조직 공학을위한 이축 기계 로딩 생물 반응기의 설계

다음 실험의 전반적인 목표는 이식을 위한 기능성 조직 공학 바이오 복합체를 제작하는 것입니다. 이는 3차원 생체 재료 복합체 내의 세포에 생물물리적 자극을 제공하기 위해 정밀한 단축 또는 이축 기계적 변형을 가함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 바이오리액터에 로드셀을 장착하여 하중 인가 중 바이오 복합체의 힘 피드백과 기계적 테스트를 수행합니다.

다음으로, 구조체의 생화학적 함량과 강도에 거시적 변화를 유도하기 위해 바이오 복합체를 수주 동안 배양합니다. 글리코사미노글리칸 및 콜라겐 함량, 스캐폴드 두께, 평형 탄성 계수의 유의미한 차이를 바탕으로 서로 다른 하중 유형의 효과를 보여주는 결과가 도출됩니다. 이 방법은 공학적 연골 조직에 대한 이축 하중의 영향에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 뼈나 힘줄과 같은 다른 저하중 지지 조직에도 적용될 수 있습니다. 본 실험 절차는 저희 연구실의 Amy May와 Rob Stefani가 시연하겠습니다. 절차를 시작하기 위해, 여기 보이는 것과 같이 이축 바이오리액터를 설치하십시오.

바이오리액터의 베이스는 25 centimeters × 30 centimeters × 12.5 millimeters 크기의 알루미늄 플레이트로 구성되어 있습니다. 가변적인 위치 조정 옵션을 통해 다양한 모양과 크기의 조직 배양 플레이트를 유연하게 장착할 수 있습니다. 다음으로, 수평 스테이지가 x축 방향으로만 진동하여 동적 전단력을 제공할 수 있도록 베이스 위에 스테이지를 장착하십시오.

그리고 수직 스테이지는 Z축으로만 진동하여 동적 압축을 제공합니다. 다음 단계는 맞춤형 폴리설폰 로딩 플레이트를 제작하는 것입니다. 폴리설폰 재료는 생체 적합성, 가공의 용이성 및 멸균의 용이성 때문에 이상적입니다.

정밀 가공된 직각 브래킷을 통해 플레이트와 이축 이동 플랫폼을 결합하십시오. 베이스 플레이트에 부착된 키네마틱 스톱(kinematic stops)에는 미세 조정 나사가 있어, 수작업으로는 불가능한 배양 플레이트의 정밀한 정렬이 가능합니다. 그다음, 각 플랫폼에 스테퍼 모터 액추에이터를 부착하여 소프트웨어에서 위치 피드백을 수집할 수 있도록 하십시오.

여기에 표시된 스테퍼 모터 액추에이터는 0.1 µm의 양방향 반복 정밀도와 20 nm의 분해능을 갖추고 있어, 50 mm의 이동 범위 내에서 3 µm 미만의 정확도를 제공하며, Thor Lab의 고급 포지셔닝 기술 소프트웨어를 사용하여 스테이지의 움직임을 제어합니다. 이 소프트웨어는 스테퍼 모터를 제어하여 전단 및 압축의 주파수와 진폭이라는 부하 파라미터를 독립적 및 동시에 조절합니다. 다음으로, 플래티넘과 구조물 사이의 접촉을 감지하고 부하 응답을 평가하는 데 필요한 힘 피드백을 제공하기 위해, 로딩 플래티넘과 이동 플랫폼 사이에 5 pound 소형 로드셀을 배치합니다.

로드셀의 정밀도가 풀 스케일의 0.15%에서 0.25%로 높고, 컴퓨터에서 데이터를 수집할 수 있도록 로드셀의 디스플레이 장치에 RS 2 32 포트가 있는지 확인하십시오. 24웰 플레이트의 웰 내에서 샘플을 고정하기 위해, 1.5 millimeter 스페이서를 사용하는 겔 캐스팅 시스템을 이용하여 1.5 millimeter 두께의 aros 겔 몰드를 준비하십시오. 조립이 완료되면, 두 유리판 사이에 4% aros 용액을 붓고 혼합물이 식도록 둡니다.

그런 다음 상단 플레이트를 제거하고 agro slab에서 직경 16 millimeter의 디스크를 펀칭합니다. 각 디스크의 각 웰 샘플에 대해, 샘플을 넣을 수 있도록 구멍을 펀칭합니다. 완성된 디스크를 24 웰 플레이트의 웰에 배치합니다.

