Name: Diabetogenic CD4의 입양 전송하여 마우스의 가속 제 1 형 당뇨병 유도 + T 세포 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: 학습하세요 CD4+ T 세포 입양 전송을 이용한 마우스 제1형 당뇨병 유도 방법입니다. 이 기술은 2주 내에 재현 가능한 당뇨병 발병을 통해 질병 기전 연구와 치료 개발에 활용됩니다.

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우리는 Drs에 감사드립니다. 도움이 덧글에 대한 로버트 BONNEAU 닐 크리스텐슨. 이 작품은 의학 자금의 펜실베니아 주립 대학에 의해 지원되었다.

1. 비장과 BDC2.5 쥐의 림프절에서 T 세포의 분리 <ol><li> diabetogenic CD4 + T 세포의 기증자로 6 주 된 사전 당뇨병 여성 BDC2.5 마우스를 사용합니다. 소변 포도당 측정 (아래 참조)에 의해 결정되는 마우스는 당뇨병이 없어야합니다. </li><li> CO 2 질식을 사용하여 각 마우스를 안락사 및 무균 조건 하에서 비장, 겨드랑이 및 상완 림프절을 제거합니다. 비장을 제거하려면, 70 % 에탄올로 모피를 흡수 한 다음 잘라 피부를 철회. 비장은 마우스의 왼쪽에 어두운 붉은 기관으로 볼 수 있습니다. 작은 가위를 사용하여 복막의 1 인치 절개를 부드럽게 작은 핀셋 한 쌍의 중앙에 비장을 파악. 조심스럽게 결합 조직과 연결된 지방 최대한 트림과 비장을 제거합니다. </li><li> 얼음에 15 ML 원뿔 튜브 10 ML Dulbecco&#39;s으로 수정 이글의 중간 (DMEM)에서 비장과 림프절을 수집합니다. </li><li> 일을 사용하여 단일 세포 현탁액을 준비합니다부드럽게 70 μm의 셀 스트레이너 (여과기 당 하나의 비장과 스트레이너 당 4-6 림프절) 같은 50 ML 원뿔 튜브로를 통해 림프 기관을 누릅니다 멸균 10 ML의 주사기 플런저의 전자 끝. </li></ol> 이 과정에서, 스트레이너에서 세포의 회복을 최대화하기 위해 1 ML DMEM 여러 번 각 스트레이너 린스. <ol start="5"><li> RT에서 12 분 동안 300 ~ 400 XG에 15 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기에 50 ML 원뿔 튜브에서 수집 된 세포를 전송합니다. </li><li> 적혈구를 용해하는, 상층 액을 버리고, 5 ML 암모늄 - 염화 칼륨 (ACK) 버퍼 (산도 7.2)에서 세포를 다시 일시 중지하고 5 분 RT에서 ACK 세포 현탁액을 품어. </li><li> ACK 세포 현탁액에 DMEM 10 ML을 추가하고 위와 같이 튜브를 원심 분리기. 10 ML DMEM에 한 번 세포 펠렛을 씻으십시오. </li></ol> 2. Diabetogenic CD4의 형광 활성 세포 정렬 + BDC2.5 마우스에서 T 세포 <ol><li> 5 ML 외과의에서 다시 일시 중지합니다 세포버퍼를 함유 성 및 판 블루 염색 배제하여 가능한 세포 (위상차 현미경과 혈구를 사용하여)의 수를 계산합니다. </li><li> FACS 버퍼를 사용하여 5 × 10 7 세포 / ML에 세포 현탁액 볼륨을 조정합니다. ~ 제거 1 × 10 염색 제어 당 6 셀 (1 아무 얼룩, 3 단 얼룩). 