마우스 췌장 섬의 분리 및 세포 내 cAMP를 결정하는 방법

본 절차의 전반적인 목적은 다양한 실험적 처리에 따른 cyclic AMP 생성의 차이를 측정하기 위해 건강한 islet을 분리하는 것입니다. 이는 먼저 췌장을 팽창시킨 후 두 번째 단계에서 제거함으로써 수행됩니다. 건강한 islet은 일련의 원심분리와 세척 과정을 통해 분리됩니다.

다음으로, 생존 가능한 안구렛(eyelets)을 신선한 islet 배양 배지로 옮겨 밤새 배양합니다. 마지막 단계에서는 안구렛을 원하는 실험 처리에 노출시킨 후 cyclic AMP 분석을 수행합니다. 최종적으로, 효소 면역 분석법을 사용하여 안구렛에 적용된 다양한 처리에 따른 cyclic AMP 생성 변화를 측정합니다.

일반적으로 이 방법이 처음인 사람은 췌장을 완전히 팽창시키는 데 많은 연습이 필요하므로 어려움을 겪을 수 있습니다. 먼저 시린지와 캐뉼라에 5 mL의 콜라게나제 용액을 미리 충전하십시오. 끝이 뭉툭한 30게이지 바늘을 캐뉼라에 장착한 후 시린지와 캐뉼라를 얼음 위에 둡니다.

소장을 생쥐의 오른쪽으로 옮긴 후, 총담관의 끝부분에 위치하며 소장 위로 펼쳐져 하얀 삼각형 모양을 이루는 오디 괄약근을 찾습니다. 괄약근의 위치를 확인했다면, 5번 듀몬 핀셋을 사용하여 핀셋 끝을 총담관 아래로 밀어 넣어 소장에 최대한 가깝게 위치시킵니다. 이때 담관을 뚫지 않도록 주의하십시오.

소장과 결합 조직을 관통한 후, dumont 포셉의 팁을 사용하여 봉합사를 잡고 총담관 아래로 당깁니다. 누출을 방지하기 위해 매듭을 단단히 조이면서, 오디 괄약근(sphincter of OD)에 최대한 가깝게 총담관을 결찰합니다. 다음으로, 봉합사의 양끝을 잡고 꼬리 쪽으로 당겨 총담관에 약간의 장력을 줍니다.

그런 다음, 한 손으로 공통 담관의 양 끝 끈을 잡아 팽팽하게 유지한 상태에서, 간으로 갈라지는 마지막 분지 바로 위의 공통 담관을 마이크로 가위로 작게 절개합니다. 아이스 버킷에서 시린지와 캐뉼라를 꺼냅니다. 시린지를 내려놓고, 준비된 끝이 뭉툭한 30 gauge 바늘을 절개 부위에 삽입합니다.

총담관입니다. 관 벽을 뚫지 않도록 주의하십시오. 췌장을 완전히 팽창시키는 것이 가장 까다로운 부분입니다.

밀폐가 잘 되는 바늘을 사용합니다. 첫 번째 바늘로 밀폐가 충분히 되지 않는 경우, 27 gauge 바늘과 같이 더 굵은 바늘을 사용하십시오. 이제 주사기의 플런저를 천천히 눌러 압력을 맥동식으로 서서히 낮추며 췌장의 첫 부분이 팽창할 때까지 진행합니다.

췌장이 더 이상 팽창하지 않을 때까지 부드럽게 일정한 압력을 가하십시오. 성공적으로 팽창했다면 외분비 조직이 고르게 분포되어 있으며, 위 상단에 위치한 췌장 부위가 팽창한 상태가 됩니다. 췌장을 제거하려면, 한 손에 포셉을 사용하여 오디 괄약근(sphincter of od) 부위의 소장을 잡으십시오.

다른 쪽 손으로 굽은 가위의 닫힌 팁을 삽입하여 췌장의 일부를 소장에서 분리합니다. 팁을 소장을 따라 분홍색 결합 조직 쪽으로 내립니다. 그런 다음 소장이 위와 연결되는 부위 근처를 들어 올리고 췌장을 소장의 나머지 부분에서 절단하여 분리합니다.

췌장을 최대한 많이 잡고 조심스럽게 들어 올립니다. 곡선 가위를 사용하여 췌장과 흉강 사이의 남은 연결 부위를 절단합니다.

췌장을 완전히 제거하려면 제거한 각 췌장을 약 2.5 milliliters의 콜라게나아제 용액에 보관하십시오. 췌장을 세척하기 위해 얼음 위에 개별 50 milliliter 원심분리 튜브를 준비합니다. 먼저, 각 췌장을 25 milliliters의 콜라게나아제가 들어 있는 새로운 50 milliliter 원심분리 튜브로 옮기십시오.

그다음 췌장을 50 mL 원추형 튜브에 넣습니다. 쉐이커를 끈 상태에서 220~250 RPM으로 진동 가능한 37 °C 진탕 항온수조에 튜브를 세워 둡니다. 이제 각 50 mL 원추형 튜브에 95% 산소와 5% 이산화탄소 혼합 가스를 5분 동안 충전합니다.

파스퇴르 피펫을 사용하여 각 튜브의 캡을 단단히 닫고, 수면 아래로 잠기도록 진탕 항온수조에 가로로 눕혀 배치합니다. 6분부터 시작하여, 최대 16분까지 매 2분마다 20초 동안 220~250 RPM으로 튜브를 진탕합니다. 진탕 후, 실온에서 400~500 Gs로 튜브를 원심분리하며, 원심분리기가 최대 속도에 도달하는 즉시 전원을 끕니다.

