높은 처리량 마이크로 분석 실험을 사용하여 워터스, 토양 및 퇴적물에있는 미생물 세포 외 효소 활성의 결정

다음 절차의 전반적인 목표는 다양한 자연 환경에서 미생물 세포 외 효소 활성을 신속하게 분석하는 것입니다. 이는 물 또는 토양 슬러리 샘플을 마이크로플레이트에 추가하여 적절한 복제를 생성함으로써 달성됩니다: 두 번째 단계로, 인공 발색 또는 형광 미터법 기판을 마이크로플레이트 웰에 추가하여 효소 반응이 일어날 수 있도록 합니다. 다음으로, 반응 중에 방출되는 최종 산물의 양을 결정하기 위해 흡광도 또는 형광을 측정합니다.

결과는 최종 반응의 흡수 또는 형광에 따라 샘플 간의 세포 외 효소 활성의 차이를 보여줍니다. 오늘은 자연 환경에서 세포외 효소 활성을 측정하는 방법을 소개해 보려고 합니다. 이 방법은 유기물 처리의 물 속도 및 토양, 퇴적물 및 물에서의 영양 광물화와 같은 미생물 생태학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다 일반적으로 이 방법을 처음 사용하는 개인은 특히 많은 수의 샘플을 분석할 때 반응 용액에서 입자를 분리하는 데 어려움이 있기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.

플레이트 레이아웃은 배우기 어려울 수 있고 여러 시간 단계에서 측정을 수행하면 이 절차가 더 어려워질 수 있으므로 이 절차를 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다. 토양 및 퇴적물에 대한 세포 외 효소 활성에 대한 콜촐 메트릭 분석은 토양에 대한 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 기질 완충액 및 표준 용액을 준비하는 것으로 시작하며, 멸균 15ml 원심분리기 튜브에서 분석할 각 샘플의 슬러리를 준비합니다. 침전물에 대해 50 밀리몰 아세테이트 완충액을 사용하여 밀리리터당 약 1g의 농도를 추가합니다.

슬러리를 쉽게 파이프로 만들 수 있도록 충분한 아세테이트 버퍼를 추가하십시오. 필요한 슬러리의 정확한 양은 분석된 효소의 수에 따라 다르지만 최소 5밀리리터가 권장됩니다. 토양이나 퇴적물의 모든 덩어리가 흩어질 때까지 각 슬러리를 소용돌이

그리고 마지막 권에 주목하십시오. 피펫팅하기 전에 피펫 팁의 끝을 가위로 자릅니다. 토양 슬러리가 팁을 막는 경향이 있으므로 각 슬러리를 다시 와류로 만들고 즉시 150마이크로리터를 6개의 우물 각각에 피펫으로 주입합니다.

96 웰 딥 웰 블록에서. 철저하고 자주 소용돌이치는 것이 중요합니다. 토양 입자를 현탁액으로 유지하려면 블록당 최소 두 개의 우물을 비워 두어 기질 제어 역할을 합니다.

1 96을 준비합니다. 분석실험일 것이다 각 효소를 위한 좋은 구획. 약 5ml의 아세테이트 완충액을 피펫 저장통에 붓고 8채널 피펫터를 사용하여 150마이크로리터의 완충액을 각 샘플의 마지막 두 웰에 추가합니다.

샘플 버퍼 제어 및 두 개의 기질 제어 웰용. 약 10ml의 적절한 p 니트로 회향 또는 PNP 기질 용액을 피펫 저장통에 붓고 8채널 피펫터를 사용하여 150마이크로리터의 기질 용액을 각 샘플의 처음 4개 well과 2개의 기질 제어 well에 추가합니다. 기질 용액이 추가되자마자 반응이 시작되는 시간을 주목하십시오.

플레이트를 실온에서 0.5-4시간 동안 배양합니다. 정확한 배양 시간은 샘플의 활성 수준과 분석할 효소에 따라 달라집니다. 분석이 배양되는 동안 투명한 96웰 마이크로플레이트 1개를 준비합니다.

흡광도 피펫을 판독하기 위해 각 딥 웰 블록에 대해 190마이크로리터의 증류수와 10마이크로리터의 수산화나트륨을 마이크로플레이트의 각 웰로 넣습니다. 수산화나트륨은 효소 반응을 늦추고 pH를 높여 배양 후 반응 중에 방출되는 PNP의 색상을 향상시킵니다. 2000년에서 5, 5 분 동안 000배 G에 96의 우물 구획을 펠릿 토양 입자를 펠릿으로 만들기 위하여 원심 분리하십시오.

펠릿을 방해하지 않고 액체를 제거하는 것은 어려울 수 있습니다. 처음에는 너무 많은 토양 샘플을 사용하지 않아야 합니다. 충분히 오랫동안 원심분리를 하고 조심스럽지만 자신감 있는 동작으로 액체를 빼내십시오.

