Name: 의 적용 체외 DNA 보호 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 41 s
Description: 배우세요 Dps 단백질의 체외 DNA 보호 분석 방법을 E. coli에서 정제하여 활성산소로 인한 DNA 손상을 시각화합니다. 이 프로토콜은 세균의 산화 스트레스 생존 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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우리는 미카엘라 데 마르티노, 윌프레드 R. 하겐, 유용한 토론 Kourosh Honarmand Ebrahimi에 감사합니다. 이 작품은 기술의 델프트 대학에서 기금을 시작으로 지원되었다.

1. DPS 발현과 정제 높은 순도의 단백질을 얻기 DNA 보호 분석을위한 필수적인 첫 번째 단계입니다. DPS 단백질의 정제는 4 5 일에서 수행 할 수 있습니다. <ol><li> E.의 단백질 분해 효소 결핍 긴장을 변환 DPS 단백질 인코딩 시퀀스가 복제 된 어떤에 애완 동물 벡터 (예 : pET17 등)와 대장균 (예 : BL21 (DE3) pLysS 등). </li><li> 킬 적절한 항생제 (예 : 1.1에서 제공하는 예제 암피실린 및 클로람페니콜 등)를 포함 루리아 국물 (LB) 한천 플레이트에 세포를 변형. 37에서 하룻밤 번호판을 품어 ° C. </li><li> 적절한 항생제를 포함하는 LB 매체의 30 ML에 플레이트에서 단일 콜로니를 접종한다. 37 밤새 품어 ° C 200 ~ 250 rpm으로 흔들어. </li><li> 10 ML 야간 문화의 각각 적절한 항생제를 포함하는 2 x 1 L의 LB 배지에 접종한다. OD 600에 떨고 동안 37 ° C에서 성장 </서브&gt; 약 0.6. (눈에 띄게 최종 제품의 순도를 손상시키지 않고, 더 높은 OD 증가 단백질 수율에 세포 성장을.) 0.3 mM의 농도로 IPTG 첨가하여 공격력의 발현을 유도하고, 흔들어 섞으면 서 37 ° C 3 ~ 4 시간 동안 배양한다. </li><li> 15 분 6,000 XG에서 원심 분리하여 수확 세포. 유도 세포 배양의 L 당 DEAE 버퍼 (50 MM의 HEPES - 코이, 산도 7.5, 100 MM의 염화나트륨, 0.1 mM의 EDTA) 7.5 ㎖에 세포 펠렛을 resuspend을. 샘플은 액체 질소에 냉동 원하는 경우, -80 ° C에 저장할 수 있습니다. 절차는 다음 4 ℃에서 물을 욕조에 샘플을 해동 계속 될 수있다 </li><li> 과발현 공격력의 저하를 방지하기 위해 세포 현탁액에 프로테아제 억제제 (예 : Calbiochem 세트 III 단백질 분해 효소 억제제로 세포 현탁액의 ML 당 0.167 μL)에서의 혼합물을 추가합니다. </li><li> 프랑스 프레스를 사용하여 세포가없는 추출물을 준비합니다. 20 ML DEAE 버퍼 (연속 흐름 모델을 사용하는 경우), 다음 운영 중단과 총리는 프랑스 프레스t 20 KPSI 두 번 샘플. 불용성 입자를 명확히하기 위해 4 ° C에서 35 분 동안 30,000 XG에서 해물을 원심 분리기 및 뜨는을 저장합니다. 원하는 경우 상층 액을 한 후, 액체 질소를 사용하여 냉동 및 -80 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> FPLC를 사용하여 DEAE 버퍼와 함께 30 ML DEAE 세파 CL-6B 열을 평형. 배경 0.2 MPa의의 최대 압력으로 1-2 ML / 분에 열을 버퍼를 실행합니다. 칼럼에있는 셀이없는 추출물을로드하고 흐름을 통해 OD 280 신호가 기준보다 증가하기 시작 한 번 수집하기 시작합니다. DEAE 버퍼 열을 씻어 지속적으로 흐름을 통해 수집하는 동안 OD 280 값이 기준에 돌아올 때까지. 