다음으로, 펠렛이 흐트러지지 않도록 진공 트랩을 사용하여 각 튜브에서 콜라게나제 용액 약 22.5 milliliters를 흡입하여 제거합니다. 그런 다음 12.5 milliliter의 HBSS에 펠렛을 재현탁하고 튜브를 가볍게 볼텍싱하여 펠렛을 분쇄합니다. 세포를 세척하고 볼텍싱한 후 HBSS를 추가로 첨가하고, 각 세포 현탁액을 1000 micron 메쉬를 통해 새로운 개별 50 milliliter 원추형 튜브에 붓습니다.

그 후 세포 현탁액을 다시 원심 분리하고, 진공 트랩을 사용하여 펠릿이 흐트러지지 않도록 주의하며 모든 HBSS를 흡입하여 제거합니다. HBSS가 모두 제거되면, 각 튜브에 25%F call solution 4.8 milliliters를 첨가합니다. 볼텍싱하여 펠릿을 풀어준 후, 50 milliliter 원추형 튜브를 회전시키며 튜브 벽면을 따라 23%20.5%and 11%fial solution 2.4 milliliters를 조심스럽게 분주합니다.

FI 콜 용액을 원심분리한 후 층이 고르게 형성되도록 하기 위해, 외분비 조직 펠릿이 남지 않도록 주의하며 모든 FI 콜을 새로운 50 milliliter 원추형 튜브에 붓습니다. 새 튜브의 50 milliliter 표시선까지 얼음처럼 차가운 HBSS를 추가합니다. 그런 다음 캡을 닫고 튜브를 4~6회 반전시켜 섞습니다.

FI call과 HBSS를 함께 혼합합니다. 진공 트랩을 사용하여 느슨한 펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하며 HBSS 바이알 혼합물의 대부분을 조심스럽게 흡입하여 제거합니다. 그런 다음 펠렛을 새 튜브로 옮깁니다.

파스퇴르 피펫을 사용하여 아이렛(eyelets)을 아이렛 배양액이 담긴 페트리 접시에 옮깁니다. 이때 ASIN 조직 파편이 함께 옮겨지지 않도록 주의하십시오. 페트리 접시를 백라이트가 장착된 해부 현미경 위에 놓습니다.

건강한 안구(eyelets)는 구형이며 중심부가 황갈색에서 진갈색을 띱니다. ASIN 또는 조직에 연결되어 있어 둔탁하고 회색으로 보이는 안구는 사용하지 말고 폐기해야 합니다. 또한, 하룻밤 동안 배양한 후 중심부에 어두운 괴사 부위가 나타나는 크기가 큰 안구는 제대로 기능하지 않으므로 폐기해야 합니다.

아이렛(eyelet) 준비물에 부유물이 많이 포함된 경우, 신선한 배지로 두 번 수동 분리하고, 아이렛의 뭉침을 제한하기 위해 소화 버퍼(digestion buffer)에 DNA를 첨가하십시오. 페트리 접시 중앙으로 아이렛을 모아 회전시키며 이 단계를 시작합니다. P 20 피펫을 사용하여 아이렛을 5 mL의 사전 배양 용액(pre incubation solution)이 담긴 새로운 15 mm x 60 mm 폴리스티렌 페트리 접시로 옮겨, 아이렛에 묻은 포도당 함유 배양 배지를 세척합니다.

그다음 P 20 피펫을 사용하여 최소 13개의 안구(eyelet)를 각각 1 mL의 갓 가스 처리된 Krebs ringer bicarbonate 완충액이 들어 있는 개별 마이크로 원심분리 튜브로 옮기며, 이때 튜브 간에 안구 크기가 일정하도록 유지합니다. 시료를 37 °C, 5% CO2 조건에서 45분 동안 배양한 후, 튜브 캡을 닫고 빠르게 볼텍싱한 다음 상온의 탁상형 원심분리기에서 7,000 ~ 7,500 Gs로 원심분리합니다. 인슐린이나 다른 대사 물질의 하위 분석 응용이 필요한 경우, P 1000 피펫을 사용하여 배지 일부를 마이크로 원심분리 튜브에 수집합니다. 자극 배지를 수집하지 않는 경우에는 폐기해도 됩니다.

P 1000 피펫을 사용하여 각 마이크로 원심분리 튜브 내의 Krebs 용액 대부분을 제거하고, 안구 펠릿 위에 약 10 ~ 15 µL의 Krebs 용액만 남깁니다. 그 다음 P 20 피펫을 사용하여 펠릿에 가장 가까운 부분을 제거합니다. 마지막으로 안구 위에 남아 있는 Krebs 용액이 10 ~ 15 µL 미만이 되면, 액체 질소로 안구 펠릿을 급속 냉동합니다.

그 후 cyclic AMP를 측정할 때까지 급속 냉동된 펠릿을 -80 °C에서 보관하십시오. 일반적으로 약물이 cyclic AMP 생성에 미치는 영향은 인슐린 분비에 미치는 영향과 직접적인 상관관계가 있습니다. 본 실험에서는 야생형 또는 유전자 결핍 마우스에서 분리한 islet을 11.1 mM glucose로 자극하여 세포 내 cyclic AMP를 측정하였습니다.

cAMP 생성량을 측정하여 총 세포 단백질 양으로 표준화하였습니다. 분비된 인슐린은 표준 인슐린 ELISA를 사용하여 측정하였으며, 마찬가지로 총 세포 단백질 양으로 표준화하였습니다. 예상대로, cAMP 생성의 변화는 포도당 자극 인슐린 분비의 증가와 직접적인 상관관계를 보였습니다.

이 영상을 시청한 후, 건강한 생쥐의 소안륜(eyelets)에서 cAMP와 cGMP 수치를 분리, 배양 및 측정할 수 있어야 합니다.