 것입니다. 이는 먼저 췌장을 팽창시킨 후 두 번째 단계에서 제거함으로써 수행됩니다. 건강한 islet은 일련의 원심분리와 세척 과정을 통해 분리됩니다.다음으로, 생존 가능한 안구렛(eyelets)을 신선한 islet 배양 배지로 옮겨 밤새 배양합니다. 마지막 단계에서는 안구렛을 원하는 실험 처리에 노출시킨 후 cyclic AMP 분석을 수행합니다. 최종적으로, 효소 면역 분석법을 사용하여 안구렛에 적용된 다양한 처리에 따른 cyclic AMP 생성 변화를 측정합니다.일반적으로 이 방법이 처음인 사람은 췌장을 완전히 팽창시키는 데 많은 연습이 필요하므로 어려움을 겪을 수 있습니다. 먼저 시린지와 캐뉼라에 5 mL의 콜라게나제 용액을 미리 충전하십시오. 끝이 뭉툭한 30게이지 바늘을 캐뉼라에 장착한 후 시린지와 캐뉼라를 얼음 위에 둡니다.소장을 생쥐의 오른쪽으로 옮긴 후, 총담관의 끝부분에 위치하며 소장 위로 펼쳐져 하얀 삼각형 모양을 이루는 오디 괄약근을 찾습니다. 괄약근의 위치를 확인했다면, 5번 듀몬 핀셋을 사용하여 핀셋 끝을 총담관 아래로 밀어 넣어 소장에 최대한 가깝게 위치시킵니다. 이때 담관을 뚫지 않도록 주의하십시오.소장과 결합 조직을 관통한 후, dumont 포셉의 팁을 사용하여 봉합사를 잡고 총담관 아래로 당깁니다. 누출을 방지하기 위해 매듭을 단단히 조이면서, 오디 괄약근(sphincter of OD)에 최대한 가깝게 총담관을 결찰합니다. 다음으로, 봉합사의 양끝을 잡고 꼬리 쪽으로 당겨 총담관에 약간의 장력을 줍니다.그런 다음, 한 손으로 공통 담관의 양 끝 끈을 잡아 팽팽하게 유지한 상태에서, 간으로 갈라지는 마지막 분지 바로 위의 공통 담관을 마이크로 가위로 작게 절개합니다. 아이스 버킷에서 시린지와 캐뉼라를 꺼냅니다. 시린지를 내려놓고, 준비된 끝이 뭉툭한 30 gauge 바늘을 절개 부위에 삽입합니다.총담관입니다. 관 벽을 뚫지 않도록 주의하십시오. 췌장을 완전히 팽창시키는 것이 가장 까다로운 부분입니다.밀폐가 잘 되는 바늘을 사용합니다. 첫 번째 바늘로 밀폐가 충분히 되지 않는 경우, 27 gauge 바늘과 같이 더 굵은 바늘을 사용하십시오. 이제 주사기의 플런저를 천천히 눌러 압력을 맥동식으로 서서히 낮추며 췌장의 첫 부분이 팽창할 때까지 진행합니다.췌장이

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

다음 프로토콜은 가상 슬라이스 이미지에 대한 췌장 해부 과정을 설명하고, 전체 췌장에있는 모든 GFP - 태그 베타 세포의 후속 부량.

마우스의 췌장 베타 세포 질량의 원위치 부량에서

마우스 작은 섬 격리에 대한 자세한 설명은 collagenase와 중성 단백 분해 효소를 정제의 조합의 현장 췌장 ductal cannulation 및 재관류에의 기술을 사용하여 설명되어 있습니다.

Langerhans 절연의 마우스 작은 섬은 정화의 Collagenase와 중성 단백 분해 효소의 조합을 사용하여

랑게르한스 섬이라고도 불리는 췌장 섬은 포도당 조절 및 기타 중요한 생물학적 기능을 위한 호르몬을 생산하는 내분비 세포의 클러스터입니다. 이 프로토콜은 먼저 Vater의 Ampulla를 통해 콜라겐 분해 효소를 관류하여 외분비 췌장 조직을 소화하고 단순화 된 밀도 구배 원심 분리를 통해 췌장 섬을 분리하는 방법을 설명합니다.

