호스트 병원체 단백질 - 단백질 상호 작용의 풍경의 특성을 비교 접근

다음 실험의 전반적인 목표는 서로 다른 병원체 변이 유래 단백질들의 상호작용 프로파일을 공통된 세포 인자 세트와 비교하기 위해 외부체 연구를 수행하는 것입니다. 이는 서로 다른 병원체 변이 단백질의 잠재적 상호작용 파트너를 식별하기 위해 cDNA에 대해 교배 기반의 효모 이중 하이브리드 스크리닝을 실시함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 상호작용 파트너의 오픈 리딩 프레임을 시퀀싱하고 추가 검증에 적합한 벡터로 전이합니다.

다음으로, 두 가지 하이브리드 스크리닝 모두에서 검출된 개별 파트너 세트를 선정하여 연구된 전체 균주 범위와의 상호작용을 재테스트합니다. 이는 견고한 비교 상호작용 데이터 세트를 제공하기 위해 포유류 세포에서 수행되는 직교 gia, 루시퍼레이즈 기반 단백질 조각 상보성 분석법을 사용하여 진행됩니다. 루시퍼레이즈 측정값을 통해 병원체 단백질과 세포 단백질 사이의 서로 다른 상호작용 강도가 나타나며, 이를 통해 병원체-숙주 단백질-단백질 상호작용에 대한 비교 개요를 제공합니다.

계층적 군집화를 통한 상호작용 프로필 분석은 특정 숙주-병원체 상호작용을 병리적 특성과 상관시키며, 병원성 과정에서 병원체 단백질의 관여에 대한 통찰을 제공합니다. 병원체-숙주 단백질-단백질 상호작용을 매핑하는 다른 방법들에 비해 이 접근 방식이 갖는 주요 장점은 여러 균주 변이체 간의 엄격한 비교 상호작용 데이터셋을 제공한다는 점입니다. 이 기술은 병원체 단백질의 상호작용 네트워크에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라, 예를 들어 완전한 바이러스 및 역유전학을 이용한 감염 분자와 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 서면 프로토콜 시드에 기술된 대로 효모 세포의 교배 및 도말부터 이 프로토콜을 시작하십시오.

병원체 단백질을 발현하는 P-G-B-K-T seven 플라스미드가 형질전환된 AH 1 0 9 효모 균주가 소수 콜로니 형태로 포함된 트립토판 결핍 선택 배지 30 milliliters를 준비합니다. 30 degrees Celsius에서 회전 배양하며 30시간 동안 배양합니다. 다음으로, AH 1 0 9 배양액 30 milliliters를 트립토판 결핍 선택 배지 200 milliliters에 접종합니다.

배양물을 30 °C에서 20시간 동안 회전 배양합니다. 또한, cDNA 라이브러리가 형질전환된 Y 187을 20 mL의 YPD 배지에서 30 °C로 10분 동안 회전 배양합니다. 그런 다음, 생존 가능한 Y 187 효모 세포와 동일한 양에 해당하는 pGBKT7 형질전환 AH 109 배양물을 3,500 RPM, 20 °C에서 5분 동안 원심 분리합니다.

상층액을 조심스럽게 제거하고 펠렛을 10 milliliters의 YP glue에 다시 부유시킵니다. 재부유시킨 AH 109 효모를 라이브러리가 포함된 Y 187과 혼합합니다. 50 milliliter 튜브로 옮긴 후, 3, 500 RPM 및 20 degrees Celsius에서 5분 동안 원심분리합니다.

super dat Resus를 조심스럽게 흡입하여 제거한 후, 펠릿을 YP glue에 현탁하여 총 1.5 milliliters가 되게 합니다. 다음으로, 효모를 세 개의 150 millimeter YCM agar 플레이트에 플레이트당 0.5 milliliters씩 도말하고 30 degrees Celsius에서 4.5시간 동안 배양합니다. 렉 글라스(rake glass)로 긁어내어 10 milliliters의 leucine, tryptophan, histidine가 결핍된 선택적 dropout 배지에 YCM 플레이트로부터 교배된 효모를 수집합니다.

동일한 배지 5 mL로 플레이트를 두 번 헹구고, 3,500 RPM 및 20 °C에서 5분간 원심분리한 후 모은다. 상층액을 버리고 반복한다. 효모 펠렛을 leucine, tryptophan, histidine가 결핍된 선택적 dropout 배지 5 mL에 현탁한다.