흐름을 통해 바인딩 된 DNA에서 무료로 DPS 단백질의 대부분을 포함해야합니다. 100 % 버퍼 B (50 MM의 HEPES - 코이, 산도 7.5, 1 M의 NaCl, 0.1 mM의 EDTA)로 컬럼을 씻으십시오. 이 용출액은 DPS-DNA 복합체뿐만 아니라 다른 단백질을 포함하고 삭제할 수 있습니다. </li><li> 광고를 제거황산 암모늄 침전을 통해 단백질을 추가적인 오염. 풀링 흐름을 통해의 볼륨을 결정합니다. 천천히 (20 분 동안) 4시에 62 % 포화 (솔루션의 ML 당 390 밀리그램)에 ° C 잘 교반하면서 건조한 작은 입자 황산 암모늄을 추가합니다. 완전한 평형을 보장하기 위해 황산 암모늄의 마지막 부분을 추가 한 후 추가로 20 ~ 30 분 동안 혼합물을 저어. 오염 단백질 용액 침전 할 때 DPS는, 용해 상태로 유지됩니다. </li><li> 4에서 30 분 동안 20,000 XG에서 원심 분리하여 침전 된 단백질을 제거 ° C 및 뜨는을 저장합니다. </li><li> 천천히 94 % 포화에 도달하고 완전한 평형을 보장하기 위해 20-30 분 동안 저어 상등액의 ML 당 추가로 227 mg을 황산 암모늄을 추가합니다. 공격력이 높은 염 농도에서 침전, 4 ℃에서 30 분 동안 20,000 XG에서 원심 분리하여 수집 할 수 있습니다 DPS는 펠릿에있을 것이다 상층 액을 삭제할 수 있습니다. 펠렛은 -80 ° C에 저장할 수 있습니다 경우 데IRED. </li><li> 부유 버퍼의 DPS 함유 펠렛을 (50 mM의 HEPES - 코이, 산도 7.5, 150 MM의 염화나트륨, 0.1 mM의 EDTA)를 Resuspend. 2.5 ML로 샘플 볼륨을 조정합니다. </li><li> 버퍼 교환은 PD-10 겔 여과 칼럼을 사용하여 황산 암모늄을 제거합니다. 25 ML의 부유 버퍼에 젤 침대 평형. PD-10 열 상단에 DPS 샘플의 2.5 ML을 적용하고 흐름을 통해 폐기 안으로 흡수 할 수 있습니다. 3.5 ML의 부유 버퍼에 용출 DPS를 수집합니다. </li><li> 4 10 분 16,000 XG에서 버퍼 교환 샘플을 원심 분리기 ° C 모든 불용성 구성 요소를 제거하고, 6-10 ML 희석 버퍼 (50 MM의 HEPES - 코이, 산도 7.5, 0.1 mM의 EDTA)로 희석을 보장하기 위해 그 소금 농도는 DPS가 SP 파로스 열에 바인딩 할 정도로 낮습니다. 초당 특히 농축 시료는 액체의 흐림에 의해 입증 낮은 소금 버퍼에 희석시 작 용해 될 수 있지만, 완전히 작은 amou의 추가에 의해 resolubilized 할 수 있습니다5 M 염화나트륨 용액 NT (추가 10-20 밀리미터). </li><li> SP 버퍼 (50 MM의 HEPES - 코이, 산도 7.5, 50 MM의 염화나트륨, 0.1 mM의 EDTA)와 함께 30 ML SP 세파 빠른 흐름 열 평형. 1.5 ML / 배경 위에 0.3 MPa까지 압력 한계를 가진 분에 열을 버퍼를 실행합니다. 컬럼에 샘플을로드합니다. OD 280 추적이 반환 될 때까지 기준선에 SP 버퍼로 세척하고 흐름을 통해 폐기하십시오. 2 ㎖ 분수를 수집하는 동안, 0 100 % 버퍼 B에서 1​​50 ML 선형 그라데이션을 실행합니다. 10 % 변형이 가능하지만 공격력은 약 50 % B에서 날카로운 피크 용출된다. </li><li> 15 % SDS-PAGE 젤에 용출 분획을 실행하고 분광 광도계를 사용하여 OD 260 / OD 280 비율을 측정하여 DNA의 오염을 확인합니다. 젤은 19 kDa의 주위에 하나의 밴드를 표시해야하며, OD 260 / OD 280 0.7 주위에 일반적이다. 순수한 DPS의 분수 수영장. 