멀티채널 피펫을 사용하여 각각에서 100마이크로리터를 추출합니다. 글쎄, 펠릿을 피하도록주의하십시오. 준비된 투명 96웰 마이크로플레이트의 해당 웰로 액체를 옮기고, 마이크로플레이트 리더를 켜고, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 샘플의 건조 질량을 측정한 후 필요한 소프트웨어 기록 흡광도를 410나노미터로 설정하고, 샘플 분석 흡광도에서 샘플 제어 흡광도를 빼서 각 샘플의 최종 흡광도를 계산합니다.

기판 제어의 높은 흡광도가 0.060보다 크면 해당 값을 뺍니다. 또한 이 방정식을 사용하여 건조 질량 그램당 시간당 마이크로몰 단위의 효소 활성을 계산하십시오. 텍스트 프로토콜에 표시된 예에 따라 각 효소에 대해 검은색 마이크로플레이트를 구성한 후 첫 번째 물 샘플의 약 5ml를 피펫 저장소에 붓고 8채널 피펫터를 사용하여 모든 웰에 200마이크로리터를 피펫팅합니다.

Microplate 중 1열에서 사용한 피펫 팁을 버리고 각 물 샘플에 대해 필요에 따라 반복하여 1열에서 9열까지 채웁니다. 샘플, 표준물질, 기질 및 담금질을 샘플과 동일한 검은색 마이크로플레이트에서 설명하도록 제어를 설정합니다. Sample Control에는 샘플 물과 중탄산염 버퍼가 포함되어 있으며 활성 계산에 사용되지 않지만 실험 과정 전반에 걸쳐 판독 일관성을 보여줍니다.

담금질 제어는 시료 물과 표준량의 형광 태그로 구성되며 형광의 회절을 측정하는 데 사용됩니다. 시료 물에서 기질 및 표준 대조군은 각각 기질 연결 또는 표준 형광 태그와 중탄산염 완충액으로 구성됩니다. 약 5 밀리리터의 5 밀리몰 중탄산염 완충액을 깨끗한 피펫 용기에 붓습니다.

50 마이크로 리터의 완충액을 1 열에서 9 열까지의 d와 e로 피펫하여 2 개를 형성하고, 샘플 교환 피펫 팁 당 샘플 컨트롤의 웰을 복제 한 다음 200 마이크로 리터의 중탄산염 버퍼를 A 및 H 열의 10-12 열로 옮깁니다. 주변 조명은 형광등 표준이 빛에 민감하므로 조명을 어둡게 하거나 꺼서 줄여야 합니다. 약 5 밀리리터의 10 마이크로 몰, 4 개의 메틸 몬 또는 MUB를 깨끗한 피펫 저장소에, 50 마이크로 리터를 마이크로 플레이트 웰 1-12 열 H에 붓고, 그런 다음 50 마이크로 리터를 G 및 F 열의 웰 1-9에 피펫으로 주입하여 샘플 당 담금질 제어 및 전체 표준 대조군의 3 가지 복제를 형성합니다. 마이크로 플레이트를 어두운 곳에 두거나 불투명 한 뚜껑으로 덮어 MUB의 광 저하를 줄이고 형광 측정기를 켜고 기판을 추가하기 전에 읽을 수 있도록 필요한 소프트웨어를 설정하십시오.

약 5밀리리터의 적절한 MUB 라이닝 기질을 깨끗한 피펫 저장소에 넣기 위해 12채널 피펫을 사용하여 50마이크로리터를 A열의 마이크로플레이트 웰 1에서 12까지와 B열과 C열의 웰 1부터 9열에 피펫팅하여 3개를 형성하고 각 샘플에 대한 복제 분석과 3개의 기질 대조군은 즉시 형광 기록을 진행합니다. 판독 후 microplate에 기판을 추가한 직후의 초기 형광을 판독합니다. 형광은 실온에서 어두운 곳이나 불투명한 뚜껑으로 덮인 마이크로플레이트를 배양합니다.

MUB의 빛 열화를 줄입니다. 최대 잠재적 효소 활성을 측정하는 데 필요한 배양 시간은 샘플 내 효소 농도에 따라 달라집니다. 이는 알 수 없기 때문에 샘플을 분석하기 전에 마이크로플레이트를 여러 번 측정해야 합니다.

대부분의 효소의 경우 한 시간에 걸쳐 10-15분 간격이 적절하지만 농도가 높은 일부 샘플은 10분 전에 최고조에 달합니다. 최소 한 시간 동안 지정된 간격으로 마이크로플레이트의 형광을 계속 읽습니다. 판독 사이에 마이크로플레이트를 덮거나 어두운 곳에 두십시오.