비 활성화 된 유전자 변형 CD4 + 안티 CD4와 T 세포 (APC), 안티 TCR Vβ4 (FITC)와 15 ML 튜브에 반대로 CD62L (PE) 단일 클론 항체 (단클론 항체)에 대한 샘플을 얼룩. 어둠 속에서 4시에 20 ~ 30 분 동안 제조업체에서 권장하는 단클론 항체의 농도 ° C를 사용하여 세포 염색을 수행합니다. </li><li> &gt; 배 염색 반응 볼륨 FACS 버퍼와 샘플 및 단일 얼룩 컨트롤을 씻으십시오. (1-2 X 10 6 세포 / 샘플을 정렬 ML 300 μL 하나의 얼룩 컨트롤)과 얼음에 저장 다음까지 300 ~ 400 XG에서 튜브를 원심 분리, 상층 액을 제거하고 FACS 버퍼에 세포를 다시 일시 중지합니다 단계. </li><li> 35 μm의 세포를 통해 세포 샘플을 전달스트레나 캡 튜브는 세포 덩어리를 제거합니다. CD4에 대한 샘플을 정렬 + TCR Vβ4 + CD62L + 훈련 연산자 세포 분류기의 셀. 15 ML 튜브에 3 ML DMEM으로 정렬 세포를 수집합니다. 2 × 10 총 4 개 이벤트 / 초의 정렬 속도 1.5 X 10 8 셀 (3 공여 생쥐에서 얻은 세포의 대략적인 개수) 정렬하려면, 설치 등 2.5-3 시간을 허용합니다. 기대 ~ 2.5 × 10 6 비 활성화 된 유전자 변형 CD4 + 세포 분류 한 후 마우스 당 T 세포. </li><li> 정렬의 끝에 정렬 된 세포의 절대 수를 기록하고 300 ~ 400 X g에서 12 분을 원심 분리기. 뜨는을 취소하고 다시 중단 세포 (2 × 10 6 세포 / ㎖)의 멸균 인산 완충 입양 T 세포의 이동을위한 식염수 (PBS) (MG 2 + / 칼슘 2 + 무료). </li></ol> 3. BDC2.5 쥐에서 Diabetogenic CD4의 입양 전송 + T 세포 <ol><li> 다시 일시 중지합니다 FACS - 정제 된 CD4 부드럽게, 1 ML의 주사기와 18-1 ½ 게이지 바늘을 사용하여 +1 ML의 주사기를 T 세포를로드합니다. 주입을위한 준비, 18-1를 교체 ½ 게이지 바늘을 27과 ½ 게이지 바늘을. </li><li> 그들은 행동을 손질 전시 될 때까지 가열 램프 6-8 주 된 여성 NOD.SCID받는 쥐를 노출합니다. </li><li> 고정 장치에서받는 생쥐을 억제하고 주사 부위를 소독 70 % (V / V) 에탄올로 자신의 꼬리를 닦아냅니다. </li><li> 측면 꼬리 정맥 중 하나에 1-2 X 10 6 FACS 분류 세포 / 마우스 (최대 500 μL PBS)로 주입한다. </li></ol> 플런저를 강요하지 않습니다. 바늘이 정맥에 적절하게있는 경우, 주입 거의 저항 일어날 것입니다. 4. 고혈당에 대한받는 사람 쥐 모니터링 및 T1D <ol><li> T 세포 전송 후 5 일부터 NOD.SCID받는 마우스는 제조업체의 지침에 따라 시약 스트립을 (바이엘 Diastix)를 사용하여 높은 소변 포도당 동안 매일 모니터링됩니다. 두 개의 연속 urin와 마우스전자 포도당 수치가&gt; 250 ㎎ / dl로는 당뇨병 간주됩니다. </li></ol>

