세포의 기원, 종류, 그리고 상호 작용의 시각화를위한 형광 조직 이식에 따라 정량 멀티 스펙트럼 분석

다음 절차의 목표는 다중 세포 구성 또는 모방에 대한 다중 스펙트럼 조사를 사용하여 종양 기질 발달에 대한 다양한 골수 거주 집단의 기여도를 결정하는 것입니다. 이는 먼저 골수 줄기세포를 발현하는 RFP와 함께 형질전환 GFP 표지 수혜자 마우스를 이식함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계에서는 관심 종양 세포를 동일한 수용자에게 주입한 다음 생착 후 절제 종양을 절단하고 파라핀에 삽입하고 면역형광 항체로 표지합니다.

다음으로, 스펙트럼 라이브러리가 완료되면 종양 단면의 이미지를 획득하는 데 사용되는 모든 파장의 스펙트럼 라이브러리가 생성됩니다. 슬라이드는 마지막 단계에서 이미지화되며, 관심 세포 마커의 염색 패턴을 식별하고 연관시킬 수 있도록 데이터 분석이 수행됩니다. 궁극적으로, 종양 미세환경과 같은 복잡한 조직의 구성을 더 잘 이해하기 위해 세포 외 및 세포 마커의 다중 라벨링을 기반으로 새로운 세포 실체 또는 표현형을 식별할 수 있습니다.

표준 면역형광 기술에 비해 이 기술의 주요 장점은 다중 스펙트럼 분석을 통해 동일한 슬라이드에서 7개 이상의 형광 4를 멀티플렉싱할 수 있어 종양 미세환경 또는 재생 조직의 세포 구성을 훨씬 더 정확하고 자세히 조사할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 종양 미세환경의 기원과 구성에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 재생 의학, 발달 생물학 및 면역 생물학과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. Dr.Spa와 함께 이 절차를 시연하는 것은 제 연구실의 연구 조교인 Chris Booth입니다.이 기관의 IU Cook 제한으로 인해 마우스에 대한 직접적인 마우스 조작에 대해 논의할 것이지만 보여주지는 않을 것입니다.

이러한 골수 절차와 종양 생착 기술은 아동 및 기타 줄기 세포와 같은 이전 연구에서 찾을 수 있습니다. 2009 거울 뒷다리에서 골수 세포를 분리 한 후 Resus는 마우스 당 PBS 100 마이크로 리터 당 200 만 개의 세포로 세포를 현탁시킵니다. 열 램프를 사용하여 방사선 조사를 받은 GFP 마우스의 혈관을 확장하고 마우스를 꼬리 정맥 주입 억제 장치에 넣습니다.

29 게이지 바늘 베벨 면이 위로 향하게 하여 세포 현탁액을 꼬리 또는 후안와 정맥에 전신적으로 주입합니다. 멸균 거즈를 사용하여 주입 후 꼬리에 가벼운 압력을 가합니다. 한 마리의 마우스에 100마이크로리터 PBS를 주입 당일 생착 조절로만 주입합니다.

PBS에서 관심 종양 세포를 100마이크로리터당 100만 개의 세포로 다시 현탁시킵니다. 70% 에탄올로 복부를 살균한 후. 한 손으로 목덜미와 꼬리를 잡고 다른 손으로 바늘 경사면을 위로 잡고 종양 세포를 수용 마우스의 복강강에 주입합니다.

15일에서 30일 후, 쥐를 안락사시키고 복부에서 종양을 절제한다. 그런 다음 24시간 동안 10%포르민으로 종양을 고정합니다. 그런 다음 후속 염색 절차를 위해 고정 조직을 5-10마이크로미터 조각으로 절단합니다.

조직 부분을 파라핀으로 고정한 후 샘플을 섭씨 56도에서 1시간 동안 굽습니다. 그런 다음 다음 순서에 따라 슬라이드를 세척하십시오 : 마지막 에탄올 세척 후 슬라이드를 물로 2 분 동안 헹굽니다. 염색 랙을 천천히 담그고 물 안팎으로 10회 들어 올립니다.

다음으로 구연산나트륨 완충액을 전자레인지에 넣어 가열합니다. 소듐 시트레이트 버퍼에서 슬라이드를 20분 동안 끓인 후, 샘플을 버퍼에서 30분 동안 식힙니다. 그런 다음 이온수로 5분 더 씻습니다.

그런 다음 슬라이드를 두드려 큰 물방울이 굴러 떨어지도록 하고 조직 부분이 건조되지 않도록 주의하십시오. 소수성 장벽 펜을 사용하여 종양 절편 주위의 절편을 표시한 다음 즉시 샘플에 차단 버퍼를 배치하여 조직 절편이 건조해지는 것을 방지합니다. 한 시간 후, 관심 1차 항체가 포함된 슬라이드를 4도의 속도로 천천히 회전하는 셰이커의 수분 챔버 박스에 밤새 배양합니다.

다음 날 아침, PBST에서 10분 동안 슬라이드를 두 번 세척하고 섹션을 세척하는 동안 부드럽게 흔들어 세탁합니다. 2차 항체를 차단 완충액 비율에 대해 1:1000 항체로 희석합니다. 그런 다음 알루미늄 호일로 덮인 수분 챔버 상자에 있는 적절한 2차 항체의 절편을 실온에서 천천히 회전하는 셰이커에 2시간 후에 배양합니다.