와 원심 필터 장치 (예 : Amicon 울트라 여과 장치)를 사용10K 분자량 컷 - 오프 초당 집중하고 저장 버퍼 (50 MM의 HEPES - 코이, 산도 7.5, 50 MM의 염화나트륨)로 교환합니다. -80에서 저장을위한 액체 질소에 분주은 정제 된 DPS 및 동결 ° C. </li></ol> 2. DNA 보호 분석 분석은 여러 시간에 민감한 단계를 포함하고 재현성 결과를 얻기 위해 두 번째로 초과해야한다. 다양한 재료와 피펫 단계가 포함되어 피펫 테이블 (표 1 참조) 단계와 볼륨을 추적하는 것이 좋습니다 때문에. 분석에 필요한 총 시간은 더 이상 3 시간입니다. <ol><li> 밀폐 유리 병에 30 ML 물을 측정, 용액으로부터 산소를 제거하는 10 분 (두 주사기 바늘, 액체의 한, 그 위에 하나를 사용하여)에 대한 N 2와 물을 세척하십시오. 2 밀리미터 주식 솔루션을 얻기 위해 물에 0.0168 g FeSO 4 • 7H 2 O를 추가합니다. 유리 병을 밀봉하고 혼합 한 후, 더 5 분 동안 질소로 세척하십시오. 해결책은해야합니다분명, 노란색의 힌트가 감지되면, 새로운 철 용액을 준비합니다. </li><li> 얼음에 보관하고 알루미늄 호일에 싸서 빛으로부터 보호, H 2 O 2 용액 (1ml를 물에 9.2MH 2 O 2의 10.87 μL)이 100 밀리미터를 확인합니다. 자연 붕괴로 인해 준비 후 1-2 시간 동안 만 사용하십시오. 과산화수소 주식은 부분적으로 적절한 보관 (어둠 속에서, 4 ° C에서)에 의해 개량 할 수있다 고장에 유사하게 적용됩니다. OD 240을 측정하여 주식의 농도를 정기적으로 검사하는 것이 좋습니다. </li><li> 상온의 물을 욕조에 빠르게 초당 정화의 나누어 지는를 해동, 얼음 계속. 침전 집계에 테이블 상단 picocentrifuge 4,000 XG에 10 초 동안 원심 분리기. 분광 광도계 (OD 280 = 1.547 100 μM 단량체 DPS의 농도를 나타낸다)를 사용하여 원심 분리 한 후 농도를 측정한다. </li><li> 12X 반응 버퍼 (1을 사용하여 높은 농도 재고에서 선형 DNA를 희석μL / NG 100의 농도 M MOPS-KOH 산도 7.0, 1 M NaCl을). 선형 DNA를 정량보다 쉽게​​ 사용되지만, 플라스미드 DNA도 함께 사용할 수 있습니다. </li><li> PCR 튜브에 DNA 버퍼 혼합물의 피펫 1 μL. 최종 반응 부피 (마이너스 SDS)은 12 μL 될 수 있도록 반응에 충분한 물을 추가합니다. 이 금액은 피펫 테이블을 사용하여 사전에 계산되어야한다. 3 μM의 최종 dodecamer 농도에 DPS를 추가합니다. DPS는 DNA에 결합 할 수 있도록 실온에서 15 분 알을 품다. </li><li> 원하는 농도에 도달하는 2 개 mm FeSO 4 용액을 추가합니다. 전형적인 실험은 0에서 1 mM의 FeSO 4 농도의 범위를 사용합니다. 높은 농도는 더 광범위한 DNA 저하의 원인이됩니다뿐만 아니라 철은 반응 혼합물에 침전물의 형성으로 이어질 수 있습니다. 빨리 100 개 mm H 2 O 2 용액 (10 mM의 최종 농도) 1 μl를 추가하고, 펜톤 수 있도록, 5 분 실온에서 알을 품다자리를 차지할 매개 분해 반응. </li><li> 20 % SDS (나트륨 도데 실 황산)의 0.8 μl를 추가합니다. 혼합 DPS-DNA 복합체를 방해하는 5 분 동안 85 ° C에서 알을 품다. SDS는 DPS-DNA 복합체를 불안정하게하고 정량의 용이성을 향상 DNA, 원치 않는 젤 변화를 방지 할 수 있습니다. 선택적 단계는 무독성 제품으로 촉매 분해 과산화수소로 반응을 중지하는 것입니다. 이 프로토콜에 설명 된 조건이 단계는 DNA 저하의 넓은 범위를 얻기 위해 필요하지 않습니다. </li><li> 염료를로드 추가 1 분 동안 얼음에 품어와 아가로 오스 겔에로드합니다. 젤을 실행하고 ethidium의 브로마이드를 사용하여 DNA를 얼룩. 젤은 젤 ethidium의 브로마이드 유통을 방해 SDS를 방지하기 위해 사후 전기 스테인드보다는 전기 이전에해야한다. </li></ol>

