쥐과 잇몸 세포의 분리, 처리 및 분석

이 절차의 전반적인 목표는 추가적인 유세포 분석을 위해 미린 잇몸(mirin gingiva)을 정밀하게 분리하고 처리하는 것입니다. 이는 먼저 세심한 방식으로 잇몸을 외과적으로 분리함으로써 달성됩니다. 그 다음, 절제된 조직을 처리하여 단일 세포 현탁액을 생성합니다.

그런 다음 항체를 이용한 세포 외 및 세포 내 염색을 수행합니다. 마지막으로, 유세포 분석기로 시료를 분석합니다. 결과적으로 유세포 분석을 통해 잇몸 내의 서로 다른 세포 집단과 면역학적 자극에 노출된 후 조직에서 발생하는 세포 변화를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

OC 화학이나 단일 형광 분석과 같은 다른 방법들과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 수많은 세포를 분석할 수 있는 빠르고 간단한 방법이라는 점이며, 여러 변수의 동시 분석뿐만 아니라 추가 실험을 위한 다양한 세포 유형의 분리가 가능하다는 것입니다. 이 방법은 미생물이 치은 항상성에 어떻게 영향을 미치는지, 그리고 치주염 실험 모델에서 이것이 염증 유발 골손실과 어떤 관련이 있는지와 같은 면역학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 우리는 치주염 동안 RI 세포의 역할을 다루기 시작했을 때 처음으로 이 방법에 대한 아이디어를 얻었습니다. GVA 가속 기술은 MU one J gva의 크기가 작고 접근성이 상대적으로 불편하여 습득하기 어렵기 때문에, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다.

먼저 텍스트 프로토콜에 따라 배지 용액과 멸균된 수술 도구를 준비합니다. 소속 기관의 동물실험윤리위원회(IACUC)에서 승인한 방법에 따라 마우스를 안락사시킨 후, 날카롭고 끝이 뭉툭한 직선 가위를 사용하여 뺨과 하악지를 포함한 구강 양측을 절개하고, 표준 가위를 입천장 뼈 평면에 수직으로 향하게 하여 하악을 아래로 당깁니다. 제3대구치 뒤쪽 1mm 지점의 가상선을 따라 연조직과 경조직을 절단합니다.

다음으로, 절치 뒤쪽 2 mm 지점에서 연조직과 경조직에 절개를 가합니다. 그런 다음 가위를 입천장과 평행하게 유지한 상태로 구강 앞부분을 아래로 당겨 비강을 노출시킵니다. 지혈제 하나를 비강에 넣고, 다른 하나를 사용하여 전정 부위를 절개하여 후방 절개 부위까지 자릅니다.

상악골을 두개골에서 분리하기 위해 상악골의 반대편에도 동일하게 절개합니다. 그다음 중앙을 절개하고, 가위와 포셉을 사용하여 각 상악골 반쪽에서 구개 조직을 다듬어 치조골이 드러나게 합니다. 전방 경계에서 잇몸 조직을 벗겨내어 PBS와 2% fetal calf serum 또는 FCS가 담긴 플레이트에 넣습니다. 잇몸 조직을 처리하기 위해 이를 1 mL PBS, 2 mg/mL collagenase type II 및 1 mg/mL DNase가 담긴 배양 접시로 옮깁니다.

15번 멸균 외과용 메스로 조직을 절개합니다. 조직을 잘게 다진 후 15 milliliter 원추형 시험관으로 옮깁니다. 플레이트에 남아 있는 조직 세포를 1 milliliter의 P-B-S-F-C-S로 세척하여 시험관에 옮깁니다.

조직을 37 °C, 200 RPM으로 예열된 진탕 배양기에서 20분 동안 배양하십시오. 그런 다음 0.5 M EDTA 20 µL를 첨가하고 10분 더 배양합니다. 다음으로, P-B-S-F-C-S를 12 mL까지 채운 후 시료를 4 °C, 400 ×g에서 8분 동안 원심분리하십시오.

