Name: 높은 처리량 마이크로 분석 실험을 사용하여 워터스, 토양 및 퇴적물에있는 미생물 세포 외 효소 활성의 결정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-01T09:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 23 s
Description: 배우세요 높은 처리량 마이크로플레이트 분석법을 사용하여 물, 토양, 퇴적물에서 미생물 세포 외 효소 활성을 측정하는 방법입니다. 이 기술은 미생물 생태학 연구에서 유기물 분해 속도를 신속하게 평가하는 데 활용됩니다.

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이 작품의 측면에 대한 자금 조달은 미국 농무부 구체적인 협력 계약 58-6408-1-595과 국립 과학 재단 (상 1049911)를 포함하여 다양한 소스에 의해 제공되었다.

토양 및 퇴적물의 세포 외 효소 활성의 비색 분석 1. 효소 활성의 비색 분석 용 기판 및 버퍼 솔루션의 제조 <ol><li> 50 ㎖의 0.1 M 아세트산 (2.87 ㎖를 500 ㎖의 물에 빙초산)를 혼합하여 50 mM의보기 아세테이트 완충액 (pH 5.0-5.5)를 준비하고, 150 ㎖의 0.1 M 아세트산 나트륨 및 200 ㎖의 증류수 H 2 O. 필요한 경우 0.1 M 아세트산으로 5.0-5.5로 산도를 조정합니다. </li><li> 증류 H 2 O. 1 M 수산화 나트륨 (NaOH를)의 용액을 준비 </li><li> 50 mM의 아세테이트 버퍼에 P는 NP-연결된 기판 솔루션을 준비합니다. 인산 가수 분해 효소는 50 mM의 아세테이트 버퍼에 5 밀리미터 P는 NP-인산염을 준비을 검정, β-글루코시다 아제가 5 밀리미터 P는 NP-β-글루 코피 라노를 준비 분석 실험하기 위해, 나가세가 2 ㎜ PNP-β-N-acetylglucosaminide을 준비 분석 실험 할 수 있습니다. 멸균 15 ML 50 ML의 원심 분리기 튜브의 모든 기판 솔루션을 준비합니다. 솔루션 2 ~ 3 주 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 2. P는 NP 농도를 흡광도를 변환하는 표준의 결정 <ol><li> 50 mM의 아세테이트 버퍼에 P-니트로 페놀 표준 용액을 준비합니다. 농도는 MM의 0.025-1 다양합니다. </li><li> 분명 96 - 웰 마이크로 플레이트로 전송 각 농도 100 μL의 세 개의 반복을. 각 웰에 H 2 O를 증류수 10 ㎕의 1 M NaOH를 190 μl를 추가합니다. </li><li> 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 410 nm에서 흡광도를 기록. </li><li> 0.3로 표준 곡선에 곱하기 농도는 300 ㎕의 반응 부피 당 μmoles P는 NP를 얻을 수 있습니다. P는 NP의 μmole 대 흡광도의 곡선을 그린다. 곡선의 기울기는 각 효소 반응에서 P는 NP 건 μmole하는 흡광도 관해서 것이다 변환율 (C)로서 기능한다. </li></ol> 3. 효소 분석을 실시 <ol><li> 토양, concentr에서 멸균 15 ㎖의 원심 분리 관으로 측정 될 각 샘플의 슬러리를 조제대략 1 ㎍ / ㎖ -1 50 mM의 아세테이트 버퍼를 사용 ATION. 퇴적물의 경우, 슬러리 쉽게 pipettable 할 수있을 정도로 충분한 아세테이트 버퍼를 추가합니다. 필요한 슬러리의 정확한 양이 정량 효소의 수에 따라 달라질 수 있지만, 5 ㎖의 최소 권장합니다. 소용돌이 토양 또는 퇴적물의 모든 덩어리가 분산 최종 볼륨을주의 할 때까지 각 슬러리. </li><li> 다시 소용돌이 각 슬러리 즉시 96 웰 deepwell 블록 (그림 1)에 6 각 웰에 150 μl를 피펫. 이 현탁액에 토양 입자를 유지하기 위하여 충분히 자주 와류 중요하다. 기판의 제어 역할을하는 빈 블록 당 적어도 두 개의 우물을 남겨주세요. 참고 : 토양 슬러리는 팁을 방해하는 경향 전에 피펫을 가위로 피펫 팁의 끝을 클립. 정량 할 각 효소에 대해 하나의 96 - 웰 블록을 준비합니다. </li><li> 피펫 저수지로 아세테이트 버퍼의 약 5 ㎖를 붓고 L에 버퍼 150 μl를 추가하는 8 채널 피펫을 사용하여AST 각 샘플의 두 우물 (이 샘플 버퍼 컨트롤 예정) 및 두 기판 제어 우물 (그림 1) </li><li> 피펫 저장조에 적합한 P NP-기질 용액 약 10 ㎖를 넣고 (도 1) 각 시료의 처음 네 개의 우물과 2 개의 기판 대조군 웰에 기질 용액 150 μL를 추가 8 - 채널 피펫을 사용한다. 반응이 빨리 기질 용액을 첨가로 시작으로 시간을 참고. </li><li> 0.5-4 시간 동안 RT (22 ℃)에서 번호판을 품어. 정확한 배양 시간은 활동 샘플 수준과 정량하는 효소에 따라 달라집니다. 나가세와 다른 효소&gt; 2 시간의 배양 시간을 필요로하는 반면 대부분의 토양과 퇴적물, 인산 및 β-글루코시다는 0.5 ~ 1.5 시간의 배양 시간이 필요합니다. </li><li> 분석 흡광도를 읽을 마이크로 플레이트 분명 96 - 웰을 준비 배양하는 동안. (즉, 각 전자에 대한 각 deepwell 블록에 대해 하나의 마이크로 준비nzyme) 정량. 피펫 10 μL 1 M 수산화 나트륨과 마이크로 플레이트의 각 웰에 증류수 190 μL. 참고 : 수산화 나트륨은 효소 반응을 느리게하고, 반응시 방출되는 P는 NP의 색상을 향상시켜 pH를 발생시킵니다. </li><li> 배양 후, 토양 입자 펠렛 5 분 동안 2,000-5,000 XG에서 96 - 웰 블록을 원심 분리기. </li><li> 펠릿 않도록주의하면서, 각 우물에서 100 μl를 철회하는 멀티 채널 피펫을 사용하여 제조 된 명확한 96 - 웰 마이크로 플레이트에 잘 대응에 전송할 수 있습니다. </li><li> 마이크로 플레이트 리더를 켜고 필요한 소프트웨어를 설정합니다. 410 nm에서 흡광도를 기록. 특정 웰의 흡광도는 플레이트 리더의 선형 검출 한계 이상 물과 재 측정 랑은 잘 1:1로 희석합니다. 흡광도가 여전히 너무 높은 경우, 분석은 짧은 배양 시간에 따라 반복한다. </li></ol> 4. 샘플의 건조 질량의 결정 <ol><li> 각 SAMPL의 피펫 1 ㎖<html> preweighed 알루미늄 냄비에 전자 슬러리. </li><li> 48 시간 동안 75 ° C의 건조 오븐에서 건조하고 무게. 슬러리의 1 ㎖에 흙이나 퇴적물의 건조 질량을 얻기 위해이 값에서 팬의 무게를 뺍니다. 효소 분석에서 각 웰에 첨가 150 μL에 샘플의 건조 질량을 결정하기 위해 0.15의 계수를 곱한다. </li></ol> 5. 