콜라겐분해효소 관류를 통한 췌장섬 분리: 췌장섬 세포를 분리하는 효소 방법

우리는 여기에서 제2형 당뇨병의 마우스 모델, Leprdb에서 섬을 분리하기 위한 프로토콜과 2개의 광자 현미경을 사용하는 온전한 섬에서 인슐린 분비를 측정하기 위한 라이브 셀 분석의 세부 정보를 제시합니다.

Lepr<sup&gt; DB</sup&gt; 2 형 당뇨병의 마우스 모델 : 본래 독도 췌장 섬 세포의 분리 및 라이브 셀 2 광자 이미징

이 섬 격리 프로토콜은 외분비 조직을 소화하기 위해 콜라게나아제 주사의 새로운 경로를 설명하고 마우스로부터 섬을 정화하기 위한 단순화된 그라데이션 절차를 설명했다. 효소 소화, 그라데이션 분리/정제, 그리고 아일렛 수작업 피킹이 포함됩니다. 성공적인 절연은 마우스당 250~350개의 고품질 및 완전한 기능을 갖춘 아일렛을 생성할 수 있습니다.

마우스에서 췌장 췌도 격리를 위한 간단한 고효율 프로토콜

여기 우리는 잠재적인 diabetogenic xenobiotic 화학 물질 식별는 xenobiotics에 의해 선생님 inductions을 심사에 대 한 마우스 췌 장 섬 세포 격리 프로토콜을 제시.

Diabetogenic 환경 화학 물질에 대 한 Murine 췌 장 섬 세포 기반 검사

단일 셀 RNA 시퀀싱 뒤 미 발달, 신생아 및 산 후 췌 내 분 비 세포의 격리 하는 방법을 설명 합니다. 이 방법을 사용 하면 분석 췌 장 내 분 비 계보 개발의 셀이 transcriptomic 역학.

마우스 췌 장 내 분 비 세포의 단일 셀 Transcriptomic 분석

여기에서, 우리는 췌도 세포와 같은 이기종 세포 집단에 있는 칼슘 역학을 화상 진찰 그리고 정량화하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 형광 기자는 그 때 고정화되고 심상되는, 그리고 형광 강렬의 역학의 세포 당 분석이 수행되는 작은 틀 내의 세포의 말초 층으로 전달됩니다.

마우스 췌도 세포의 하위 집단에 있는 화상 진찰 칼슘 역학

이 프로토콜은 전체 췌장에서 마우스 내피 세포를 분리하는 방법을 설명합니다.

마우스 췌장 내피 세포의 분리

이 연구는 췌장섬에서 사이토카인 유도 세포사멸 및 세포 특이적 사멸을 평가하기 위해 컨포칼 현미경과 결합된 세포 사멸 및 세포자멸사에 대한 다중 염색 형광 기반 마커β 활용합니다. 그것은 세포 외 자극에 대한 반응으로 세포 사멸과 세포 사멸의 공간적, 시간적 변화를 보여줍니다.

Isolated Pancreatic Islet Treatment 및 Apoptosis 측정

이 연구는 마우스 췌장에서 기능성 원차 섬과 선반세포를 효율적으로 추출하는 단순화된 방법을 개발하여, 급성 췌장염 유발 당뇨병의 발병 기전에서 세포 간 소통을 연구하는 귀중한 도구를 제공하였습니다.

마우스에서 1차 섬과 1차 췌장 아시나세포를 동시에 분리하는 간단하고 신속한 방법

학습하세요 마우스 췌장 섬 분리 및 cAMP 측정 방법을 통해 당뇨병 연구에서 β세포 기능을 평가하는 기술을. 효소 면역분석법으로 세포 내 신호전달을 정량 분석합니다.

마우스 췌장 섬의 분리 및 세포 내 cAMP를 결정하는 방법

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