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</ol>

우리는 공개 아무것도 없어.

이 문서에 설명 된대로 공격력의 정화 과정은 매우 강력합니다. 순도는 지속적으로 (&gt; 99 %) 고하고있다, 다른 단백질 보이는 밴드로 SDS-PAGE 젤에 표시되지 않습니다. DPS의 매우 높은 농도로 배양 할 때 부분적으로 DNA의 분해에 의해 입증 그럼에도 불구하고, 정제 된 DPS의 일부 일괄 처리, 핵산의 활동이 나타납니다. 이것은 우리가 정화를 통해 제거 할 수 없었던 낮은 농도에서 높은 활성 DNases의 존재를 나타낼 수 있습니다. 그러나,이 DNA의 분해는 일반적으로 체외 분석에 사용되지 않습니다 농도에서 관찰되므로 일반적으로 문제가되지 않습니다. 이 문서에 나와있는 DPS 정화 프로토콜은 몇 가지 장점이 있습니다. 단백질 선호도 태그가 될 필요가 없습니다, 기능을 방해 가능성이 존재하지 않도록. 정제 된 단백질은 DNA 무료이므로 체외 분석에서 DNA 결합 특성이 저하되지 않습니다 포함오염 가능성 아티팩트에서. 마지막으로...

호기성 생물은 끊임없이 자신의 DNA뿐만 아니라 다른 중요한 생물학적 거대 분자를 손상시킬 수있는 반응성 산소 종으로 주장해야합니다. 산화 손상의 독성을 중화하는 하나의 강력한 도구 굶주린 세포 (DPS)에서 DNA 결합 단백질이다. 굶주린 E.에서 1992 년 발견 이후 대장균 문화 1, 공격력이 박테리아와 archaebacteria 2의 300 개 이상의 종에서 발견되었습니다. 정지 단계 동안 초당 엄청난 상향 조절은 E의 가장 높은 표현 핵 양체 - 관련 단백질을 만든다 기아 상태 3, 4 이하 대장균. 또한, DPS는 기아, 높은 철 농도, 자외선 노출, 열 충격 및 산화 스트레스 5, 6을 (를) 포함하여 많은 다양한 스트레스 동안 세균의 생존과 DNA의 무결성을 모두 보존하기 위해 표시되었습니다. 12 단량체, w의 안정적인 호모 중합체 복합에 구조적, DPS는 자기 동료의 hich은 구형 빈 껍질로 조립합니다. ~ 4.5 nm의 넓은 내부 구멍은 작은 분자 (7)의 통과를 허용 모공을 통해 용매를 외부에 액세스 할 수 있습니다, 그것은 철 8과 같은 광물 금속을 격리 할 수 있습니다. DPS의 보호 효과가 아닌 특정 DNA 바인딩 1, ferroxidase 활동 및 철 저장 8 등의 여러 가지 생화학 적 활동에서 파생됩니다. DPS의 유익한 생화학 활동의 자세한 연구는 먼저 정화가 필요합니다. DPS는뿐만 아니라 다른 단백질 분리뿐만 아니라, 바인드 된 DNA 7에서해야하므로 초당 정화는 정교한 절차입니다. 우리 최적의 정화 과정은 두 이온 교환 컬럼과 황산 암모늄 침전 단계로 구성된, 많은 일반적인 기술을 사용합니다. 고도로 집중된 공격력이 낮은 소금 조건에서 용액 침전 수있는 여러 버퍼 교환이 필요합니다. 일단 DPS 단백질은 정제 된, 그것은 직접 ferroxidase 활동 8, DNA-결합 양론 9, 철 결합 10의 메커니즘을 측정 분석에 적용 할 수 있습니다. 정제 DPS는 다른 잠재적 인 응용 프로그램이 있습니다. DPS의 안정 중공 구형 구조는 단백질 캐비티 내부 11 소수성 입자를 저장하기위한 발판으로 사용되어 반응 챔버 소설 자성 나노 입자에게 12 합성하는 것 같이. 활성 산소로 인한 손상을 중재하는 초당 공격력의 보호 능력은 명확해야하며 직접 DNA 보호 분석 13, 14을 사용하여 설명 할 수 있습니다. 철 펜튼 화학을 통해 H 2 O 2 분해를 촉진 할 때 체외 과정에서이, 라디칼이 생성됩니다. 이러한 활성 산소를 직접 반응에서 DNA 선물을 손상하고 완전하게 높은 농도를 저하시킬 수 있습니다. 두 가지 주요 DPS 활동은 직접 Fent의 효과를 방해 할 수 두에 매개 급진적 인 생산. DPS는 프로세스에 사용할 수있는 과산화수소를 소모 광물을 촉매 철의 농도를 낮춘다. 또한, DNA에 바인딩 초당 잠재적으로 유리기 손상으로부터 물리적으로 보호하고 덜 반응 표면적이 작은 볼륨으로 그것을 응축 수 있습니다. 이 두 속성의 조합은 잘 보호 DPS 활동을 측정하는 목적에 적합한 DNA 보호 분석을합니다. DNA 보호 분석은 매우 다재다능하고 DPS 특성을 넘어 다양한 애플리케이션에 사용될 수 있습니다. 유리기 손상은 세포의 스트레스의 일반적인 형태이고, 많은 다른 단백질과 화학 물질을 중화하는 데 사용됩니다. 유리기 손상에 대한 마커로 DNA의 무결성을 사용하여 분석의 일반적인 원칙은 거의 모든 라디칼 생산 반응 또는 방해를 에이전트와 함께 사용할 수 있습니다. 다른 사람의 사이에서, 분석은 성공적으로 항산화 특성을 결정하는 데 사용되었습니다K.의 수산기 손상 중재 16 요산의 효과를 특성화하고, 모피 전사 조절 단백질 17의 기능에 새로운 통찰력을 얻기 위해 식품 산업 15에 사용의 paniculata 압축을 풉니 다. 발표 논문에서 분석의 다양한 사용에도 불구하고, 우리는 처음으로 많은 연구자에 대한 불필요 힘든 프로세스에 대한 분석을 설정하게되는 많은 최적화 및 문제 해결 단계가 필수 였을 것으로 나타났습니다. 우리는이 문서에서 제시 프로토콜 항목이 장벽을 제거하는 것을 목표로하고있다.

