높은 처리량 마이크로 분석 실험을 사용하여 워터스, 토양 및 퇴적물에있는 미생물 세포 외 효소 활성의 결정

다음 절차의 전반적인 목표는 다양한 자연 환경에서 미생물의 세포외 효소 활성을 빠르게 분석하는 것입니다. 이는 수분 또는 토양 슬러리 샘플을 마이크로플레이트에 첨가하여 적절한 반복 수를 확보함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 인공 발색 또는 형광 기질을 마이크로플레이트 웰에 첨가하여 효소 반응이 일어나도록 합니다. 다음으로, 반응 동안 방출된 최종 생성물의 양을 결정하기 위해 흡광도 또는 형광을 측정합니다.

결과는 최종 반응의 흡광도 또는 형광도를 바탕으로 시료 간의 세포 외 효소 활성 차이를 보여줍니다. 오늘은 자연 환경에서 세포 외 효소 활성을 측정하는 방법을 시연하겠습니다. 이 방법은 토양, 퇴적물 및 수중 환경에서의 유기물 처리 속도와 영양분 무기화와 같은 미생물 생태학의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 사용하는 사람들은 특히 많은 수의 시료를 분석할 때 반응 용액에서 입자를 분리하는 데 어려움을 겪습니다.

플레이트 배치를 익히는 것이 어려울 수 있고, 여러 시간 단계에서 측정값을 얻는 과정이 까다로울 수 있으므로 이 절차에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 토양 및 퇴적물의 세포 외 효소 활성에 대한 측정 분석은 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 기질 완충액과 표준 용액을 준비하는 것으로 시작합니다. 분석할 각 시료를 멸균된 15 milliliter 원심 분리 튜브에 넣고 슬러리를 준비하십시오. 퇴적물의 경우 50 millimolar 아세테이트 완충액을 사용하여 약 1 g/mL 농도로 첨가합니다.

슬러리를 쉽게 파이펫팅할 수 있을 만큼 충분한 양의 아세테이트 완충액을 추가합니다. 필요한 슬러리의 정확한 부피는 분석하는 효소의 수에 따라 다르지만, 최소 5 mL 이상을 권장합니다. 토양이나 침전물 덩어리가 모두 분산될 때까지 각 슬러리를 볼텍싱합니다.

그리고 최종 부피를 확인하십시오. 피펫팅을 하기 전에 가위로 피펫 팁의 끝부분을 자르십시오. 토양 슬러리는 팁을 막는 경향이 있으므로, 각 슬러리를 다시 볼텍싱(vortex)한 후 즉시 150 µL씩 6개의 웰에 각각 피펫팅하십시오.

96-웰 딥웰 블록에서 진행합니다. 충분하고 빈번하게 볼텍싱하는 것이 중요합니다. 토양 입자가 부유 상태를 유지하도록 하기 위해, 블록당 최소 2개의 웰을 비워 기질 대조군으로 사용하십시오.

분석할 각 효소에 대해 96-웰 블록 1개를 준비합니다. 피펫 리저버에 아세테이트 버퍼 약 5mL를 붓고, 8채널 피펫을 사용하여 각 시료의 마지막 두 웰에 버퍼 150µL를 추가합니다.

샘플 버퍼 대조군과 두 개의 기질 대조군 웰에 처리합니다. 적절한 p-nitrophenyl Phosphate(PNP) 기질 용액 약 10 milliliters를 피펫 리저버에 붓고, 8채널 피펫을 사용하여 각 샘플의 처음 4개 웰과 두 개의 기질 대조군 웰에 기질 용액 150 microliters를 첨가합니다. 기질 용액을 첨가하는 즉시 반응이 시작되는 시간을 기록하십시오.

플레이트를 실온에서 0.5~4시간 동안 배양합니다. 정확한 배양 시간은 시료의 활성 수준과 분석할 효소에 따라 달라집니다. 분석물을 배양하는 동안 투명한 96-웰 마이크로플레이트 하나를 준비합니다.

흡광도를 측정하기 위해, 각 딥웰 블록의 마이크로플레이트 웰에 증류수 190 µL와 1 M 수산화나트륨 10 µL를 피펫으로 분주합니다. 수산화나트륨은 효소 반응을 늦추고 pH를 높여, 배양 후 반응 과정에서 방출된 PNP의 색상을 강화합니다. 96웰 블록을 2000~5,000 ×g에서 5분 동안 원심분리하여 토양 입자를 침전시킵니다.

펠렛을 건드리지 않고 액체만 제거하는 것은 까다로울 수 있습니다. 처음부터 토양 샘플을 너무 많이 사용하는 것을 피해야 합니다. 충분한 시간 동안 원심분리를 수행하고, 액체를 흡입할 때 신중하면서도 과감한 동작으로 조작하십시오.