건조 토양의 질량 또는 침전물 당 효소 활성의 계산 <ol><li> 샘플 분석 흡광도에서 샘플 제어 흡광도를 뺀 각 샘플의 최종 흡광도를 계산합니다. 기판 컨트롤이 높은 흡광도가있는 경우 (약&gt; 0.060) 다음 또한 사람들을 뺍니다. </li><li> μmoles 인사 -1 들어 건조 질량 -1 방정식에서의 효소 활성을 계산합니다 : </li></ol> 효소 활성 = 최종 흡광도 / (C의 X 배양 시간의 X 샘플 건조 질량) 자연수의 세포 외 효소 활성의 형광 분석 효소 활성의 형광 측정 분석을위한 TLE &quot;&gt; 1. 기판, 표준의 준비, 및 버퍼 솔루션 <ol><li> 멸균에 적합한 기판을 용해하여 MUB 연결된 기판 (예를 들어 4 - MUB-β-글루 코피 라노, 4 MUB - 인산, 4 MUB-N-아세틸-β-D-glucosaminide) 200 μM 솔루션을 준비합니다 (오토 클레이브) 증류수 멸균 15 ML 50 ML의 원심 분리기 튜브의 H 2 O. 빛을 제외하고 사용하기 전에 냉장고에 저장하는 알루미늄 호일에 튜브를 감싸십시오. 이러한 방식에서 저장하는 경우 기판은 적어도 1 주 동안 안정해야한다. </li><li> 멸균 증류수 H 2 O 100 μM 4 - 메틸 움의 원액을 만들어 MUB 표준을 준비 상점은 황색 또는 호 - 병 포장에 냉장. 사용하기 직전에, 효소 분석을위한 10 μM의 작업 솔루션을 만들기 위해 멸균 H 2 O로 1 / 10로 100 μM 원액을 희석. </li><li> 탄산 수소 나트륨 &lt;8.4 g을 용해시켜 100 mM의 중탄산 완충액 원액을 준비서브&gt; 3 1 LH 2 O 및 고압 증기 멸균에. 효소 분석을위한 5 mm의 작업 솔루션을 필요에 따라 멸균 H 2 O로이 원액 1 / 20을 희석. </li></ol> 2. 96 - 웰 블랙 마이크로에 조직 물 샘플 <ol><li> 그림 2의 예를 다음 각 효소를 마이크로 플레이트를 구성합니다. 적절한 복제, 표준 및 제어를 허용,이 절차는 하나 96 - 웰 블랙 마이크로에 최대 9 개의 물 시료에 대해 하나의 효소의 활동을 분석 실험 할 수 있습니다. </li><li> 피펫 저수지에 첫 번째 샘플의 약 5 ㎖를 붓고 마이크로 (들)의 열 1의 우물 모두에 μL pipette200하는 8 채널 피펫을 사용합니다. 사용 피펫 팁을 취소하고 열 1-9을 채우기 위해 각 물 샘플에 대해 필요에 따라 반복합니다. </li></ol> 3. 샘플을 설정, 표준, 끄다, 기판 제어 <ol><li> 표준 샘플에 대한 계정 컨트롤을 설정의, 기판과 샘플과 동일한 블랙 마이크로 (그림 2)에서 담금질. </li><li> 샘플 컨트롤 샘플 물, 중탄산 버퍼를 포함하고, 액티비티 계산에 사용되지 않지만 실험 과정에 걸쳐 일관성을 읽고 설명 할 것이다. 급랭 컨트롤 샘플 물, 형광 태그의 기본 량으로 구성하고 샘플 물 형광의 회절을 측정하는 데 사용된다. 기판 및 표준 컨트롤 기판 연결 또는 표준 형광 태그, 각각 중탄산염 하나의 버퍼로 구성되어 있습니다. </li><li> 깨끗한 피펫 저수지에 5 mM의 중탄산염 버퍼의 약 5 ㎖를 붓는다. 피펫 마이크로 우물에 버퍼 50 μl의 1 행에서 9까지의 D와 E는 두 개의 샘플 당 샘플 컨트롤의 우물을 복제 형성한다. 변경 피펫 팁은 행의 (10 ~ 12) 우물에 수소 나트륨 완충액 200 μl를 전송 및 H. </li><li> 리를 흐리게하거나 해제하여 주변 조명을 감소형광 표준으로 ghts은 빛에 민감합니다. </li><li> 깨끗한 피펫 저수지에 10 μM 4 - 메틸 움의 약 5 ㎖를 붓는다. 피펫 마이크로 웰에 50 ㎕의 행 H 1부터 12까지, 그리고 우물에 행 G와 F에 1-9 샘플 당 급냉 컨트롤과 전체 표준 컨트롤의 세 개의 반복을 형성한다. 어둠 속에서 마이크로 플레이트를 배치하거나 MUB의 빛 저하를 줄이기 위해 불투명 뚜껑 커버 하나. </li><li> 형광 분석기의 전원을 켜고 설정 업 기판을 추가하기 전에 읽을 준비가되어 필요한 소프트웨어를. 참고 : 일부 형광 전구가 3 분 이상 예열 시간을 필요로 할 수있다. </li><li> 깨끗한 피펫 저수지에 해당 MUB 연결된 기판 (예를 들어, 4 - MUB - 포스페이트)의 약 5 ㎖를 붓는다. 각 샘플에 대한 세 가지 복제 분석 및 세 개의 기판 컨트롤을 형성하기 위해 1 행 B와 C에서 9까지의 1 행에 12를 통해 마이크로 우물에 50 μl를 피펫, 우물로하는 12 채널 피펫을 사용합니다. 이 immediatelY는 4.1, 기록 형광 단계로 진행합니다. </li></ol> 4. 기록 형광 <ol><li> 바로 마이크로에 기판을 첨가 한 후, 초기 형광을 읽어보십시오. 형광을 읽은 후에 하나 RT (22 ° C)에서 마이크로 플레이트를 품어 어둡거나 MUB의 빛 저하를 줄일 수있는 불투명 한 뚜껑으로 덮여있다.에게 </li><li> 물 샘플에서 최대 전위 효소 활성을 측정하는 데 필요한 배양 시간은 샘플 내의 효소 농도에 의존 할 것이다. 분석이 완료되기 전에이 불명하기 때문에, 마이크로 플레이트는 다수의 시간 단계에서 판독되어야 할 것이다. 특정 효소에 대한 매우 높은 활성을 가진 샘플을 10 분 전에 피크 수 있지만 일반적으로 1 시간에 걸쳐 10 ~ 15 분 간격으로 읽는 많은 효소 허용됩니다. </li><li> 적어도 1 시간에 지정된 간격으로 마이크로 형광 계속 읽기. 마이크로 덮여 유지해야하거나 독서의 어둠 속에서 수의. </li></ol> 5. 물 부피당 효소 활성의 산출 <ol><li> 초기 샘플의 형광 (웰 D 및 E)를 의미하는, 평균 최종 샘플 형광 (웰 AC), 평균 표준 형광 (웰 H10-11), 평균 제어 형광 급냉 (웰 : 각각의 시간 간격으로 각각의 샘플을 계산할 FG). </li><li> 각각의 시간 간격, 나노 몰의 시간의 효소 활성을 계산 -1 ML -1 방정식에서 : </li></ol> 효소 활성 = (샘플의 형광을 의미 - 초기 샘플의 형광을 의미) / (() 시간 시간 (X) 0.2 ㎖ (표준 형광) X를 의미 / 제어 형광을 해소 평균 (표준 형광 / 0.5 몰) X 평균) <ol start="3"><li> 각 시간 단계에서 계산 된 활동 값을 검사합니다. 가장 높은 활성 시간 단계에서 최종 잠재적 인 활동을 결정합니다. 활동 값이 계속 증가 할 경우, 나중에 단계가 필요할 수 있습니다 활동을 통해서 값이 떨어질 경우호우 실행의 과정은 다음 짧은 시간의 단계를 다시 실행합니다. 최종 활동은 기판 소비 시간 -1 -1 ML의 나노 몰에 있지만 시간 -1 L -1 μmoles로 표현하도록 확장 할 수 있습니다. </li></ol>