<table><tbody><tr><td>BL21(DE3)pLysS 유능 세포</td><td>Promega</td><td>L1195</td><td></td></tr><tr><td>pET-17b DNA</td><td>EMD-Millipore</td><td>69663-3</td><td></td></tr><tr><td>LB 육수 분말</td><td>시그마-알드리치</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>암피실린 나트륨 염</td><td>시그마-알드리치</td><td>A0166</td><td></td></tr><tr><td>클로람페니콜</td><td>시그마-알드리치</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>시그마-알드리치</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>BDH</td><td>441476L</td><td></td></tr><tr><td>수산화 칼</td>륨 <td>Merck</td><td>105033</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>VWR</td><td>443824T</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일 세트 III</td><td>EMD-Millipore</td><td>539134</td><td></td></tr><tr><td>DEAE-Sepharose</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>DFF100</td><td></td></tr><tr><td>황산 암모늄</td><td>시그마-알드리치</td><td>A4418</td><td></td></tr><tr><td>PD-10 탈염 컬럼</td><td>GE 헬스케어 LS</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>SP-세파로스</td><td>시그마-알드리치</td><td>S1799</td><td></td></tr><tr><td>아미콘 울트라 센트. 필터 (10K MWCO)</td><td>Millipore</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>Ferrous Sulphate heptahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8048</td><td></td></tr><tr><td>과산화수소 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Calbiochem</td><td>475898</td><td></td></tr><tr><td>SDS 용액</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0418</td><td></td></tr><tr><td>브롬화 에티듐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>정적 인큐베이터</td><td>Hettich</td><td>INE500</td><td></td></tr><tr><td>쉐이킹 인큐베이터 </td><td>New Brunswick Sc.</td><td>Inova 44</td><td></td></tr><tr><td>냉각 원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td>Avanti J-E</td><td></td></tr><tr><td>탁상용 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Cell disrupter</td><td>Constant Systems Ltd.</td><td>TS2/40/AA/AA</td><td></td></tr><tr><td>FPLC 정수기</td><td>General Electric</td><td>AKTA</td><td></td></tr><tr><td>밀폐 바이알</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-08918-85</td><td></td></tr><tr><td>주사기 바늘</td><td>BD</td><td>305128</td><td></td></tr><tr><td>피펫</td><td>Eppendorf</td><td>Z683779-1EA, Z683795-1EA</td><td></td></tr></tbody></table>

의 적용<em&gt; 체외</emdps 단백질의 스트레스 중재 속성을 시각화&gt; dna 보호 분석

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

산화 스트레스는 유산소 생활의 피할 수없는 부산물이다. 산소 분자 지상파 신진 대사를 위해 필수적이며,뿐만 아니라 살아있는 유기체 내의 많은 손상 반응에 참여합니다. 삶에 대한 또 다른 중요한 화합물이다 호기성 대사와 철의 결합은 펜톤 화학을 통해 래디 칼을 생산하고 세포 구성 요소를 분해하기 위해 충분하다. DNA 수리 멀리 사소한에서 그대로 DNA 저하, 틀림없이 세포 내 활성 산소를 포함하는 가장 유해한 프로세스입니다. 이 문서에서 제시된 분석은 급진적 인 매개 DNA 손상에 대한 분자와 효소의 효과를 측정하고 시각화하는 정량 기법을 제공합니다. DNA 보호 분석은 단백질이나 화학 물질의 보호 속성의 체외 특성화, 간단한 빠르고 강력한 도구입니다. 그것은 손상 산화 반응에 DNA를 노출하고 그 화합물의 농도를 다양하게 추가 포함. 화합물의 농도의 함수로 DNA 손상의 감소 또는 증가는 다음 겔 전기 영동을 사용하여 시각화합니다. 이 문서에서 우리는 굶주린 세포 (DPS)에서 DNA-결합 단백질의 보호 특성을 측정하여 DNA 보호 분석의 기법을 보여줍니다. 공격력이 강력하게 환경 스트레스에 대처하기 위해 300 개 이상의 박테리아에 의해 이용되는 미니 페리틴입니다. 여기에서 우리는 DPS 정화 프로토콜과 DPS에 의해 DNA의 보호를 평가하기위한 최적의 분석 조건을 제시한다.

여기에 설명 된 DPS의 정화 과정은 매우 재현. 설명 프로토콜에 따라 DPS 정화, E. 2 L을 사용하여 시작 지점으로 대장균 문화, 일반적으로 5, 12 μM 사이의 농도에서 12 초당을 포함하는 단백질 2.5 mL를 얻을 것입니다. 긴 유도 회 (4 시간)이 변동성을 줄일 것으로 보인다. 단백질 순도는 SDS-PAGE 젤 (그림 1)에 의해 입증, 99 % 이상 일관되게됩니다. DNA 오염의 수준은 모두 DNA와 OD 260 / OD 280 비율 스테인드 아가로 오스 젤에 의해 입증, 지속적으로 무시할 수 있습니다. 이 값은 다를 수 있지만, 값은 DNA의 오염 수준이 아니라 5 % 이하로 남아 있음을 나타내는 0.9 이상 결코 없습니다. DNA 보호 분석의 결과의 재현성 실행에 크게 의존 할 것이다. 모든 성분의 농도를 정확하게 측정하는 경우 (특...