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<li>van Belle, T. L., Coppieters, K. T., von Herrath, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+1+diabetes%3A+etiology%2C+immunology%2C+and+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Type 1 diabetes: etiology, immunology, and therapeutic strategies.</a> Physiol. Rev. 91, 79-118 (2011).</li>
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<li>Prochazka, M., Gaskins, H. R., Shultz, L. D., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nonobese+diabetic+scid+mouse%3A+model+for+spontaneous+thymomagenesis+associated+with+immunodeficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The nonobese diabetic scid mouse: model for spontaneous thymomagenesis associated with immunodeficiency.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 3290-3294 (1992).</li>
</ol>

모든 마우스는 펜 스테이트 기관 동물 관리의 지침에 따라 및 사용위원회 의과 특정 병원균이없는 (SPF) 시설의 펜실베니아 주립 대학에서 지내게되었다. 저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

T1D은 당뇨병 NOD 마우스 또는 diabetogenic T 세포 클론에서 유래 TCR는 형질 전환 생쥐에서 전체 비장 세포 또는 T 세포 부분 집합의 입양 전송하여 효율성을 다양한에서받는 생쥐에서 유도 할 수 있습니다. 우리는 여기 NOD.SCID 생쥐에 FACS - 정제 CD62L + BDC2.5 형질 전환 된 CD4 + T 세포를 전송하여 100 % 발생에서 2 주 이내에받는 생쥐에서 T1D 유도하는 재생 방법을보고합니다. BDC2.5 T 세포 이동 모델 별 장점은 자연 당뇨병 개월 및 최대 diabetogenic T 세포의 하위 집합 또는 T 세포 클론에 의한 당뇨병 전송을위한 몇 주에 비해 T1D의 매우 짧은 유도 시간을 포함 여기에 설명. 또한, 자신의 동질성으로 인해 BDC2.5 형질 전환 된 T 세포를 정화의 단지 작은 숫자는 높은 효율성과 일관성 T1D 전송해야합니다. 이전 TRA에 형질 전환 BDC2.5 T 세포의 생체 활성에 다른 T 세포...

NOD 마우스는 자발적으로자가 면역 당뇨병을 개발하고 널리 인간의 T1D 1,2에 대한 동물 모델로 사용되었습니다. NOD 생쥐에서 T1D의 발병 기전은 T와 B 세포에 의해 다음 수지상 세포와 대 식세포에 의한 랑게르한스의 췌장의, 나이, 3-4 주에 시작 침윤이 특징입니다. 비파괴 요정 인슐린 염이 단계는 3 세 ~ 6 개월 명백한 당뇨병의 결과로 인슐린 생산 췌장 β 세포의 느린 진보적 인 파괴에 이르게한다. 4,5 비장 세포, CD4 + 당뇨병 NOD 생쥐에서 6,7 또는 CD8 + 8,9 T 세포의 이동은 섬 반응 T 세포가 T1D 병인에 중요한 역할을한다는 것을 나타내는 면역 NOD 생쥐에서 당뇨병을 중재하기 위해 표시되었습니다. 실험 조건에 따라 당뇨병이 연구의 여러 주에 걸쳐 서서히받는 생쥐에서 개발했습니다. 마찬가지로, 다양한 T 세포 클론은 시간과 비용에 의해 파생diabetogenic T 세포의 배양은 몇 주받는 마우스 7,10로 전송 한 후 당뇨병을 중재하는 것으로보고되었다. CD4 또는 CD8 제한된 diabetogenic T 세포 클론, 여러 실험실에서 파생하는 TCR 표현 형질 전환 생쥐의 가용성이어서는 마우스에서 비장 T 세포가 11-13 사람에게 당뇨병을 전송 할 수 있었던 것으로 나타났습니다. 특히, BDC2.5 NOD 마우스는 chromogranin A, 췌장 베타 세포 14-16에서 단백질 특정 BDC2.5 TCR에 대한 형질 전환합니다. 체외 활성화 또는 효율성에게 11,17-19 다양한에서 신생아 나 면역 결핍 NOD 마우스로 당뇨병을 전송 공공연히 당뇨병 또는 prediabetic BDC2.5 생쥐 해제 활성화 또는 전부를 분별 비장 세포에서의 전송합니다. 우리는 정제 된 형질 전환 CD4를 사용하는 간단한 방법 + 높은 효율과 consiste에서받는 생쥐에서 T1D 유도하는 사전 당뇨병 BDC2.5 생쥐에서 T 세포를 설명NCY. 순진, 섬 항원 특이 CD4 + T 세포의 큰 숫자는 CD4에 대한 형광 활성 세포 정렬 (FACS) 형질 전환 TCR Vβ4 체인을 표현 + CD62L + T 세포에 의해 이러한 생쥐에서 격리됩니다. 정제 된 유전자 변형 T 세포는 그 기능 T 및 B 세포의 부족과 인슐린 염 및 당뇨병 무료 20아르 NOD.SCID 마우스로 작동하지 않는 전송됩니다. 받는 마우스는 T 세포 전송 후 2 주 이내에 신속하게 개발 T1D를 나타내는 소변 포도당의 높은 농도를 모니터링합니다. 이종 특이성과 diabetogenic T 세포를 전송, 우리의 프로토콜은 FACS 정렬 된 CD4 + 거의 독점적으로 diabetogenic BDC2.5 TCR을 표현하는 T 세포를 사용하는 다른 방법과 달리. 자신의 동질성으로 인해, 전송 T 세포 (~ 1X10 6 세포 / 마우스) 만 작은 숫자가 100 % 발생에서 2 주 안에 신속하게 T1D 개발을 위해 필요합니다. 우리의 프로토콜의 또 다른 장점은 irradiatio입니다받는 생쥐의 N은 다른 방법입니다 필요하지 않습니다. 이 방법의 잠재적 인 제한은 모두 CD4와 CD8 T 세포의 하위 집합 또는 특정 당뇨병 CD8 T 세포의 공헌에 대해 조사를 허용하지 않는 것입니다. 설명 프로토콜은 대상 기관에 섬 항원 특이 목 세포의 유도에 개입 순진, monospecific CD4 + T 세포뿐만 아니라 치료 전략에 의해 중재 빠른 T1D 개발, 연구에 유용 할 것입니다.