상층액을 제거한 후, 세포를 2 mL의 PBS-FCS에 현탁합니다. 4 °C, 320 ×g에서 5분간 원심분리하여 통과액을 회수한 후, 샘플을 70 µm 세포 스트레이너로 여과합니다. 세포를 300 µL의 PBS-FCS에 재현탁합니다.

마지막으로, 낮은 온도와 소등 상태의 후드 내에서 총 부피 100 µL의 세포 수를 측정하고, 선택한 각 항체를 1 × 10⁶ cells당 0.2~0.5 µg씩 첨가한 후 짧게 볼텍싱합니다. 샘플을 4 °C의 암소에서 15분 동안 배양한 후, 2 mL의 PBS-FCS를 첨가하고 320 ×g, 4 °C에서 5분간 원심분리합니다. 세포를 고정하기 위해 상층액을 흡입하여 제거한 다음, 볼텍싱하면서 차가운 BD cyto perms 500 µL를 한 방울씩 첨가하여 세포를 재현탁합니다.

세포 효과 단계에서는 튜브를 4°C의 암소에서 40분 동안 배양한 후 볼텍싱합니다. 이어서 BD perm wash 버퍼 1 mL를 첨가하고, 4°C에서 800 ×g로 7분 동안 원심 분리합니다. 세척 과정을 반복한 후, 세척 버퍼 300 µL만 남기고 모두 흡입하여 제거합니다.

그다음 총 100 µL의 부피에서 세포를 세포내 염색하기 위해, 1 × 10⁶개의 세포당 선택한 항체를 각각 1 µg씩 첨가합니다. 짧게 볼텍싱한 후 암소에서 30분 동안 배양합니다. 이전과 동일하게 세포를 2회 세척하고 모든 상층액을 제거한 후, 신선하고 차가운 BD perm wash buffer 300 µL에 세포를 재부유시킵니다.

짧게 볼텍싱한 후, 현탁액을 fax 튜브에 여과합니다. fax 분석을 수행할 때까지 튜브를 얼음 위나 냉장고의 암소에 보관하십시오. 두 마리의 naive 마우스로부터 수집한 잇몸 세포 혼합물입니다.

LSR two 유세포 분석기로 분석을 수행하였으며, FlowJo 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였습니다. 여기에 제시된 측방 산란광(side scatter) 및 전방 산란광(forward scatter) 도표는 세포의 분포를 보여줍니다. 림프구, 단핵구, 수지상 세포 및 과립구의 식별을 위한 게이팅 전략이 비교 목적으로 표시되어 있습니다.

이 그림은 실험적 치주염 환경에서 경구 투여 21일 후 P gingivalis에 감염된 마우스로부터 정제된 잇몸 세포를 나타내는 FACS 플롯입니다. 여기에 표시된 미감염(naive) 마우스와 비교하여 감염된 마우스에서 다양한 면역 세포 집단의 증가를 쉽게 확인할 수 있습니다. 처리된 잇몸 내의 면역 세포는 조혈 마커인 CD 45를 발현하는 세포를 게이팅하여 식별합니다.

이 세포들은 본 그림에 표시된 것과 같이 CD3 양성 T 세포로 추가 분리되었습니다. 호중구는 LY6G 및 CD11b 분자의 발현에 따라 식별되었습니다. 마지막으로, MHC class II 양성 CD11c 양성 세포를 게이팅하고 EPAM 및 RIN CD207의 발현을 확인하여 랑게르한스 세포와 상피성 수지상 세포 하위 집합을 식별하였습니다. 이 기술을 숙달하고 본 절차를 적절히 따르면 3.5시간에서 5시간 이내에 완료할 수 있습니다.

개발 후 단일 세포 유전자 발현과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 실시간 PCR과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 기술은 면역학 분야의 연구자들이 치주 연구 분야에서 다양한 자극에 대한 G GVA의 국소 반응을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 또한, 이 기술을 통해 실험적 치주염의 병인에서 G GVA의 면역 및 비면역 세포의 역할을 규명할 수 있었습니다.

이 영상을 시청하고 나면, 유세포 분석을 위한 세포 외 및 세포 내 바이러스 염색을 수행하기 위해 소변 GVA를 분리하고 처리하여 단일 세포 현탁액을 얻는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.