굶주린 세포 (DPS)에서 DNA-결합 단백질은 세균의 스트레스를 퇴치에 중요한 역할을한다. 이 문서의 정화에 대해 설명합니다<em&gt; E. 대장균</em&gt; 공격력과에 대한 프로토콜<em&gt; 체외에서</em&gt; 분석은 활성 산소에 의해 분해로부터 DNA의 DPS - 중재 보호를 시연.

의 적용<em&gt; 체외</emDPS 단백질의 스트레스 중재 속성을 시각화&gt; DNA 보호 분석

Oxidative stress is an unavoidable byproduct of  aerobic life.  Molecular oxygen is  essential for terrestrial metabolism, but it also takes part in many ...

다음 실험의 전반적인 목표는 DPS 활성으로 인한 라디칼 매개 DNA 손상의 감소를 시각화함으로써 DPS 단백질의 보호 효과를 in vitro에서 분석하는 것입니다. 이를 위해 먼저 여러 개의 이온 교환 컬럼과 황산암모늄 침전법을 이용하여 E. coli 세포로부터 DPS를 정제합니다. 두 번째 단계에서는 정제된 DPS를 DNA에 첨가하며, 단백질의 비특이적 DNA 결합 특성으로 인해 DPS-DNA 복합체가 형성됩니다. 그 다음, 펜톤 반응(Fenton chemistry)을 통해 하이드록실 라디칼을 생성하여 DNA를 손상시키기 위해 철(III) 이온과 과산화수소 용액을 반응액에 첨가합니다.전기영동 후 agarose 겔에서 손상되지 않은 DNA 밴드를 정량화한 결과, DPS의 존재로 인해 DNA 손상이 감소한 것으로 나타났습니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 연구자는 시약 준비 과정에서 어려움을 겪을 수 있습니다. 이는 ferric iron 침전물 형성이나 과산화수소의 자연 분해와 같이 원치 않는 부반응을 유발합니다.이 방법은 산화적 스트레스에 대한 DPS의 보호 활성에 대한 통찰을 제공하지만, 다른 단백질 및 화학 물질이 DNA 분해에 미치는 영향을 정량화하는 데에도 적용될 수 있습니다. 이 방법은 식품 산업에서 사용될 세포 추출물의 항산화 특성을 결정하는 것과 같이 산화 화학 분야의 핵심적인 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. DNA 보호 분석을 위한 필수적인 첫 번째 단계는 고순도의 DPS 단백질을 얻는 것입니다.DPS 발현 및 정제 절차를 시작하려면, DPS 단백질 인코딩 서열이 클로닝된 pet 벡터가 형질전환된 프로테아제 결핍 e coli 균주를 준비합니다. 적절한 항생제가 포함된 1L LB 배지 플라스크 두 개에 각각 10mL를 접종합니다. 형질전환된 세포의 단일 콜로니로부터 배양한 각각의 오버나이트 배양물을 37°C에서 진탕 배양하여 OD 600이 약 0.6이 될 때까지 성장시킵니다.세포가 원하는 OD 값에 도달하면, IPTG를 최종 농도 0.3 mM이 되도록 첨가하여 DPS 발현을 유도합니다. 37 °C에서 3~4시간 동안 진탕 배양한 후, 6,000 ×g에서 15분간 원심분리하여 세포를 수확합니다. 수확한 세포 펠릿을 유도된 세포 배양액 1 L당 7.5 mL의 DEAE 버퍼에 현탁하고, 모아진 세포 현탁액에 프로테아제 억제제 혼합물을 첨가합니다. 과발현된 TPS의 분해를 방지하기 위해, French press를 사용하여 세포 없는 추출물을 준비합니다.20 milliliters의 DEAE buffer A가 들어있는 프렌치 프레스로 샘플을 20 KPSI에서 두 번 파쇄한 후, 용해물을 4°C에서 30,000 GS로 35분 동안 원심분리합니다. 불용성 입자를 제거하기 위해 상층액을 회수하고, DEAE buffer A로 평형화된 30 milliliter DEAE SRO SEAL six B 컬럼에 세포 무함유 추출물을 로딩하며 통과액(flow through)을 수집하기 시작합니다. OD 280 신호가 기저선(baseline) 위로 상승하기 시작하면, 통과액을 계속 수집하면서 OD 280 값이 기저선으로 돌아올 때까지 DEAE buffer A로 컬럼을 세척합니다.통과액(flow through)에는 결합된 DNA가 없는 대부분의 DPS 단백질이 포함되어 있어야 하며, 100% buffer B로 컬럼을 세척합니다. 이 용출액에는 DPS-DNA 복합체와 기타 단백질이 포함되어 있으므로 폐기할 수 있습니다. 다음 단계는 황산암모늄 침전법을 통해 추가적인 오염 단백질을 제거하는 것이며, 일반적으로 저온실에서 수행됩니다.