<table><tbody><tr><td>BDC 2.5 TCR 형질전환 NOD 마우스(NOD. Cg-Tg(Tcr&알파; BDC 2.5, Tcr&#946; BDC 2.5)</td><td>JAX</td><td>004460</td><td></td></tr><tr><td>끄덕임. SCID 마우스(NOD. CB17-Prkdcscid/J)</td><td>JAX</td><td>001303</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Themo</td> <td>Scientific</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>바이엘 Diastix</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM2803</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 원뿔형 튜브</td><td>Falcon</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 원뿔형 튜브</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>멸균 수술용 핀셋</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>멸균 작은 쌍의 가위</td> 멸균 큰 쌍의 가위 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m 세포 여과기</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>35 &mu; m 세포 여과기 캡 튜브</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>암모늄-염화물-칼륨(ACK) 버퍼</td><td></td><td></td><td>0.15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA, pH 7.2 in dH2O</td></tr><tr><td>BD FACSFlowTM 칼집 유체</td><td>BD Biosciences</td><td>342003</td><td></td></tr><tr><td>FACS 염색 완충액</td><td></td><td></td><td>PBS, 0.2 mM EDTA, 0.5% BSA/FCS, 필터 멸균</td></tr><tr><td>위상차 현미경</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypan 블루</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>혈구계</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD4 (APC)</td><td>mAb Biolegend</td><td>1005616</td><td>클론 RM4-5</td></tr><tr><td>Anti-TCR V&#946; 4 (FITC)</td><td>mAb BD Biosciences</td><td>553365</td><td>클론 KT4</td></tr><tr><td>Anti-CD62L (PE) mAb</td><td>BD Biosciences</td><td>553151</td><td>클론 MEL-14</td></tr><tr><td>세포 분류기</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>e.g. BD FACSAria III</td></tr><tr><td>열 램프</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>마우스 억제</td><td></td><td></td><td></td></tr>기 <tr><td>1ml 주사기</td><td>Becton Dickinson</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>18-1&frac12; 게이지 바늘 (sterile)</td><td>Becton Dickinson</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>27&frac12; 게이지 바늘 (sterile)</td><td>Becton Dickinson</td><td>305109</td><td></td></tr></tbody></table>

diabetogenic cd4의 입양 전송하여 마우스의 가속 제 1 형 당뇨병 유도 + t 세포

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

nonobese 당뇨병 (NOD) 마우스 자발적 연령 12 주 후에 면역 당뇨병을 개발하고 인간 1 형 당뇨병 (T1D)의 가장 광범위하게 연구 동물 모델입니다. 조사받는 생쥐의 세포 이동 연구는 T 세포가이 모델 T1D 발병에 중요한 것을 설립했다. 우리는 빠르게 정화의 입양 전송에 T1D 유도하기 위해 여기에 간단한 방법을 설명, 기본 CD4 + NOD.SCID받는 생쥐에 섬 특정 T 세포 수용체 (TCR) BDC2.5위한 형질 전환 전 당뇨병 NOD 생쥐에서 T 세포. 이 기술의 주요 장점은 같은 일 이내에, 수신자의 조사가 필요하지 않으며 T1D의 높은 발병률이 T 세포 전송 후 2 주 안에 이끌어됩니다 diabetogenic T 세포의 분리 및 입양 전송이 완료 될 수 있습니다. 따라서, T1D의 병인과 치료 개입의 연구는 이종 T 세포 집단 또는 복제에 의존하는 방법으로보다 빠른 속도로 진행할 수 있습니다당뇨병 NOD 생쥐에서 파생.