멀티채널 파이펫을 사용하여 펠렛이 섞이지 않도록 주의하며 각 웰에서 100 µL를 취합니다. 이 액체를 준비된 투명 96 웰 마이크로플레이트의 해당 웰로 옮깁니다. 마이크로플레이트 리더기를 켜고 필요한 소프트웨어를 설정합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 샘플의 건조 중량을 측정한 후, 410 nm에서 흡광도를 기록합니다. 샘플 분석 흡광도에서 샘플 대조군 흡광도를 빼서 각 샘플의 최종 흡광도를 계산합니다.

기질 대조군의 흡광도가 0.060보다 높을 경우, 해당 값을 차감하십시오. 또한 다음 식을 사용하여 건조 중량 1g당 시간당 마이크로몰 단위로 효소 활성을 계산하십시오. 텍스트 프로토콜에 제시된 예시를 따라 각 효소에 대해 블랙 마이크로플레이트를 구성한 후, 첫 번째 수질 시료 약 5mL를 피펫 저장조에 붓고 8채널 피펫을 사용하여 모든 웰에 200µL씩 분주하십시오.

마이크로플레이트의 첫 번째 열에 사용한 피펫 팁을 버리고, 1열부터 9열까지 채울 때까지 각 수질 샘플에 대해 필요한 만큼 이 과정을 반복합니다. 샘플, 표준물질, 기질 및 퀀칭(quenching)을 고려한 대조군을 샘플이 담긴 동일한 검은색 마이크로플레이트에 설정합니다. 샘플 대조군은 샘플 수와 중탄산염 완충액을 포함하며, 활성 계산에는 사용되지 않지만 실험 과정 전반에 걸쳐 측정값의 일관성을 입증하는 데 사용됩니다.

소광 대조군은 시료수와 표준량의 형광 태그로 구성되며, 형광의 회절을 측정하는 데 사용됩니다. 시료수 기질 및 표준 대조군은 각각 기질 결합 형광 태그 또는 표준 형광 태그와 중탄산염 완충액으로 조제합니다. 깨끗한 피펫 리저버에 5 mM 중탄산염 완충액 약 5 mL를 붓습니다.

d행과 e행의 1번부터 9번 마이크로플레이트 웰에 완충액 50 µL씩을 분주하여 샘플당 두 개의 반복 대조군 웰을 생성합니다. 피펫 팁을 교체한 후, A행과 H행의 10번부터 12번 웰에 중탄산염 완충액 200 µL를 옮깁니다. 촬영 목적으로 본 시연에서는 조명을 밝게 유지하고 있으나, 형광 표준 물질은 빛에 민감하므로 조명을 낮추거나 꺼서 주변 조도를 줄여야 합니다. 깨끗한 피펫 리저버에 약 5 mL의 10 µM 4-methylumbelliferone(MUB)을 붓고, H행의 1번부터 12번 마이크로플레이트 웰에 50 µL씩 분주합니다. 그런 다음 G행과 F행의 1번부터 9번 웰에 50 µL씩 분주하여 샘플당 세 개의 반복 퀀칭(quench) 대조군과 전체 표준 대조군을 생성합니다. MUB의 빛에 의한 분해를 줄이기 위해 마이크로플레이트를 어두운 곳에 두거나 불투명한 덮개로 덮고, 형구광계를 켜고 기질을 첨가하기 전 판독 준비가 되도록 필요한 소프트웨어를 설정합니다.

깨끗한 피펫 리저버에 적절한 MUB 코팅 기질 약 5 mL를 넣고, 12채널 피펫을 사용하여 A행의 1번부터 12번 웰과 B행 및 C행의 1번부터 9번 웰에 50 µL씩 분주하여 각 샘플당 3개의 반복 시험군과 3개의 기질 대조군을 형성한 후 즉시 형광을 측정하십시오. 기질을 마이크로플레이트에 첨가한 직후 초기 형광을 측정합니다. 형광 측정 후 마이크로플레이트를 암실 보관하거나 불투명한 덮개로 덮어 실온에서 배양하십시오.

MUB의 광분해를 줄이기 위해서입니다. 최대 잠재 효소 활성을 측정하는 데 필요한 배양 시간은 시료 내의 효소 농도에 따라 달라집니다. 이는 알려지지 않았으므로, 시료를 분석하기 전에 마이크로플레이트를 여러 시간 단계로 읽어야 합니다.

대부분의 효소의 경우, 1시간 동안 10~15분 간격으로 측정하는 것이 적절하나, 농도가 높은 일부 샘플은 10분 이전에 정점에 도달할 수 있습니다. 지정된 간격으로 최소 1시간 동안 마이크로플레이트의 형광을 계속 측정하십시오. 측정 사이에는 마이크로플레이트를 덮어두거나 어두운 곳에 보관해야 합니다.

각 시간 간격의 각 샘플에 대해, 해당 시간 간격의 평균 초기 샘플 형광, 평균 최종 샘플 형광, 평균 표준 형광 및 평균 소광 대조군 형광을 계산하십시오. 텍스트 프로토콜에 제시된 식을 사용하여 mL당 시간당 m 단위로 효소 활성을 계산하십시오.

