Diabetogenic CD4의 입양 전송하여 마우스의 가속 제 1 형 당뇨병 유도 + T 세포

이 절차의 전반적인 목표는 형질전환 마우스의 당뇨병성 T 세포를 내인성 T 및 B 세포가 없는 마우스로 전달하여 마우스에서 1형 당뇨병을 빠르게 유도하는 것입니다. 먼저 기증자 마우스에서 비장과 림프절을 채취하고 CD 4개의 양성 T 세포를 정제합니다. 다음으로, 정제된 공여자 T 세포를 미끄럼 방지 수용 마우스로 이식합니다.

그런 다음 수혜자 마우스에서 1형 당뇨병 발병을 모니터링합니다. 궁극적으로 이 프로토콜은 당뇨병 발병 기전을 연구하고 다른 방법과 비교하여 치료 개입을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. BDC 2.5, CD 4 양성 T 세포를 미끄럼 방지 수용자에게 전달하는 이 기술의 주요 장점은 1형 당뇨병의 빠르고 재현 가능한 발병입니다.

당뇨병성 CD 기증자의 경우, 4개의 양성 T 세포는 소변 포도당 측정에 의해 당뇨병이 없는 것으로 확인된 6주 된 당뇨병 전 여성 BDC 2.5 마우스를 사용합니다. 비장과 림프절을 제거하려면 털에 70% 에탄올을 적신 다음 피부를 자르고 앞다리의 근육이 노출될 때까지 피부를 집어넣습니다. 앞다리 기저부 근처에서 양쪽에 있는 두 개의 림프절이 보여야 합니다 작은 핀셋으로 각 림프절을 조심스럽게 잡고 결합 조직을 다듬어 제거합니다.

그런 다음 작은 가위를 사용하여 복막을 1인치 절개합니다. 이제 중앙의 비장을 부드럽게 잡습니다. 결합 조직과 부착된 지방을 조심스럽게 제거합니다.

그런 다음 얼음에 적신 10ml의 DMEM으로 비장, 레이스, 비장 및 림프절을 제거합니다. 멸균 10ml 주사기 플런저 끝으로 70마이크로미터 세포 여과기를 통해 림프 장기를 부드럽게 누릅니다. 단일 세포 현탁액을 얻기 위해.

각 스트레이너를 1ml의 DMEM으로 여러 번 헹구어 세포 회수를 극대화합니다. 그런 다음 수집된 세포를 15ml 원뿔형 튜브에 넣고 400Gs에서 7분 동안 원심분리합니다. 실온에서 세포 펠릿을 3 밀리리터의 CK 완충액에 다시 현탁시킵니다.

이제 모든 실내 온도를 5분 동안 배양합니다. 적혈구를 잿물로 만들기 위해 이제 12ml의 DMEM을 첨가하고 원심분리로 세포를 펠릿화합니다. 세포 펠릿을 10ml의 DMEM으로 한 번 세척합니다.

다음으로, 5밀리리터의 사실 염색 완충액에 세포를 현탁시키고 위상차 현미경과 혈구분석기를 사용하여 생존 가능한 세포의 수를 계산합니다. 이제 염색 대조군당 6개의 세포 중 10개의 약 1배를 제거합니다. 또한 세포를 마우스 단클론 항체로 염색하여 활성화되지 않은 형질전환 CD 4개의 양성 T 세포를 분류합니다.

모든 샘플을 섭씨 4도의 어둠 속에서 30분 동안 배양합니다. 이제 팩스 버퍼의 염색량의 3배로 세포를 세척하고 팩스 버퍼에 1-2배의 세포를 재현탁시키며, 10배, 시료 분류를 위해 밀리리터당 7개의 셀, 단일 염색 제어를 위해 300마이크로리터를 사용합니다. 다음으로, 세포 샘플을 35마이크로미터 셀 스트레이너 캡 튜브에 통과시킵니다.

세포 덩어리를 제거하기 위해 훈련된 작업자와 함께 세포 분류기를 위한 샘플을 처리합니다. 약 1.5배, 10배, 총 8번째 합계 형질전환 나이브 CD 4개의 양성 T 세포를 분류하는 데 걸리는 설정 시간을 포함하여 약 3시간을 허용합니다. 마우스당 6개의 셀 중 약 2.5 곱하기 10을 예상할 수 있으며 정렬 속도는 BD Fox Aria와 같은 악기에서 초당 4번째 이벤트의 약 2 곱하기 10이 될 것입니다. 분류된 세포를 3mL의 DMEM으로 수집합니다.

분류된 세포의 절대 수를 기록하고 7분 동안 원심분리합니다. 400Gs에서, 우리는 채택 T 세포 전달을 위해 멸균 인산염 완충 식염수에 세포 펠릿을 현탁시킵니다. 18 게이지 바늘에 1 밀리리터 주사기를 사용하여 팩스 정제 CD 4 개의 양성 T 세포를 부드럽게 재현 탁

1밀리리터 주사기를 장전한 다음 주사를 준비하기 위해 27포인트 하프 게이지 바늘을 주사기에 부착합니다. 매듭 스키드 수혜 쥐를 제지하고 꼬리를 70% 에탄올로 닦아 주사 부위를 소독합니다. 그런 다음 마우스당 6개의 정제된 CD 중 10분의 1인 4개의 양성 T 세포를 측면 꼬리 정맥 중 하나에 주입합니다.

꼬리 정맥 주사를 할 때 플런저에게 힘을 가하지 않도록 하십시오. 바늘이 실제로 정맥에 있는 경우, T 세포 이식 후 5일 후부터 거의 저항 없이 주사를 맞아야 합니다. Nod skid 수용 마우스의 1형 당뇨병 발병을 매일 모니터링합니다.

제조업체와 지침에 따라 시약 스트립을 사용하여 소변 포도당을 측정합니다. 소변 포도당 수치가 2회 연속 250mg/250mg 이상인 마우스는 당뇨병으로 간주됩니다. 일반적인 실험에서, 각 BDC 2.5 공여자 마우스는 당뇨병성 CD 4개의 양성 T 세포를 채택한 후 세포 분류 후 6개의 순진한 형질전환 CD 4개의 양성 T 세포 중 약 2.5배를 산출하고, 마우스의 소변 포도당 농도를 모니터링했습니다.

BDC 2.5 기증자 마우스에서 소량의 세포를 입양하여 이식한 결과 11일까지 모든 비미끄럼 수용자에서 제1형 당뇨병이 유발되었습니다. 이 기법을 적절하게 사용하면 장기 적출부터 T 세포 이식까지 약 8시간 내에 완료할 수 있습니다.