혼합된 통과액(flow through)의 부피를 측정한 후, 4°C에서 교반하면서 10~20분에 걸쳐 건조된 미립자 황산암모늄을 천천히 첨가하여 포화도를 62%까지 높입니다. 4°C에서 20,000 ×g로 30분간 원심분리하여 침전된 단백질을 완전히 제거합니다. 상층액을 천천히 회수합니다.상등액 1밀리리터당 227 milligrams의 황산암모늄을 추가로 가하여 94% 포화도에 도달하게 한 후 20~30분 동안 교반합니다. 이 높은 염 농도에서 TPS 침전물이 완전히 평형을 이루도록 하여, 4°C에서 20,000 GS로 30분간 원심분리하여 DPS를 수집합니다. DPS가 포함된 펠렛을 Resus suspension Buffer에 재현탁하고 샘플 부피를 2.5 milliliters로 조정합니다.25 mL의 Resus suspension Buffer로 평형화시킨 PD 10 겔 여과 컬럼을 이용해 버퍼 교환을 수행하여 황산암모늄을 제거합니다. 2.5 mL의 DPS 샘플을 PD 10 컬럼 상단에 도포하여 흡수시킨 후, 통과액(flow through)은 버립니다. 3.5 mL의 Resus suspension buffer로 용리하여 DPS를 수집한 후 원심분리합니다.4°C에서 16,000 g로 10분 동안 원심분리하여 샘플의 버퍼를 교체합니다. 불용성 성분을 제거하기 위해, DPS에 적합할 만큼 염 농도가 낮아지도록 샘플을 6~10 mL의 희석 버퍼로 희석합니다. SP SPHEROS 컬럼에 결합시키기 위해, SP 버퍼로 평형화된 30 mL SP spheros fast flow 컬럼에 샘플을 로딩합니다.OD 280 수치가 기저선으로 돌아올 때까지 SP buffer A로 세척하고 통과액은 버립니다. 2 mL씩 분획을 수집하면서 0%에서 100% buffer B까지 150 mL 선형 기울기를 수행합니다. DPS는 약 50%B에서 날카로운 피크 형태로 용출되나, 10% 정도의 편차가 있을 수 있습니다.OD 260 대 OD 280 비율을 측정하여 용출 분획의 DNA 오염 여부를 확인합니다. 분광광도계를 사용했을 때, 용출 분획을 15% SDS-PAGE 겔로 전기영동하면 이 비율은 통상적으로 0.7 정도여야 합니다. 겔상에는 약 19 kilodaltons 위치에서 단 하나의 밴드만 나타나야 합니다.정제된 DPS 분획물을 농축하고 보관 버퍼로 교체한 후 하나로 모읍니다. 원심분리 필터 유닛을 사용하여 정제된 DPS를 소분하고, 액체 질소에서 급속 냉동하여 -80 °C에서 보관합니다. 유전적 보호 분석(genetic protection assay)은 여러 가지 시약과 복잡한 병원체 체계로 구성됩니다.재현성을 위해서는 세심한 시약 준비와 정확한 타이밍이 절대적으로 필요합니다. 이 과정 동안 단계와 부피를 추적하기 위해 피펫팅 테이블을 사용하는 것이 권장됩니다. 용액에서 산소를 제거하기 위해 밀폐 바이알에 물 30 milliliters를 측정하여 넣으십시오.두 개의 주사기 바늘(하나는 액체 내부에, 하나는 액체 상단에 위치)을 사용하여 10분 동안 질소로 물을 퍼지합니다. 물에 ferrous sulfate hepta hydrate 0.0168 g을 첨가하여 2 mM 스톡 용액을 제조합니다. 바이알을 밀봉하고 5분 더 질소로 퍼지합니다.그런 다음 혼합합니다. 용액은 투명해야 하며, 노란색 기운이 조금이라도 보이면 철 용액을 새로 준비하십시오. 100 millimolar 과산화수소 용액을 조제하여 얼음 위에 보관하고, 자연 분해될 수 있으므로 빛을 차단하십시오.이 과산화수소 용액은 제조 후 약 1~2시간 이내에만 사용하십시오. 정제된 DPS를 상온의 워터배스에서 빠르게 처리한 후, 원심분리 후 응집물을 침전시키기 위해 탁상용 피코 원심분리기를 사용하여 4,000 GS에서 10초 동안 얼음 위에서 원심분리하십시오. 분광광도계를 사용하여 농도를 측정하십시오. 그다음 12 x 반응 버퍼를 사용하여 고농도 스톡의 선형 DNA를 희석하여 100 ng/µL의 농도로 맞추고, 최종 반응 부피가 12 µL가 되도록 PCR 튜브에 적당량의 물을 피펫팅하십시오.다음으로, 최종 DPS 농도가 3 µM이 되도록 DNA와 DPS를 혼합하여 스톡 샘플을 제조한 후, DNA-DPS 혼합물을 PCR 튜브에 피펫으로 분주합니다. 대조군 튜브에는 DNA만 넣습니다. DPS가 DNA에 결합할 수 있도록 상온에서 15분 동안 배양합니다. 원하는 농도가 되도록 2 mM 황산제일철 용액을 충분히 첨가한 후, 최종 농도가 10 mM이 되도록 100 mM 과산화수소 용액 1 µL를 빠르게 추가하고 상온에서 5분 동안 배양합니다.Fenton 매개 분해 반응이 일어날 수 있도록 20% SDS 혼합물 1 µL를 첨가하고 85 °C에서 5분 동안 배양하여 D-P-S-D-N-A 복합체를 해체합니다. SDS는 DPS DNA 복합체를 불안정하게 만들어 DNA의 원치 않는 젤 이동(gel shift)을 방지하며, 이를 통해 정량 분석의 용이성을 높입니다. 