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</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

토양과 퇴적물에있는 미생물의 세포 외 다양한 효소의 활동을 결정하는 것은 영양 광물 및 유기물 처리 17의 속도로 유용한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 그러나 토양은 수분 수준이 다를 수 있으므로 토양 건조 중량으로 활동을 표준화하는 것이 중요합니다. 이것은 단순히 효소 활성을 측정 넘어 (전형적 이틀) 추가로 건조 공정을 필요로한다. 따라서, 즉각적인 결과를 제공하는 근처에 물 샘플에있는 효소 활성의 분석에 대비, 토양 및 퇴적물에있는 효소 활성의 신뢰할 수있는 분석은 몇 일이 소요된다. 일부 토양의 경우, 심지어는 건조 과정을 넘어 추가 애싱 단계 (500 ° C에서 일반적으로 2 시간)을 필요로하는 유기물 또는 재 무료 건조 질량의 그램 당 활동을 표현하는 것이 더 적절할 수있다. 관계없이, 토양 또는 퇴적물 효소 활성의 비색 분석에서 가장 중요한 단계는 딥 - 웰 블록 F로부터 상등액 철수이다배양 기간의 끝에서 원심 분리를 따르게. 이 절차는 흡광도를 측정에 의존하기 때문에, 최종 마이크로 몇 부유...