우리의 결과는 췌장 림프절로 차 림프 기관에 집 T 세포에 대한 중요한 CD62L을 표현 형질 전환 BDC2.5 세포의 분리를 보여줍니다. 우리의 연구 결과는 더 빠르게 전송하고 효율적으로 NOD.SCID받는 마우스에 T1D이 monospecific T 세포 인구의 강력한 기능을 보여줍니다. diabetogenic CD4 + BDC2.5 생쥐에서 T 세포의 분리는 그림 2에 표시됩니다. 풀 비장과 림프절에서 약 5 × 10 7 세포는 세포 분류하기 전에 기증자 마우스를 당 하였다. 유세포 종류에 따라, ~ 2.5 × 10 6 순진 형질 전환 된 CD4 + T 세포 (CD4 + TCR Vβ4 + CD62L +)가 표시된 게이팅 전략을 사용하여 각 BDC2.5 기증자 마우스에서 얻은 하였다. CD4의 작은 숫자의 예상 입양 전송 등 + TCR Vβ4 + CD6...

우리는 섬 항원 특정 기본 CD4 + T 세포의 입양 전송하여 두 주 이내에 생쥐에서 제 1 형 당뇨병 (T1D)를 유도하는 재생 방법을 제공합니다.

Diabetogenic CD4의 입양 전송하여 마우스의 가속 제 1 형 당뇨병 유도 + T 세포

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

이 실험 절차의 전체적인 목적은 내인성 T 세포 및 B 세포가 결핍된 마우스에 형질전환 마우스로부터 당뇨 유발 T 세포를 이식하여 1형 당뇨병을 빠르게 유도하는 것입니다. 먼저 공여자 마우스에서 비장과 림프절을 채취하고 CD4 양성 T 세포를 정제합니다. 그다음, 정제된 공여자 T 세포를 non-SKID 수혜 마우스에 입양 이식합니다.그 후 수용 쥐에서 1형 당뇨병의 발생 여부를 모니터링합니다. 궁극적으로, 이 프로토콜은 다른 방법들과 비교하여 당뇨병의 발병 기전을 연구하고 치료적 개입을 조사하는 데 사용될 수 있습니다. non-skid 수용 쥐에 BDC 2.5, CD4 양성 T 세포를 이식하는 이 기술의 주요 장점은 1형 당뇨병이 신속하고 재현성 있게 발생한다는 점입니다.당뇨 유발 CD4 양성 T 세포 공여자로, 요당 측정을 통해 당뇨가 없음이 확인된 6주령의 당뇨 전 단계 암컷 BDC 2.5 마우스를 사용합니다. 비장과 림프절을 적출하기 위해 털을 70% 에탄올로 적신 후, 피부를 절개하고 앞다리 근육이 드러날 때까지 피부를 젖힙니다. 앞다리 기저부 근처에서 양쪽에 각각 두 개의 림프절이 보일 것입니다. 작은 핀셋으로 각 림프절을 조심스럽게 잡고 결합 조직을 다듬어 제거합니다.다음으로, 소형 가위를 사용하여 복막에 1인치 길이의 절개를 가합니다. 이제 비장의 중앙 부분을 조심스럽게 잡습니다. 결합 조직과 부착된 지방을 주의 깊게 제거합니다.그런 다음 비장을 적출하여 비장과 림프절을 얼음 위의 10 milliliters DMEM에 넣습니다. 멸균된 10 milliliter 주사기 밀대의 끝을 사용하여 림프 기관을 70 micrometer 세포 스트레이너로 부드럽게 눌러줍니다. 이를 통해 단일 세포 현탁액을 얻습니다.세포 회수율을 극대화하기 위해 각 스트레이너를 1 mL의 DMEM으로 여러 번 헹굽니다. 그런 다음 수집된 세포를 15 mL 원심분리 튜브로 옮기고 400 Gs에서 7분 동안 원심분리합니다. 상온에서 세포 펠릿을 3 mL의 CK 버퍼에 재현탁합니다.