그런 다음 교배된 효모를 자동 활성화 테스트에서 결정된 적절한 농도의 3-amino triazole(3-AT)이 첨가된 leucine, tryptophan, histidine 결핍 선택적 dropout agar 플레이트 10개에 도말합니다. 가습 환경의 30 °C에서 6~10일 동안 배양한 후, 서면 프로토콜에 설명된 대로 이배체율을 계산합니다. 효모 콜로니를 채취하여 leucine, tryptophan, histidine 결핍 선택적 dropout agar에 3-AT를 첨가하여 새로 준비한 플레이트로 옮깁니다.

나중에 시퀀싱을 용이하게 하기 위해, 96-웰 플레이트를 재현하는 12-웰 8레인 체계로 효모를 배치하십시오. 가습된 환경의 30 °C에서 효모 콜로니를 4~5일 동안 배양합니다. 이 섹션의 목적은 류신(leucine), 트립토판(tryptophan) 및 히스티딘(histidine)이 제거된 선택적 드롭아웃 한천 배지에서 배양하여 용해시킨 효모 콜로니 내 PA ct two 벡터에 포함된 cDNA를 PCR로 증폭하는 것입니다.

먼저 96-well PCR 플레이트를 얼음 위에 놓고, 웰당 50 µL의 xmal 20 T 용액을 넣어 효모 세포를 용해합니다. 웰당 하나의 콜로니를 부드럽게 재현탁합니다. 플레이트를 37 °C에서 15분간, 그리고 95 °C에서 15분간 배양합니다.

플레이트를 다시 얼음에 놓은 후, 웰당 50 µL의 증류수를 첨가하고 피펫팅으로 혼합한 다음, 4 °C에서 3,500 RPM으로 5분 동안 원심분리합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 X tack mix를 준비한 후, 96웰 PCR 플레이트의 웰당 40 µL의 mix를 분주합니다. 웰당 10 µL의 용해된 효모를 첨가하고 텍스트 프로토콜에 기재된 대로 증폭을 수행합니다.

PCR 양성 클론을 검출하기 위해 PCR 생성물 3 µL를 1.2% agarose 겔에서 전기영동합니다. 선별된 3개의 양성 클론에서 분리한 PCR 증폭 단편의 서열을 분석합니다. 그 후, blast 분석을 수행하여 세포 open reading frame을 확인하며, 세포 transfection 이전에 신뢰도가 낮은 정렬 결과와 frameshift 및 조기 종결 코돈을 포함하는 서열은 제외합니다.

텍스트 프로토콜에 상세히 설명된 대로, Gaia 루시페레이스 조각과 융합된 단백질을 생성하기 위해 병원체 단백질 및 세포 단백질 오픈 리딩 프레임을 각각의 벡터로 옮깁니다. 항생제가 없는 10% fetal bovine serum이 포함된 DMEM에서 350,000 cells/mL 농도로 2 9 3 T 세포를 시딩합니다. 멸균된 흰색 배양 플레이트의 웰당 100 µL씩 분주한 후, 다음 날까지 37 °C, 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양합니다. 적절한 transfection 프로토콜을 사용하여 세포를 transfection하며, 병원체 및 숙주 오픈 리딩 프레임 플라스미드 구축물을 웰당 100 ng씩 사용합니다. transfection 효율을 표준화하기 위해 CMV firefly luciferase 플라스미드를 웰당 10 ng transfection합니다.

각 지점은 3회 반복 테스트하며, transfection 혼합물을 배양된 2 9 3 T 세포 플레이트에 옮깁니다. 2 9 3 T 세포는 부착력이 강하지 않아 웰 바닥에서 쉽게 떨어지므로, DNA 혼합물을 세포 위에 조심스럽게 분주하십시오. 37 °C, 5% carbon dioxide 조건의 세포 배양 인큐베이터에서 24~30시간 동안 배양합니다. 웰당 100 µL의 PBS로 세포를 세척합니다. 1x vanilla lysis 버퍼 40 µL를 첨가하고 상온에서 30분 동안 배양합니다.

교반하면서, 4°C 또는 -20°C에 보관된 반딧불이 루시페라아제의 추후 투여를 통해 Gaia 활성을 측정하기 위해 세포 용해물 10 µL를 다른 화이트 플레이트에 보관합니다. 플레이트를 루미노미터에 넣고 세포 용해물에 vanilla 루시페라아제 분석 시약 100 µL를 주입합니다. 그 다음 10초 동안 발광을 측정합니다.