박테리아 및 곰팡이 등의 미생물 세포 효소의 생산을 통해 복잡한 유기 화합물의 영양분과 탄소를 얻을 수 있습니다. 이러한 효소는 전형적 셀로 취할 수 작은 소단위로 중합체를 가수 분해한다. 따라서, 생태 학적 수준에서, 이러한 미생물의 세포 외 효소는 영양 광물 및 자연 환경에서 발생하는 유기물 분해의 대부분에 대한 책임이 있습니다. 이러한 cellobiohydrolase (CBH) 및 β-글루코시다 제 등의 효소는 미생물의 흡수와 동화에 대한 utilizable 탄소 기판을 제공 1,2 포도당 셀룰로오스의 가수 분해를 촉진하기 위해 한마음으로 셀룰로오스 분해 작업을 위해 중요하다. 효소 포스는 유기 인계에서 수용성 무기 인산염 그룹, 기본적으로 인산염 광물 화하고 대부분의 생물 3에서 사용할 수있게 만들을 출시. 이러한 N-acetylglucosaminidase (나가세)와 같은 다른 효소는 importan 아르키틴 분해에 t, 탄소 및 미생물 인수 4에 해당하는 질소의 양을 만들 수 있습니다. 자연 환경에서 미생물의 세포 외 효소 활성의 분석을위한 절차 중 하나는 인공 P-니트로 페닐 (p의 NP) 연결된 기판 원래 토양 오 포스 파타 아제 활성을 검출하기 위해 개발 된 방법의 사용이다. 이 방법은 인공 기판이 해당 효소에 의해 가수 분해 될 때 방출되는 컬러 최종 제품, P-니트로 페놀의 검출에 의존한다. P-니트로 페놀은 이후 약 400 ~ 410 nm에서 흡광도를 측정하여 색도계로 정량화 할 수있다. 이 방법은 시간과 같은 나가세 6와 같은 다른 효소를 검출하도록 적용되고 있으며, 토양 및 퇴적물 7-9 미생물 세포 외 효소 활성을 찾고 다양한 연구에 사용되었다. originall의 있었다 다른 방법Y는 10,11 4 - 메틸 움 (MUB) 연결된 기판을 이용한다 수중 환경에서 세포 글루코시다 제 활성을 평가하기 위해 개발 하였다. (4 - 메틸 움) 릴리스 최종 생성물은 높은 형광이며 460분의 360 nm의 주변의 여진 / 배출 설정으로 형광 분석기를 사용하여 검출 될 수있다. MUB 연결된 인공 기판의 다양한 P는 NP-기판 비색 절차를 사용하여 정량 할 수있는 이상으로 많은 효소 (예 : β-글루코시다 아제, cellobiohydrolase, 나가세, 인산 가수 분해 효소)의 활동의 형광 측정을 허용, 사용할 수 있습니다. 이러한 단백질 분해 로이신 아미노 펩 티다 제와 같은 기타 미생물 세포 외 효소, 7 - 아미노 -4 - 메틸 쿠마린 (COU) 연결된 기판을 사용 fluorometrically 정량 할 수있다. MUB과 커플 연결 기판은 모두 다양한 육상 및 수생 샘플 (12, 13)의 효소 활성을 결정하는 데 사용되었다. 이전의 연구는 descr가있는 반면IBED 형광 또는 비색 마이크로 플레이트는 세포 외 효소 활성 (14)을 결정하기 위하여 접근 등의 분석을 수행하는 방법에 대한 명확한 프리젠 테이션에 대한 필요성이있다. 여기서 우리는 비색 P의 NP-결합 기판 방식을 사용하여 토양과 퇴적물 및 형광 MUB 연결된 기판 기술을 사용하여 자연수의 세포 외 효소 활성의 분석을위한 높은 처리량의 마이크로 기술을 수행하기위한 절차를 보여준다. 이 효소는 각각 탄소, 질소 및 인 순환에 연결 될 수있는 우리는 β-글루코시다 아제, 나가세, 및 포스 파타 아제의 활동의 측정에 초점을 맞 춥니 다. 그러나, 여기에 기재된 절차는 서로 다른 인공 기질을 사용하는 다른 세포 외 효소의 측정에 적용 할 수있다.

<table><tbody><tr><td colspan = "4">< 강> 시약 및 재료 < / 강></td></tr><tr><td>빙산</td><td></td><td></td><td>다양한 공급 업체</td></tr><tr><td>아세트산</td><td></td><td></td> 나트륨 <td>다양한 공급 업체 수</td></tr><tr><td>산화</td><td></td><td></td> 나트륨 <td>다양한 공급 업체</td></tr> <tr><td>p-Nitrophenol</td><td>Fisher</td><td>BP612-1</td><td>교대 가능</td></tr><tr><td>p-니트로페닐 (pNP)-인산염</td><td>시그마</td><td>N3234</td><td>pNP-substrate</td></tr><tr><td>pNP-&#946;-glucopyranoside</td><td>Sigma</td><td>N7006</td><td>pNP-substrate</td></tr><tr><td>pNP-&#946;-N-acetylglucosaminide</td><td>Sigma</td><td>N9376</td><td>p NP-substrate</td></tr><tr><td>Clear 96-well microplates</td><td>Fisher</td><td>12-563-301</td><td>대체 사용 가능</td></tr><tr><td>96-well 딥 웰 블록</td><td>Costar</td><td>3958</td><td>대체 사용 가능</td></tr><tr><td>알루미늄 계량 팬</td><td></td><td></td><td>다양한 공급업체</td></tr><tr><td>멸균 15ml 원심분리기 튜브</td><td></td><td></td><td>다양한 공급업체</td></tr><tr><td>멸균 50ml 원심분리기 튜브</td><td></td><td></td><td>다양한 공급 업체</td></tr><tr><td>4-Methylumbelliferone</td><td>시그마</td><td>M1381</td><td></td></tr><tr><td>4-Methylumbelliferyl (MUB)-phosphate</td><td>Sigma</td><td>M8883</td><td>MUB-substrate</td></tr><tr><td>4-MUB-glucopyranoside</td><td>Sigma</td><td>M3633</td><td>MUB-substrate</td></tr><tr><td>4-MUB-N-acetylglucosaminide</td><td>Sigma</td><td>M2133</td><td>MUB-substrate</td></tr><tr><td>중탄산</td><td></td>나트륨<td></td><td>다양한 공급업체</td></tr>: <tr><td>검은색 96웰 마이크로플레이트</td>, <td>Costar</td><td>3792</td><td></td></tr><tr><td>피펫 저장소</td><td></td><td></td>, <td>다양한 공급업체</td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Centrifuge</td>, <td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge rotor</td><td>Eppendorf</td><td>A-4-81</td><td>마이크로플레이트/딥웰 블록용</td></tr><tr><td>마이크로플레이트 리더</td><td>BioTek</td><td>Synergy HT</td><td>대체 사용 가능</td></tr><tr><td>마이크로플레이트 형광측정기</td><td>BioTek</td><td>FLx 800</td><td>대체 사용 가능</td></tr><tr><td>8채널 피펫터</td><td></td><td></td><td>다양한 공급업체</td></tr></tbody></table>