각 시간 단계에 대해 계산된 활성 값을 검토하고, 활성이 가장 높은 시간 단계의 값으로부터 최종 잠재 활성을 결정하십시오. 활성 값이 계속 증가한다면, 더 이후의 시간 단계가 필요할 수 있습니다. 실행 과정 전반에 걸쳐 활성 값이 감소한다면, 시간 단계를 더 짧게 설정하여 다시 실행하십시오.

토양과 수생 퇴적물은 일반적으로 입자 표면에서 성장하는 부착 미생물 군집으로 인해 상당한 수준의 세포 외 효소 활성을 나타냅니다. 이 그림은 미국 미시시피 북부의 3차 하천 표층 퇴적물에서 얻은 입자의 크기에 따라 이러한 활성이 어떻게 변화하는지를 보여줍니다. 이전 연구에 따르면, 이 하천의 퇴적물 입자에 존재하는 박테리아 군집은 군집 구조의 분자 분석을 통해 세 개의 뚜렷한 그룹으로 구분될 수 있음이 밝혀졌습니다.

0.063 mm 입자, 0.125, 0.25 및 0.5 mm 입자, 그리고 1 mm 입자에 부착된 것들입니다. 세포외 효소 활성 패턴 분석은 이 결론을 뒷받침하는데, PNP 연결 기질 기술을 사용하여 측정했을 때 phosphatase는 0.125, 0.25 및 0.5 mm 입자에서 비슷하게 나타났으나, 1 mm 및 0.063 mm 분획에서 훨씬 더 높게 나타났습니다. beta glucco 및 n AGAs와 같은 다른 효소들은 가장 미세한 입자에서 유사한 정점을 보였으나, 1 mm 입자에서는 증가하지 않았습니다.

서로 다른 효소들이 서로 다른 환경적 분포를 보일 수 있으며, 본 분석법을 통해 이를 규명할 수 있다는 점을 강조합니다. 상대적으로 낮은 오차 막대는 퇴적물 내 효소 활성의 화학 분석법이 재현 가능하며, 따라서 통계적 분석에 적합함을 보여줍니다. 서로 다른 환경 시료를 비교했을 때, 자연수는 일반적으로 토양이나 퇴적물의 g당 활성보다 mL당 세포 외 효소 활성이 낮은 경향이 있습니다.

따라서 이들은 MUB 결합 기질을 사용하여 형광 측정법으로 분석되어야 합니다. 이 그림은 phosphatase, beta-glucco 및 NGA 효소의 활성이 깊이에 따라 어떻게 변하는지를 보여줍니다. 미국 미시시피 북부의 얕은 호수는 영양분이 부족한 것으로 알려져 있으며, 이는 유기 화합물로부터 인산을 획득하기 위해 미생물이 생성하는 phosphatase 및 효소의 활성이 상대적으로 높다는 점에서도 시사됩니다.

세 가지 효소 모두에 대해, 수면과 50cm 깊이에서 채취한 분석 시료는 유사한 활성을 보였습니다. 반면 100cm 시료에서는 활성이 높게 나타났는데, 해당 시료는 기본적으로 수층-퇴적물 경계면에서 채취되었으며 시료 내 퇴적물 입자의 존재가 특히 beta glucco 및 n AGAs에서 관찰된 더 높은 활성의 원인일 가능성이 큽니다. PNP 기질과 마찬가지로, 오차 막대가 낮다는 것은 단 3회의 반복 측정만으로도 MUB 기질을 이용한 형광 분석의 재현성이 높다는 것을 보여줍니다.

수중 시료의 효소 활성 단위는 소비된 기질의 nmol인 반면, 퇴적물 입자의 효소 활성 단위는 단위 크기당 수치가 비슷함에도 불구하고 소비된 기질의 µmol 단위라는 점에 유의하십시오. 이는 토양과 퇴적물이 자연수보다 세포 외 활성이 훨씬 높은 경향이 있다는 사실을 강조합니다. 또한, 이는 MUB 결합 기질 기법의 향상된 민감도를 입증하며, 숙련된 이후에는 수중 시료의 세포 외 효소 활성을 분석하기 위해 이 기법을 사용하는 것이 필수적임을 보여줍니다.

이 기술을 사용하면 한 시간 남짓한 시간 내에 최대 9개의 수질 시료에 대한 효소 활성을 분석할 수 있습니다. 토양 및 퇴적물을 대상으로 이 절차를 수행할 때는 활성도를 건조 중량 기준으로 표현할 수 있도록 이미 알고 있는 질량의 재료를 사용하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청하고 나면, 비색법(colorimetric) 또는 형광법(fluorometric) 기술을 사용하여 다양한 자연 환경에서 세포 외 효소 활성을 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.