96-웰 플레이트의 분주에는 약 30분이 소요됩니다. 냉동 보관이나 장기 보관은 남은 10 µL 세포 추출물의 상호작용 매개 Gaia 활성에 영향을 미칠 수 있으므로 항상 신선한 추출물을 사용하십시오. 루미노미터를 사용하여 세포 용해물에 50 µL의 반딧불이 루시퍼레이스 분석 시약을 주입하고 10초 동안 발광을 측정합니다.

96-well 플레이트의 투여는 각 상호작용당 약 30분이 소요됩니다. Gaia 루시퍼레이즈 활성과 반딧불이 루시퍼레이즈 활성 사이의 비율을 계산하여 정규화된 GAIA 발광 값을 얻습니다. 이때 형질전환 효율과 세포 생존율을 고려합니다.

상호작용을 모니터링하기 위해 3회 반복 측정값의 평균을 계산하십시오. 각 병원체-호스트 쌍에 대한 정규화된 발광 비율(normalized luminescence ratio, NLR)을 추정하십시오. 이를 위해, 병원체와 호스트 단백질이 모두 존재할 때 검출된 정규화된 GAIA 발광 활성도를 대조군 웰에서 측정된 활성도의 합으로 나눕니다.

양성 상호작용을 위한 NLR 컷오프 값은 이전 연구에서 약 3.5로 추정되었습니다. 고처리량 GIA 원리인 단백질 보충 분석법, 즉 H-T-G-P-C-A의 주요 강점은 HPVE E2 단백질의 위양성 및 위음성률 평가를 통해 입증된 높은 민감도에 있습니다. HPV 16 유래 E2의 알려진 상호작용을 H-T-G-P-C-A로 평가한 결과, 18개 상호작용 중 4개가 검출되지 않았으며 이는 22%의 위음성률에 해당합니다.

12가지 HPVE two 단백질을 무작위 세포 단백질 세트와 대조하여 측정한 결과, 위양성 상호작용은 5.8%로 나타났습니다. 이 방법의 강력한 특이성은 E two가 세포 파트너인 BRD four와 결합하는 것을 방해하는 것으로 알려진 단일 지점 돌연변이가 NLR 비율을 소멸시킨다는 것을 보여주는 이 그림에서 강조됩니다. 이러한 대규모 비교 엑토믹(ectomic) 접근 방식은 최근 서로 다른 유전형에서 유래하여 각 조기 단백질의 친화성과 병리적 특성의 자연적 다양성을 대표하는 인간 유두종 바이러스의 세 가지 조기 단백질인 E two, E six 및 E seven에 성공적으로 적용되었습니다.

상호작용 프로파일의 계층적 군집 분석은 대부분 HPV 계통 발생과 일치하며, 이는 해당 접근 방식의 견고함과 상호작용 데이터 세트의 광범위함을 입증합니다. 이를 통해 특정 바이러스-호스트 상호작용 프로파일을 병리적 특성과 상관시키고, 결과적으로 바이러스 단백질의 관여에 대한 단서를 얻을 수 있습니다. 발병 기전 연구에서는 유전자형 특이적 상호작용을 추출할 수 있으며, 이는 잠재적으로 친화성이나 병원성 바이오마커와 일치할 수 있습니다.

여기에 제시된 E6 상호작용 파트너의 사례와 같이, 세포 표적들을 상호작용 강도에 따라 분류하고 상호작용하는 HPV 유형별로 그룹화하였습니다. 이러한 표현 방식은 oncogenic HPV의 E6 단백질과만 상호작용하는 fad와 같은 특정 바이오마커를 식별할 수 있게 해줍니다. 이러한 표적화는 모든 oncogenic HPV의 발암 특성에 결정적이어야 하며, 따라서 HPV 감염의 대리 마커 또는 치료 표적으로 사용하기에 적합한 후보가 됩니다.

이 절차에 따라 H-T-G-P-C-A를 biotin 태그가 융합된 형태로 발현된 세 번째 단백질과 함께 사용하도록 조정할 수 있습니다. 이를 통해 strep diving color 플레이트에서 세 가지 파트너 복합체를 캡처할 수 있으며, 이는 거대 단백질 복합체의 형성 여부에 대한 의문을 해결할 수 있습니다.

이 영상을 시청하고 나면 병원체와 숙주 간의 상호작용을 특성화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 첫째, 여러 변이 균주의 상호작용 파트너를 탐색함으로써 가능하며, 둘째, 포유류 세포 등에서 단백질-단백질 상호작용 분석을 통해 전체 병원체 유형 세트와의 상호작용을 비교함으로써 가능합니다.