높은 처리량 마이크로 분석 실험을 사용하여 워터스, 토양 및 퇴적물에있는 미생물 세포 외 효소 활성의 결정

Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

자연 환​​경의 영양 순환과 탄소 처리의 대부분은 미생물에 의해 발표 세포 효소의 활동을 통해 발생합니다. 따라서, 이러한 세포 외 효소의 활성 측정은 유기물 분해 또는 질소와 인 광물 등의 생태계 수준의 프로세스의 속도에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 환경 시료에서 세포 외 효소 활성의 분석은 일반적으로 인공 측색 또는 형광 기질에 샘플을 노출하고, 기판의 가수 분해 속도를 추적 포함한다. 여기에서 우리는 짧은 기간 내에 다수의 샘플의 분석을 할 수있는 절차를 마이크로 기반의 방법을 설명한다. 샘플은 마이크로 블록 마이크로 플레이트 또는 디프 웰 96 - 웰 내에 인공 기질과 반응 할 수 있으며, 효소 활성이어서 전형적인 마이크로 플레이트를 사용 Reade에 얻어진 최종 생성물의 흡수 또는 형광에 의해 결정된다R 또는 형광 분석기. 이러한 높은 처리 절차는 공간적으로 분리 된 사이트 또는 생태계 간의 비교를 용이하게, 또한 실질적으로 샘플 당 필요한 시약 전체적인 부피를 감소시킴으로써 그러한 분석법의 비용을 줄일뿐만 아니라.

토양과 수생 퇴적물 일반적 부착 미생물 군집 (생물막) 입자의 표면에 성장의 결과로 세포 외 효소 활성의 상당한 수준을 가지고.이 액티비티는 제 3 표면 침전물로부터 얻어지는 입자의 크기에 따라 변경하는 방법도 3 도표 북부 미시시피, 미국에서 주문 스트림. 이전의 연구는이 스트림에서 퇴적물 입자의 세균성 지역 사회가 사회 구조의 분자 분석을 기반으로 세 가지 그룹으로 분리 될 수있는 것으로 나타났습니다 : 0.063 mm 입자, 0.125에 그, 0.25, 0.5 mm 입자에 그, 그 1mm에 (15)는 입자. 세포 외 효소 활성의 패턴의 분석은 이러한 결론을 지원 포스파타제 (도 3a)와 0.125, 0.25, 및 0.5 mm의 입자에 유사한 것으로하지만, P는 NP-결합 기판 기술을 사용하여 측정시, 1 및 0.063 mm 분획에 훨씬 높다. O이러한 β-글루코시다 아제 (그림 3B), 그리고 나...

마이크로 플레이트 기반 절차는 세포 외 효소 활성의 형광 또는 비색 분석을 위해 설명된다. 이러한 절차는 관리 기간 내에 환경 시료 다수 이러한 활동의​​ 신속한 분석을 허용한다.