각 시간 간격에서 각 샘플에 대해 각 시간 간격에 대한 평균 초기 샘플 형광, 평균 최종 샘플 형광, 평균 표준 형광 및 평균 담금질 제어 형광을 계산합니다. 효소 활성을 밀리리터당 시간당 m 단위로 계산합니다. 텍스트 프로토콜에 있는 방정식을 사용합니다.

각 시간 단계에 대해 계산된 활동 값을 검사하고, 활동이 가장 높은 시간 단계에서 최종 잠재적 활동을 결정합니다. 활동 값이 계속 증가하면 나중에 시간 단계가 필요할 수 있습니다. 실행 과정 전체에서 활동 값이 떨어지면 더 짧은 시간 단계로 다시 실행합니다.

토양과 수생 퇴적물은 일반적으로 입자 표면에서 자라는 부착 된 미생물 군집의 결과로 상당한 수준의 세포 외 효소 활성을 가지고 있습니다. 이 그림은 미시시피 북부에 있는 3차 하천의 표면 퇴적물에서 얻은 입자의 크기에 따라 이 활동이 어떻게 변하는지 보여줍니다. USAA의 이전 연구는 이 하천의 퇴적물 입자에 있는 박테리아 군집이 군집 구조의 분자 분석을 기반으로 세 가지 별개의 그룹으로 분리될 수 있음을 보여주었습니다.

0.063mm 입자, 0.1, 2, 5, 0, 0.25, 0.5mm 입자, 1mm 입자에 있는 것. 세포외 효소 활성의 패턴을 분석한 결과, 인산가수분해효소는 0.1, 2, 5, 0, 0.25 및 0.5mm 입자에서 유사하지만 PNP 연결 기질 기법을 사용하여 측정했을 때 1mm 및 0.063mm 입자에서 훨씬 더 높다는 결론을 뒷받침합니다. 베타 글루코 및 n AGA와 같은 다른 효소는 가장 미세한 입자에서 유사한 피크를 보이지만 1mm 입자에서는 상승하지 않습니다.

서로 다른 효소가 서로 다른 환경 분포를 나타낼 수 있다는 사실을 강조하며, 이러한 분포는 이 분석을 사용하여 설명할 수 있습니다. 상대적으로 낮은 오차 막대는 퇴적물에서의 효소 활성에 대한 콜레 메트릭 분석이 재현 가능하여 통계적 분석에 적합하다는 것을 보여줍니다. 다양한 샘플과 환경 샘플을 비교할 때 자연수는 토양이나 퇴적물이 그램당 하는 것보다 밀리리터당 세포 외 효소 활성이 더 낮은 경향이 있습니다.

따라서 MUB 연결 기질을 사용하여 세균총을 미터법으로 분석해야 합니다. 이 그림은 효소, 인산가수분해효소, 베타, 글루코 및 NGA의 활성이 깊이에 따라 어떻게 변하는지 보여줍니다. 미국 미시시피 주 북부의 얕은 호수에 있는 이 호수는 영양이 부족한 것으로 알려져 있는데, 이는 미생물이 유기 화합물에서 인산염을 얻기 위해 생산하는 인산가수분해효소와 효소의 활성이 상대적으로 높기 때문이

세 가지 효소 모두에 대해 수면과 50cm 깊이에서 수집된 분석 샘플은 유사한 활성을 보여주었습니다. 100cm 샘플에서 활성이 증가한 반면, 샘플은 본질적으로 물 퇴적물 계면에서 채취되었으며 샘플에 퇴적물 입자의 존재는 특히 베타 글루코 및 n AGA에서 볼 수 있는 더 높은 활성을 설명할 수 있습니다. PNP 기질과 마찬가지로 낮은 오류 막대는 단 3회의 반복 판독값으로도 MUB 기질을 사용한 형광 측정 분석의 재현성이 높다는 것을 보여줍니다.

물 샘플 효소 활성에 대한 단위는 소비된 기질의 내부인 반면, 퇴적물 입자에 대한 효소 활성에 대한 단위는 단위 크기당 크기가 비슷하더라도 소비된 기질의 마이크로몰 단위입니다. 이것은 토양과 퇴적물이 자연수보다 훨씬 더 높은 세포 외 활동을 하는 경향이 있다는 사실을 강조합니다. 또한 MUB 연결 기질 기술의 감도 증가와 물 샘플에서 세포 외 효소 활성을 분석하기 위해 이 기술을 사용해야 할 필요성을 보여줍니다.

이 기술은 토양과 퇴적물에 대해 이 절차를 시도하는 동안 단 한 시간 남짓 만에 최대 효소에 대한 9개의 물 샘플을 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 건조 중량 기준으로 활성을 표현할 수 있도록 알려진 거대한 물질을 사용하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 색상 메트릭 또는 더 낮은 메트릭 기술을 사용하여 세포 외 효소 활동과 다양한 자연 환경을 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.