이제 얼음 위에서 1분 동안 배양한 후, 로딩 염료를 첨가하고 아가로스 젤에 로딩하여 전기영동을 수행하며, DNA 염색을 위한 etbrum bromide 처리는 전기영동 전이 아닌 전기영동 후에 실시합니다. 이는 SDS가 젤 내 etbrum bromide의 분포를 방해하는 것을 방지하기 위함입니다.SDS page로 분석한 DPS 정제의 중간 단계가 여기에 제시되어 있습니다. 1번 레인은 세포 무함유 추출물입니다. 2번 레인은 DEAE SPHEROS 컬럼의 통과액(flow through)입니다.3번 레인은 DEAE 컬럼의 EIT입니다. 4번 레인은 60% 황산 암모늄 침전의 상층액입니다. 5번 레인은 90% 황산 암모늄 침전 및 PD 10 컬럼을 이용한 완충액 교환 후의 DPS 샘플입니다.그리고 6번 레인은 SP spheros 컬럼 단백질 정제 후 수집한 DPS 순수 분획물들이 섞인 것입니다. 7번 레인에는 분자량 마커가 표시되어 있습니다.각 레인 하단의 백분율은 이미지 정량 분석 소프트웨어로 결정한 DPS 순도를 나타냅니다. 여기서 제시된 DPS 정제 과정은 재현성이 매우 높으며, 단백질 순도는 일관되게 99% 이상으로 나타납니다. SDS page 겔 상에서 가시적인 밴드로 나타나는 다른 단백질은 관찰되지 않습니다. 정제된 DPS는 DNA 보호 분석(DNA protection assay)에 사용할 수 있으며, 이 분석에서는 철이 펜톤 반응(Fenton chemistry)을 통해 과산화수소 분해를 촉매하여 반응액 내의 DNA에 직접적인 손상을 주는 라디칼 종을 생성합니다. 대표적인 결과가 이 그림에 제시되어 있습니다.모든 레인에는 100 nanograms의 5 kilobase 선형 DNA가 포함되어 있으며, 레인 1은 DNA만, 레인 2는 DNA와 1 millimolar 과산화수소, 레인 3은 DNA와 1 millimolar 과산화수소 및 166 micromolar 황산철을 포함하고 있습니다. 하지만 DNA가 분해되었습니다. 레인 4에서 8까지는 DNA와 3 micromolar DPSD dimer, 1 millimolar 과산화수소, 그리고 왼쪽에서 오른쪽으로 갈수록 증가하는 농도의 철을 포함하고 있습니다.DPS가 산화적 분해로부터 DNA 보호를 매개한다는 점은 3번 레인과 5번 레인의 비교를 통해 분명하게 나타납니다. 철 농도가 증가함에 따라 전반적으로 DNA 분해가 증가하는 것 또한 뚜렷하게 보입니다. DNA 보호 분석을 통해 얻은 결과는 image quant와 같은 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 정량화할 수 있습니다.이 그래프는 세 번의 분석을 통해 평균을 낸 정량 결과입니다. 오차 막대는 전반적으로 높은 수준의 재현성이 확보되었음을 나타냅니다. 일단 숙련되면.이 기술은 최대 40개의 샘플에 대해 약 4시간 만에 수행할 수 있어, 다양한 조건을 병렬로 특성화할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 시약을 정확하게 준비하고 각 단계를 가능한 한 정밀하게 시간을 맞추어 진행하는 것이 중요합니다. 이 분석법은 배양 시간에 매우 민감하기 때문입니다. 이 영상을 시청하고 나면, 고순도의 DPS 단백질을 생산하고 in vitro 분석을 통해 이를 특성화하여 활성 산소종에 의한 DNA 분해를 보호하는 능력을 결정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

application-an-vitro-dna-protection-assay-to-visualize-stress

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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간단 하 고 빠른, 양적 분석 결과에 플라스 미드 DNA-단백질 Crosslinks의 측정 수리에 포유류 세포로 페

여기서, 우리는 선충 C. 예쁜꼬마선충에서 세포 단백질 독성 스트레스 반응을 형광 전사 기의 활성화를 측정하고 생리적 스트레스에 대한 감수성을 측정하여 특성화한다.

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의 적용

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