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

다음 절차의 전반적인 목표는 다양한 자연 환경에서 미생물의 세포외 효소 활성을 빠르게 분석하는 것입니다. 이는 수분 또는 토양 슬러리 샘플을 마이크로플레이트에 첨가하여 적절한 반복 수를 확보함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 인공 발색 또는 형광 기질을 마이크로플레이트 웰에 첨가하여 효소 반응이 일어나도록 합니다. 다음으로, 반응 동안 방출된 최종 생성물의 양을 결정하기 위해 흡광도 또는 형광을 측정합니다.결과는 최종 반응의 흡광도 또는 형광도를 바탕으로 시료 간의 세포 외 효소 활성 차이를 보여줍니다. 오늘은 자연 환경에서 세포 외 효소 활성을 측정하는 방법을 시연하겠습니다. 이 방법은 토양, 퇴적물 및 수중 환경에서의 유기물 처리 속도와 영양분 무기화와 같은 미생물 생태학의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 사용하는 사람들은 특히 많은 수의 시료를 분석할 때 반응 용액에서 입자를 분리하는 데 어려움을 겪습니다.플레이트 배치를 익히는 것이 어려울 수 있고, 여러 시간 단계에서 측정값을 얻는 과정이 까다로울 수 있으므로 이 절차에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 토양 및 퇴적물의 세포 외 효소 활성에 대한 측정 분석은 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 기질 완충액과 표준 용액을 준비하는 것으로 시작합니다. 분석할 각 시료를 멸균된 15 milliliter 원심 분리 튜브에 넣고 슬러리를 준비하십시오. 퇴적물의 경우 50 millimolar 아세테이트 완충액을 사용하여 약 1 g/mL 농도로 첨가합니다.슬러리를 쉽게 파이펫팅할 수 있을 만큼 충분한 양의 아세테이트 완충액을 추가합니다. 필요한 슬러리의 정확한 부피는 분석하는 효소의 수에 따라 다르지만, 최소 5 mL 이상을 권장합니다. 토양이나 침전물 덩어리가 모두 분산될 때까지 각 슬러리를 볼텍싱합니다.그리고 최종 부피를 확인하십시오. 피펫팅을 하기 전에 가위로 피펫 팁의 끝부분을 자르십시오. 토양 슬러리는 팁을 막는 경향이 있으므로, 각 슬러리를 다시 볼텍싱(vortex)한 후 즉시 150 µL씩 6개의 웰에 각각 피펫팅하십시오.96-웰 딥웰 블록에서 진행합니다. 충분하고 빈번하게 볼텍싱하는 것이 중요합니다. 토양 입자가 부유 상태를 유지하도록 하기 위해, 블록당 최소 2개의 웰을 비워 기질 대조군으로 사용하십시오.분석할 각 효소에 대해 96-웰 블록 1개를 준비합니다. 피펫 리저버에 아세테이트 버퍼 약 5mL를 붓고, 8채널 피펫을 사용하여 각 시료의 마지막 두 웰에 버퍼 150µL를 추가합니다.샘플 버퍼 대조군과 두 개의 기질 대조군 웰에 처리합니다. 적절한 p-nitrophenyl Phosphate(PNP) 기질 용액 약 10 milliliters를 피펫 리저버에 붓고, 8채널 피펫을 사용하여 각 샘플의 처음 4개 웰과 두 개의 기질 대조군 웰에 기질 용액 150 microliters를 첨가합니다. 기질 용액을 첨가하는 즉시 반응이 시작되는 시간을 기록하십시오.플레이트를 실온에서 0.5~4시간 동안 배양합니다. 정확한 배양 시간은 시료의 활성 수준과 분석할 효소에 따라 달라집니다. 분석물을 배양하는 동안 투명한 96-웰 마이크로플레이트 하나를 준비합니다.흡광도를 측정하기 위해, 각 딥웰 블록의 마이크로플레이트 웰에 증류수 190 µL와 1 M 수산화나트륨 10 µL를 피펫으로 분주합니다. 수산화나트륨은 효소 반응을 늦추고 pH를 높여, 배양 후 반응 과정에서 방출된 PNP의 색상을 강화합니다. 96웰 블록을 2000~5,000 ×g에서 5분 동안 원심분리하여 토양 입자를 침전시킵니다.펠렛을 건드리지 않고 액체만 제거하는 것은 까다로울 수 있습니다. 처음부터 토양 샘플을 너무 많이 사용하는 것을 피해야 합니다. 충분한 시간 동안 원심분리를 수행하고, 액체를 흡입할 때 신중하면서도 과감한 동작으로 조작하십시오.멀티채널 파이펫을 사용하여 펠렛이 섞이지 않도록 주의하며 각 웰에서 100 µL를 취합니다. 이 액체를 준비된 투명 96 웰 마이크로플레이트의 해당 웰로 옮깁니다. 마이크로플레이트 리더기를 켜고 필요한 소프트웨어를 설정합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 샘플의 건조 중량을 측정한 후, 410 nm에서 흡광도를 기록합니다. 샘플 분석 흡광도에서 샘플 대조군 흡광도를 빼서 각 샘플의 최종 흡광도를 계산합니다.기질 대조군의 흡광도가 0.060보다 높을 경우, 해당 값을 차감하십시오. 또한 다음 식을 사용하여 건조 중량 1g당 시간당 마이크로몰 단위로 효소 활성을 계산하십시오. 텍스트 프로토콜에 제시된 예시를 따라 각 효소에 대해 블랙 마이크로플레이트를 구성한 후, 첫 번째 수질 시료 약 5mL를 피펫 저장조에 붓고 8채널 피펫을 사용하여 모든 웰에 200µL씩 분주하십시오.마이크로플레이트의 첫 번째 열에 사용한 피펫 팁을 버리고, 1열부터 9열까지 채울 때까지 각 수질 샘플에 대해 필요한 만큼 이 과정을 반복합니다. 샘플, 표준물질, 기질 및 퀀칭(quenching)을 고려한 대조군을 샘플이 담긴 동일한 검은색 마이크로플레이트에 설정합니다. 샘플 대조군은 샘플 수와 중탄산염 완충액을 포함하며, 활성 계산에는 사용되지 않지만 실험 과정 전반에 걸쳐 측정값의 일관성을 입증하는 데 사용됩니다.소광 대조군은 시료수와 표준량의 형광 태그로 구성되며, 형광의 회절을 측정하는 데 사용됩니다. 시료수 기질 및 표준 대조군은 각각 기질 결합 형광 태그 또는 표준 형광 태그와 중탄산염 완충액으로 조제합니다. 깨끗한 피펫 리저버에 5 mM 중탄산염 완충액 약 5 mL를 붓습니다.d행과 e행의 1번부터 9번 마이크로플레이트 웰에 완충액 50 µL씩을 분주하여 샘플당 두 개의 반복 대조군 웰을 생성합니다. 피펫 팁을 교체한 후, A행과 H행의 10번부터 12번 웰에 중탄산염 완충액 200 µL를 옮깁니다. 