그다음 두께 2.25 millimeter, 직경 5 millimeter의 조직 구조체를 각 겔 홀더에 눌러 넣습니다. 샘플은 각 에어로스 홀더의 상단 밖으로 돌출되어야 합니다. 이어서, 각 웰에 1.5 milliliters의 배양액을 추가하고 커버를 닫습니다.

그 후, 샘플 로딩 시간이 될 때까지 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣습니다. 조직 구조물의 기계적 로딩을 시작하려면 알루미늄 플레이트를 로드 셀에 고정하고, 항상 수직 스테이지에 멸균된 플라틴 어셈블리를 부착하십시오. 기기 고장을 방지하기 위해 인큐베이터는 낮은 습도 조건에서 작동시켜야 합니다.

다음으로, 스테퍼 모터 컨트롤러와 PC의 전원을 켭니다. advanced positioning technology 사용자 프로그램을 실행하고 두 화면 모두에서 graphical control 탭으로 이동합니다. home zero 버튼을 눌러 두 스테퍼 모터를 최상단 및 최우측 위치로 정의된 제로 위치로 이동시킵니다.

기계적 로딩 중 넘침을 방지하기 위해 각 웰에서 배지를 일부 제거하여 샘플 로딩을 준비합니다. 다음으로 24웰 플레이트를 바이오리액터에 넣고, 4개의 조절 가능한 키네마틱 로케이터를 사용하여 플레이트를 플래틴에 조심스럽게 맞춘 뒤 플레이트가 정확히 정렬되었는지 확인합니다. 그래픽 제어 탭에서 바이오리액터 베이스의 전면과 일치하도록 플러시(flush)합니다.

수동으로 미세 조정합니다. 위치 상자를 클릭하여 수평으로 이동시켜 정렬을 조정하십시오. 플레이트가 플레이트의 웰과 정렬되면, 샘플에 처음 닿을 때까지 플레이트를 내리기 시작하십시오.

시작 위치에 도달하면, 이동 시퀀서(move sequencer) 탭으로 이동하여 로드(load)를 누르거나 이 비디오에 포함된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 사용자 정의 프로그램을 생성하여 원하는 이동 시퀀스를 불러오십시오. 그런 다음 실행(run)을 눌러 프로그램을 시작합니다. 소프트웨어가 모터를 제어하여 샘플에 원하는 컨디셔닝 레지먼트를 적용하게 됩니다.

프로그램이 종료되면, 플레이트가 조직 배양 플레이트의 상단에서 벗어나도록 수동으로 들어 올립니다. 그런 다음 바이오리액터에서 24 휠 플레이트를 제거하고 배지를 교체합니다. 마지막으로, 로드셀에서 백금 전극을 조심스럽게 제거한 후 장비의 전원을 끕니다.

본 영상에서 설명하는 이축 바이오리액터의 사용은 조직 공학 구조체 내 세포가 분비하는 글리코사미노글리칸과 콜라겐의 양에 상당한 영향을 미쳤습니다. 컨디셔닝은 주 5일, 하루 3시간 동안 1 Hz의 주파수에서 10%의 압축 변형률과 5%의 전단 변형률로 진행되었습니다. 배양 30일 후, 이축 하중을 받은 연골세포가 분비한 글리코사미노글리칸과 콜라겐의 양은 대조군 샘플보다 유의미하게 높았습니다. 단축 하중은 글리코사미노글리칸의 양만을 유의미하게 증가시켰습니다.

또한, 이축 하중(biaxial loading)은 더 두꺼운 구조체를 형성하였으나, 구조체의 탄성에는 영향을 미치지 않는 것으로 나타났습니다. 이 투여 프로토콜에 따라 30일간의 조건화 및 배양 후, 조직 구조체의 횡단면을 blue saffron O 및 type two collagen을 포함한 전형적인 연골 마커로 염색하였습니다. 세 가지 서로 다른 그룹은 무조건화(no conditioning), 단축 하중(uniaxial loading), 그리고 이축 하중(biaxial loading) 그룹으로 구성되었습니다.

모든 그룹에서 alium Blue와 Saffron O에 대해 양성 염색을 보였으나, 이축 하중(bi axial load)을 가한 시료는 하중을 가하지 않은 시료 및 단축 하중(uni axial load)을 가한 시료에 비해 2형 콜라겐의 양이 증가한 것으로 나타났습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 발달 중인 조직 공학 구조체에 단축 또는 이축 하중을 적용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.