이제 상온에서 5분 동안 배양합니다. 적혈구를 용해시키기 위해 DMEM 12 mL를 첨가하고 원심분리를 통해 세포를 펠렛화합니다. 세포 펠렛을 DMEM 10 mL로 한 번 세척합니다.다음으로, 세포를 5 mL의 fact 염색 완충액에 현탁하고, 위상차 현미경과 혈구계수기를 사용하여 생존 세포 수를 측정합니다. 이제 염색 대조군당 약 1×10⁶개의 세포를 취합니다. 또한, 비활성화된 형질전환 CD4 양성 T 세포를 분리하기 위해 마우스 단일클론 항체로 세포를 염색합니다.모든 샘플을 4 °C의 암소에서 30분 동안 배양합니다. 이제 염색액 부피의 3배에 해당하는 FACS 버퍼로 세포를 세 번 세척하고, 소팅 샘플의 경우 mL당 1~2 × 10⁷ cells, 단일 염색 대조군의 경우 300 µL의 FACS 버퍼로 세포를 재부유시킵니다. 다음으로, 세포 샘플을 35 µm 세포 스트레이너 캡 튜브에 통과시킵니다.세포 덩어리를 제거하기 위해, 숙련된 작업자가 있는 세포 분리기를 사용하여 샘플을 처리하십시오. 약 1.5 × 10⁸개의 총 형질전환 naive CD4 양성 T 세포를 분리하는 데 설정 시간을 포함하여 약 3시간이 소요됩니다. 마우스당 약 2.5 × 10⁶개의 세포를 얻을 수 있을 것으로 예상되며, BD FACS Aria와 같은 장비에서의 분리 속도는 초당 약 2 × 10⁴ 이벤트가 될 것입니다. 분리된 세포는 3 mL의 DMEM에 수집하십시오.분리된 세포의 절대 수를 기록하고 7분 동안 원심분리합니다. 400 Gs에서, 입양 T 세포 전이를 위해 세포 펠렛을 멸균 인산 완충 식염수(phosphate buffered saline)에 현탁합니다. 18 gauge 바늘이 장착된 1 mL 주사기를 사용하여 FACS로 정제된 CD4 양성 T 세포를 부드럽게 재현탁합니다.1 mL 주사기에 용액을 채운 후, 주사 준비를 위해 27.5 gauge 바늘을 주사기에 장착합니다. knot skid 수신 마우스를 보정하고, 주사 부위를 소독하기 위해 꼬리를 70% ethanol로 닦아냅니다. 그런 다음, 정제된 CD4 positive T-cells 6 x 10⁵개를 마우스당 1/10 용량으로 양측 미미정맥 중 하나에 주사합니다.꼬리 정맥 주사를 놓을 때 플런저를 무리하게 밀지 않도록 주의하십시오. 바늘이 실제로 정맥 내에 삽입되었다면, 거의 저항 없이 주사가 이루어져야 합니다. T 세포 전이 5일 후부터 NOD skid 수용 마우스에서 1형 당뇨병이 발병하는지 매일 관찰하십시오.제조사의 지침에 따라 시약 스트립을 사용하여 소변 포도당을 측정합니다. 2회 연속으로 소변 포도당 수치가 250 mg/dL 이상으로 측정된 마우스는 당뇨병으로 간주합니다. 일반적인 실험에서, 각 BDC 2.5 공여자 마우스는 세포 분리 후 약 2.5 × 10⁶개의 나이브 형질전환 CD4 양성 T 세포를 생성합니다. 당뇨 유발 CD4 양성 T 세포를 입양 전이한 후, 마우스의 소변 포도당 농도를 모니터링했습니다.BDC 2.5 공여 마우스로부터 소량의 세포를 입양 전이한 결과, 모든 non-skid 수용체에서 11일 차까지 1형 당뇨병이 유도되었습니다. 적절하게 수행될 경우, 이 기술은 장기 적출부터 T-세포 전이까지 약 8시간 이내에 완료될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