촬영 목적으로 본 시연에서는 조명을 밝게 유지하고 있으나, 형광 표준 물질은 빛에 민감하므로 조명을 낮추거나 꺼서 주변 조도를 줄여야 합니다. 깨끗한 피펫 리저버에 약 5 mL의 10 µM 4-methylumbelliferone(MUB)을 붓고, H행의 1번부터 12번 마이크로플레이트 웰에 50 µL씩 분주합니다. 그런 다음 G행과 F행의 1번부터 9번 웰에 50 µL씩 분주하여 샘플당 세 개의 반복 퀀칭(quench) 대조군과 전체 표준 대조군을 생성합니다. MUB의 빛에 의한 분해를 줄이기 위해 마이크로플레이트를 어두운 곳에 두거나 불투명한 덮개로 덮고, 형구광계를 켜고 기질을 첨가하기 전 판독 준비가 되도록 필요한 소프트웨어를 설정합니다.깨끗한 피펫 리저버에 적절한 MUB 코팅 기질 약 5 mL를 넣고, 12채널 피펫을 사용하여 A행의 1번부터 12번 웰과 B행 및 C행의 1번부터 9번 웰에 50 µL씩 분주하여 각 샘플당 3개의 반복 시험군과 3개의 기질 대조군을 형성한 후 즉시 형광을 측정하십시오. 기질을 마이크로플레이트에 첨가한 직후 초기 형광을 측정합니다. 형광 측정 후 마이크로플레이트를 암실 보관하거나 불투명한 덮개로 덮어 실온에서 배양하십시오.MUB의 광분해를 줄이기 위해서입니다. 최대 잠재 효소 활성을 측정하는 데 필요한 배양 시간은 시료 내의 효소 농도에 따라 달라집니다. 이는 알려지지 않았으므로, 시료를 분석하기 전에 마이크로플레이트를 여러 시간 단계로 읽어야 합니다.대부분의 효소의 경우, 1시간 동안 10~15분 간격으로 측정하는 것이 적절하나, 농도가 높은 일부 샘플은 10분 이전에 정점에 도달할 수 있습니다. 지정된 간격으로 최소 1시간 동안 마이크로플레이트의 형광을 계속 측정하십시오. 측정 사이에는 마이크로플레이트를 덮어두거나 어두운 곳에 보관해야 합니다.각 시간 간격의 각 샘플에 대해, 해당 시간 간격의 평균 초기 샘플 형광, 평균 최종 샘플 형광, 평균 표준 형광 및 평균 소광 대조군 형광을 계산하십시오. 텍스트 프로토콜에 제시된 식을 사용하여 mL당 시간당 m 단위로 효소 활성을 계산하십시오.각 시간 단계에 대해 계산된 활성 값을 검토하고, 활성이 가장 높은 시간 단계의 값으로부터 최종 잠재 활성을 결정하십시오. 활성 값이 계속 증가한다면, 더 이후의 시간 단계가 필요할 수 있습니다. 실행 과정 전반에 걸쳐 활성 값이 감소한다면, 시간 단계를 더 짧게 설정하여 다시 실행하십시오.토양과 수생 퇴적물은 일반적으로 입자 표면에서 성장하는 부착 미생물 군집으로 인해 상당한 수준의 세포 외 효소 활성을 나타냅니다. 이 그림은 미국 미시시피 북부의 3차 하천 표층 퇴적물에서 얻은 입자의 크기에 따라 이러한 활성이 어떻게 변화하는지를 보여줍니다. 이전 연구에 따르면, 이 하천의 퇴적물 입자에 존재하는 박테리아 군집은 군집 구조의 분자 분석을 통해 세 개의 뚜렷한 그룹으로 구분될 수 있음이 밝혀졌습니다.0.063 mm 입자, 0.125, 0.25 및 0.5 mm 입자, 그리고 1 mm 입자에 부착된 것들입니다. 세포외 효소 활성 패턴 분석은 이 결론을 뒷받침하는데, PNP 연결 기질 기술을 사용하여 측정했을 때 phosphatase는 0.125, 0.25 및 0.5 mm 입자에서 비슷하게 나타났으나, 1 mm 및 0.063 mm 분획에서 훨씬 더 높게 나타났습니다. beta glucco 및 n AGAs와 같은 다른 효소들은 가장 미세한 입자에서 유사한 정점을 보였으나, 1 mm 입자에서는 증가하지 않았습니다.서로 다른 효소들이 서로 다른 환경적 분포를 보일 수 있으며, 본 분석법을 통해 이를 규명할 수 있다는 점을 강조합니다. 상대적으로 낮은 오차 막대는 퇴적물 내 효소 활성의 화학 분석법이 재현 가능하며, 따라서 통계적 분석에 적합함을 보여줍니다. 서로 다른 환경 시료를 비교했을 때, 자연수는 일반적으로 토양이나 퇴적물의 g당 활성보다 mL당 세포 외 효소 활성이 낮은 경향이 있습니다.따라서 이들은 MUB 결합 기질을 사용하여 형광 측정법으로 분석되어야 합니다. 이 그림은 phosphatase, beta-glucco 및 NGA 효소의 활성이 깊이에 따라 어떻게 변하는지를 보여줍니다. 미국 미시시피 북부의 얕은 호수는 영양분이 부족한 것으로 알려져 있으며, 이는 유기 화합물로부터 인산을 획득하기 위해 미생물이 생성하는 phosphatase 및 효소의 활성이 상대적으로 높다는 점에서도 시사됩니다.세 가지 효소 모두에 대해, 수면과 50cm 깊이에서 채취한 분석 시료는 유사한 활성을 보였습니다. 반면 100cm 시료에서는 활성이 높게 나타났는데, 해당 시료는 기본적으로 수층-퇴적물 경계면에서 채취되었으며 시료 내 퇴적물 입자의 존재가 특히 beta glucco 및 n AGAs에서 관찰된 더 높은 활성의 원인일 가능성이 큽니다. PNP 기질과 마찬가지로, 오차 막대가 낮다는 것은 단 3회의 반복 측정만으로도 MUB 기질을 이용한 형광 분석의 재현성이 높다는 것을 보여줍니다.수중 시료의 효소 활성 단위는 소비된 기질의 nmol인 반면, 퇴적물 입자의 효소 활성 단위는 단위 크기당 수치가 비슷함에도 불구하고 소비된 기질의 µmol 단위라는 점에 유의하십시오. 이는 토양과 퇴적물이 자연수보다 세포 외 활성이 훨씬 높은 경향이 있다는 사실을 강조합니다. 또한, 이는 MUB 결합 기질 기법의 향상된 민감도를 입증하며, 숙련된 이후에는 수중 시료의 세포 외 효소 활성을 분석하기 위해 이 기법을 사용하는 것이 필수적임을 보여줍니다.이 기술을 사용하면 한 시간 남짓한 시간 내에 최대 9개의 수질 시료에 대한 효소 활성을 분석할 수 있습니다. 토양 및 퇴적물을 대상으로 이 절차를 수행할 때는 활성도를 건조 중량 기준으로 표현할 수 있도록 이미 알고 있는 질량의 재료를 사용하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청하고 나면, 비색법(colorimetric) 또는 형광법(fluorometric) 기술을 사용하여 다양한 자연 환경에서 세포 외 효소 활성을 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