PBST에서 5분 동안 부드럽게 흔들면서 슬라이드를 두 번 세척하고 빛으로부터 보호하십시오. 그런 다음 dappy 전용 슬라이드를 염색하고 분석 슬라이드를 1 분 동안 DPI로 덮어 배양 중에 슬라이드를 덮습니다. 각 샘플 위에 커버 슬립을 놓고 각 커버 슬립의 가장자리를 네일 경화제로 밀봉합니다.

이제 다중 스펙트럼 이미징을 수행하려면 오일 대물렌즈를 사용하여 분석 슬라이드의 초기 이미지를 촬영하여 스펙트럼 라이브러리의 각 스펙트럼 범위에 대한 적절한 노출 시간을 얻습니다. 예를 들어, 이 표는 실험에 사용된 4층의 수를 기반으로 제안된 스펙트럼 라이브러리 프로토콜을 간략하게 설명합니다. 그런 다음 이 실험을 위해 스펙트럼 라이브러리의 배경 슬라이드에 대한 염색되지 않은 슬라이드를 이미지화합니다.

다음 이미지, 스펙트럼 라이브러리의 배경 이미지를 얻기 위한 염색되지 않은 슬라이드. 이제 각 대조군 단일 층 4 스테인드 슬라이드를 이미지화하고 각 슬라이드에 사용되는 2차 항체의 이름으로 이미지를 저장합니다. 의심되는 라이브러리가 완료되면 분석 슬라이드에서 관심 영역의 이미지를 수집하여 종양 조직의 이미지를 분석합니다.

먼저, inform 소프트웨어를 사용하여 획득한 뉘앙스 이미지의 대표적인 구색을 가져옵니다. 그런 다음 프로그램의 지시에 따라 안전 스펙트럼 라이브러리를 엽니다. 다음으로, 분석할 관심 조직 영역을 식별합니다.

DAPI 염색을 기반으로 개별 세포를 식별합니다. 세포질은 핵의 모양에 따라 자동으로 식별됩니다. 이제 각 형광 매개변수에 대해 선택한 형광 강도 판독값을 선택한 다음 획득한 이미지를 일치시켜 소프트웨어가 제안된 알고리즘을 사용하여 데이터를 처리하도록 합니다.

이미지 처리가 완료되면 결과 파일을 병합합니다. 다음으로, 이 형질전환 골수 이식 마우스 모델에서 종양을 분석하고 그래프로 표시하기 위해 이 다중 스펙트럼 이미징 기술을 사용하여 골수 이식 3주 후 유세포 분석을 통해 골수 기원의 기질 종양 성분을 식별했습니다. 그런 다음 표지되지 않은 주입된 난소 종양의 초기 주입 절편을 분석한 후 단일 색상 대조군 슬라이드가 있는 스펙트럼 라이브러리를 만든 후 GFP DPI로 염색된 난소 종양 절편과 두 개의 다른 마커의 이미지를 분석했습니다.

더 많은 마커를 추가할 수 있습니다. 예를 들어, 여기에서는 스펙트럼 라이브러리와 함께 제공되는 6개의 마커와 핵 염색이 있는 종양 단면의 이미지가 정보에 입각한 소프트웨어를 사용하여 표시됩니다. 종양 단면 내의 관심 조직 영역은 여기에 표시된 대표 이미지와 같이 분류할 수 있습니다.

예를 들어, 이 이미지는 조직 분절의 분류와 세포의 분절을 보여줍니다. 핵 염색 dpi를 기준으로 합니다. 그런 다음 형광 라벨의 정량화를 각 세포의 핵과 세포질에서 측정하고 추가 분석을 위해 내보낼 수 있습니다.

조직 세분화 알고리즘은 형광 색소 식별뿐만 아니라 조직 구조를 기반으로 조직 아형을 추가로 식별할 수 있으며, 염색을 별개의 조직 영역으로 분류할 수 있는 보다 강력한 분석 도구를 제공합니다. 이 이미지에서 컴퓨터는 조직 내의 구조적 패턴을 기반으로 5개의 하위 영역을 식별하도록 훈련되었습니다. 배경은 빈 공간으로 정의됩니다.

용혈성 종양은 조직 내에 적혈구가 풍부하여 정의됩니다. 종양은 밀집된 세포에 의해 정의됩니다. 지방은 큰 대칭의 빈 세포 구획과 줄무늬 패턴으로 정의되는 근육에 의해 정의됩니다.

이 방법을 사용하면 결정된 형광 강도 임계값을 기반으로 이중 양성 세포 집단을 분석할 수 있습니다. 예를 들어, GFP 양성 및 알파 평활근 액틴 양성 세포의 경우, 4가지 색상 이상의 추가 스펙트럼 검출을 위해 여기에 표시된 바와 같이 5개 이상의 프로브를 다중화하기 위해 링크된 Tips and Tricks 문서를 참조하십시오. 이 절차를 시도하는 동안 이미지의 품질은 사용된 적절한 단색 컨트롤 슬라이드에 크게 좌우된다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 세포 구획 및 종양 미세환경 조직과 같은 추가 질문에 답하기 위해 형광 현장 혼성화와 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 당사의 모방 기술, 다세포 구성 요소의 다중 스펙트럼 조사에 대해 잘 이해하게 될 것이며, 이를 완료하면 하나의 슬라이드에서 여러 세포 표적을 식별하는 방법을 철저히 이해하게 될 것입니다. 이러한 세포 표적을 Unix로 집계하고 종양 기질이나 재생 조직 또는 관심 조직의 진화를 잘 이해하는 방법.