우리 프로토콜이 정상적으로 쉽게 생쥐의 신장에 따라 캡슐 아일 레츠이나 세포를 제공하기 위해 개발되었습니다. 세포 신장 캡슐에서 세포를 이식에 사용되는 최종 튜브에 쥐똥에 집중되어있다. 이 기법의 용이성은 세포와 마우스에 스트레스를 줄여줍니다.

당뇨병 마우스의 신장 캡슐으로 췌장 아일 레츠의 이식

우리는 간장 네오 작은 섬 STZ의 형성 (streptozotocin) 유도 도우미에 의존 adenoviral 벡터 (HDAd)과 고혈당증의 반전을 사용하여 유전자 Neurogenin3의 전송 (Ngn3)와 Betacellulin (Btc)에 의해 당뇨병 쥐를.을 설명 우리의 방법은 생체 전달하고 오래 지속 유전자 발현에서의 고효율과 도우미에 의존 adenoviral 벡터의 장점이 소요됩니다.

도우미에 의존 Adenoviral 벡터로 인한 유전자의 전송에 의한 당뇨 쥐의 간에서 네오 - 작은 섬 형성

이 비디오는 이식된 루시페라제 발현 베타 세포를 비만하지 않은 당뇨병성 면역결핍 마우스로 시각화하는 이미징 기반 방법을 보여줍니다. 당뇨병이 있는 쥐에서 비장세포를 도입하면 점진적인 베타 세포 파괴가 일어나며, 기질 도입 후 발광이 감소하여 시각적으로 확인됩니다.

당뇨병성 비장세포에 걸린 면역결핍 마우스의 형질전환 베타 세포 이미징(Imaging Transgenic Beta-Cells in an Immunodeficient Mouse Challenged with Diabetic Splenocytes)

여기에서는 syngeneic CD4+CD45RBhigh T cell을 T 및 B cell 결핍 수용자로 이식하여 마우스에서 결장 염증을 유도하는 프로토콜을 제시합니다. 임상적 및 조직병리학적 특징은 인간의 염증성 장 질환을 모방합니다. 이 방법을 사용하면 결장 염증의 시작과 질병의 진행에 대한 연구를 할 수 있습니다.

이펙터 CD4의 입양 전송하여 쥐과 장내 염증의 유도<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; 높은</sup&gt; 면역 결핍 마우스에게 T 세포

본 호는 시험관 내 및 생체 내에서 사용하기 위해 많은 수의 기능성 T 세포를 산출하는 것을 목표로 항원 특이적 CD8 T 세포의 생성및 시험관 내 확장에 대한 프로토콜을 설명합니다.

자가 면역 당뇨병 모델에서 기능 테스트를 위한 항원 특이적 원발성 원발성 T 세포의 고효율 생성

본 프로토콜에서, 장내 미생물-항원 특이적 T 세포 입양 상반염 모델이 기재된다. CD4+ T 세포는 CBir1 TCR 형질전환 마우스로부터 분리된다. 이들은 면역 지배적인 창자 microbiota 항원 CBir1 flagellin를 위해 특정합니다, 수신자 Rag1/-- 마우스로 전송되는, 장 염증으로 이끌어 내는.

CBir1 TCR 형질 전환 CD4+ T 세포의 입양 전달에 의한 장 염증유도

이 프로토콜은 자발적 당뇨병 NOD 마우스에서 정제된 비장 세포로 도전받은 비만 당뇨병(NOD) 중증 복합 면역 결핍 마우스에서 NIT-1 세포를 이식하고 이미징하기 위한 간단하고 최소 침습적인 방법을 설명합니다.

생쥐에서 자가면역 당뇨병의 입양 이식 모델에서 이식편 생존의 생물발광 모니터링

우리는 인간 줄기세포에서 유래한 췌장 줄기세포 섬을 면역결핍 쥐에 근육 내 이식하여 생체 내 이식과 후속 분석을 위한 최소 침습 프로토콜을 제공합니다.

쥐에서 인간 다능성 줄기세포 유래 췌장 내분비세포의 근육 내 이식

HIV에 감염된 세포 자연 킬러 세포 lytic 응답을 측정하기 위해 세포 독성의 assays는 대상 세포의 순도에 의해 제한됩니다. 우리는 여기서 CD4 아래로 조절하는 HIV - 1의 능력을 활용하여 HIV - 1 감염 기본 T - 세포 폭발의 고도 정화 인구의 절연을 보여줍니다.

준비 및 사용 HIV - 1 차 감염된 CD4 + 대상 세포로 T 세포 자연 킬러 세포 세포 독성 Assays에서

특정 마우스 변종은 myelin 기본 단백질과 함께 실험적인 면역 encephalomyelitis (EAE)의 유도에 저항 할 수 있습니다. 여기에서 설명한 것은 응답하지 않는 문제를 역으로 여러 전형 EAE 모성 마우스 얼룩에 중풍 질환을 유도하는 간단한 예방 접종 프로토콜입니다.

입양 이전 및 Antigenic 챌린지에 의해 실험적 면역 Encephalomyelitis (EAE) 모성 마우스 변종에 응답하지 않는 문제를 극복

학습하세요 CD4+ T 세포 입양 전송을 이용한 마우스 제1형 당뇨병 유도 방법입니다. 이 기술은 2주 내에 재현 가능한 당뇨병 발병을 통해 질병 기전 연구와 치료 개발에 활용됩니다.

Diabetogenic CD4의 입양 전송하여 마우스의 가속 제 1 형 당뇨병 유도 + T 세포

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