determination-microbial-extracellular-enzyme-activity-waters-soils

Research

연구

JoVE Journal

Environment

환경

이 프로토콜은 대장균의 표현 metagenomic 도서관에서 cellulolytic 활동에 높은 처리량 화면을 설명합니다. 화면이 솔루션을 기반으로하고 고도의 자​​동화, 그리고 흡광도 측정으로 최종 판독과 384 잘 microplates에 한 냄비 화학을 사용합니다.

Metagenomic 도서관에서 Cellulase 활동 Biomining에 대해 높은 처리량 화면

우리의 곰팡이 endoglucanase 활동을위한 화면으로 저렴한 비용, 높은 처리량 방법을...

에서 곰팡이 Endoglucanase 활동의 높은 처리량 검사 대장균</em

이 비디오는 페그 플레이트를 사용하여 생물막을 효율적으로 제거하는 항균 화합물을 스크리닝하는 분석을 보여줍니다. 이 방법론은 항균 화합물로 처리한 후 생물막의 대사 상태를 모니터링하여 최소 생물막 박멸 농도를 쉽게 측정할 수 있습니다.

항균제 스크리닝을 위한 Peg Plate Biofilm Assay

토양 세포 외 효소 활성의 잠재적 인 속도를 측정하기 위해 형광 염료에 바인딩 된 합성 기판은 토양 샘플에 추가됩니다. 형광 염료는 높은 형광 이상의 기판을 나타내는 분해 효소 - 촉매 반응에 의해 기판으로부터 방출 될 때 효소 활성을 측정한다.

잠재적 인 토양 세포 외 효소 활동의 높은 처리량 형광 측정 측정

여기서는 작은 간섭 합성 RNA(siRNA), 화학 화합물 및 진균 결핵 돌연변이 라이브러리의 고처리량/고함량 스크린에 적용되는 표현성 분석을 설명합니다. 이 방법은 자동 공초점 현미경 검사를 사용하여 형광으로 표지된 숙주 세포 내의 형광표지 진균 결핵의 검출에 의존합니다.

고처리량/고함량 스크리닝에 적용된 세포내 진균의 정량화를 위한 현미경 표티픽 분석

여기에서는 항균 활성을 위해 효소를 신속하게 스크리닝하고 특성화하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 마이크로슬라이드 확산 분석법과 염료 방출 분석법은 정성적 및 정량적 효소 활성 평가를 위해 표적 박테리아 기질을 활용합니다.

정성 및 정량 검출을위한 시험 법 및 단백질 항생제 특성

본 연구는 200개 이상의 효소에 이론적으로 적용할 수 있는 보편적인 유전 효소 스크리닝 시스템을 이용한 고처리량 스크리닝 방법을 제시합니다. 여기서 단일 스크리닝 시스템은 사용된 기질(p-니트로페닐 아세테이트, p-니트로페닐-β-D-셀로비오시드 및 페닐 포스페이트)을 간단히 변경하여 세 가지 다른 효소(리파아제, 셀룰라아제 및 알칼리성 인산가수분해효소)를 식별합니다.

멀티 효소 높은 처리량 유전자 효소 검사 시스템을 사용하여 상영

효소 스크리닝을 위한 고처리량 분석에 대해 설명합니다. 즉시 사용 가능한 이 멀티플렉스 분석 키트는 사전 선택된 Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) 기질과 complex Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) 기질로 구성됩니다. 표적 효소는 다당류를 분해하는 내효소(endo-enzymes)와 프로테아제(protease)입니다.

소설 불용성 발색 기질 분석 키트를 사용하여 탄수화물 분해 효소의 높은 처리량 검열

우리는 지구 시스템에서 미 량 영양소 bioavailability 및 매출에 기여 하는 siderophore 잠재적인 환경 샘플의 신속한 심사에 대 한 프로토콜을 제시.

환경 샘플에서 높은 처리량 Siderophore 심사: 식물 조직, 대량 토양, 및 Rhizosphere 토양

이 프로토콜에 제시된 공동 문화 상호 작용 분석은 저렴하고 높은 처리량이며 간단합니다. 이 계산은 공동 배양에 있는 미생물 상호 작용을 관찰하고, 상호 작용 패턴을 확인하고, 인간과 환경 병원체에 대하여 관심있는 미생물 긴장의 억제 잠재력을 특성화하기 위하여 이용될 수 있습니다.

미생물 상호 작용의 조사를 위한 높은 처리량 공동 문화 애세서

배우세요 높은 처리량 마이크로플레이트 분석법을 사용하여 물, 토양, 퇴적물에서 미생물 세포 외 효소 활성을 측정하는 방법입니다. 이 기술은 미생물 생태학 연구에서 유기물 분해 속도를 신속하게 평가하는 데 활용됩니다.

높은 처리량 마이크로 분석 실험을 사용하여 워터스, 토양 및 퇴적물에있는 미생물 세포 외 효소 활성의 결정

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