호스트 병원체 단백질 - 단백질 상호 작용의 풍경의 특성을 비교 접근

다음 실험의 전반적인 목표는 다양한 병원체 변이체의 단백질의 상호 작용 프로파일을 일반적인 세포 인자 세트와 비교하기 위해 외부 연구를 수행하는 것입니다. 이는 서로 다른 병원체 변이체에서 단백질의 잠재적인 상호 작용 파트너를 식별하기 위해 cDNA의 두 가지 하이브리드 스크리닝인 짝짓기 기반 효모를 통해 달성됩니다. 두 번째 단계로, 상호 작용하는 파트너의 열린 판독 프레임은 시퀀싱되고 추가 검증을 위해 호환되는 벡터로 전송됩니다.

다음으로, 두 가지 하이브리드 스크리닝 모두에서 나타나는 개별 파트너 세트를 선택하고 연구된 전체 균주와의 상호 작용에 대해 재테스트합니다. 이는 강력한 비교 상호 작용 데이터 세트를 제공하기 위해 포유류 세포에서 수행되는 직교 gia, luciferase 기반 단백질 단편 보체 분석을 사용하여 수행됩니다. 결과는 얻은 루시페라아제 측정에 따라 병원체 단백질과 세포 단백질 간의 상호 작용 강도가 다르다는 것을 보여주며, 따라서 병원체 숙주 단백질 단백질 상호 작용에 대한 비교 개요를 제공합니다.

계층적 클러스터링에 의한 상호 작용 프로파일의 처리는 특정 숙주 병원체 상호 작용과 병리학적 특성의 상관 관계를 파악하고 병원체 단백질이 발병기전에 관여하는 것에 대한 통찰력을 제공합니다. 병원체 숙주 단백질 단백질 상호 작용을 매핑하는 다른 방법에 비해 이 접근 방식의 주요 장점은 여러 균주 변이 간에 엄격한 비교 상호 작용 데이터 세트를 제공한다는 것입니다. 이 기술은 병원체 단백질의 상호 작용 네트워크에 대한 통찰력을 제공하지만, 완전한 바이러스 및 강 유전학을 사용하여 감염 분자로 다른 시스템에 적용할 수도 있습니다. 예를 들어, 서면 프로토콜 종자에 설명된 대로 효모 세포를 짝짓기 및 퍼뜨리는 것으로 이 프로토콜을 시작합니다.

병원체 단백질을 발현하는 P-G-B-K-T 7 플라스미드로 형질전환된 AH 1 0 9 효모 균주의 콜로니가 거의 없는 트립토판이 없는 30밀리리터의 선택적 드롭아웃 배지. 섭씨 30도에서 30시간 동안 교대로 배양합니다. 다음 종자, 200 밀리리터의 선택적 드롭 아웃 매체에서 30 밀리리터의 AH 1 0 9와 트립토판을 뺀 배지.

배양물은 섭씨 30도에서 20시간 동안 회전하면서 배양합니다. 또한 인큐베이트 CDNA 라이브러리는 Y 187을 20 밀리리터의 YP 접착제로 30 °C에서 10 분 동안 회전으로 변형시켰다. 그런 다음 동일한 양의 생존 가능한 Y 187 효모 세포에 해당하는 PG BK T 7 형질전환된 AH 109 배양물을 3, 500RPM 및 20°C에서 5분 동안 원심분리합니다.

상층액을 조심스럽게 빼내고 Resus는 10ml의 YP 접착제로 입천장을 매달아 놓습니다. 재현탁된 AH 109 효모를 Y 187 함유 라이브러리와 혼합합니다. 50밀리리터 튜브로 옮긴 후 3, 500RPM 및 섭씨 20도에서 5분 동안 원심분리합니다.

슈퍼 dat Resus를 조심스럽게 꺼낸 후 펠릿을 YP 접착제에 매달아 총 1.5밀리리터를 얻습니다. 다음으로, 효모를 3 개의 YCM 한천, 150mm 플레이트에 플레이트당 0.5ml씩 펴고 섭씨 30도에서 4.5시간 동안 배양합니다. 레이크 유리에 류신, 트립토판, 히스티딘을 뺀 10ml의 선택적 드롭아웃 배지를 긁어내어 YCM 플레이트에서 짝지어진 효모를 수집합니다.

동일한 매체 5ml로 플레이트를 두 번 헹구고 3, 500RPM 및 섭씨 20도에서 5분 동안 원심분리 후 풀링합니다. 상등액과 reus를 버리십시오. 효모 펠릿을 5ml의 선택적 드롭아웃 배지에서 류신, 트립토판, 히스티딘을 뺀 상태로 현탁시킵니다.

그런 다음 짝을 이룬 효모를 류신, 트립토판 및 히스타민을 뺀 선택적 탈락 한천 10개 플레이트에 펴 바르고 자동 활성화 테스트에서 결정된 대로 3개의 아미노 트리아졸 또는 3개의 적절한 농도로 보충합니다. 서면 프로토콜에 설명된 대로 가습된 분위기에서 섭씨 30도에서 6일 동안 배양한 후 이배체 속도를 계산합니다. 효모 콜로니를 선택하고 선택적 드롭아웃 한천에서 류신, 트립토판, 히스티딘을 뺀 후 3개의 a t를 뺀 신선하게 준비된 플레이트로 옮깁니다.

96웰 플레이트를 재현하는 12웰의 8개 레인으로 구성된 계획으로 효모를 주문하면 나중에 염기서열분석이 더 쉬워집니다. 효모 군체가 가습된 대기에서 섭씨 30도에서 4-5일 동안 자라도록 합니다. 이 섹션의 목표는 선택적 드롭아웃 한천에서 성장한 용해된 효모 콜로니의 두 벡터에서 류신, 트리토판 및 히스티딘 플레이트를 뺀 PA ct에 포함된 CDNA를 PCR하고 증폭하는 것입니다.

먼저 얼음 위에 96웰 PCR 플레이트를 놓고 xmal 20 T 용액 웰당 50마이크로리터의 효모 세포를 라이스합니다. 웰당 하나의 콜로니를 부드럽게 다시 매달아 놓습니다. 플레이트를 섭씨 37도에서 15분, 섭씨 95도에서 15분 동안 배양합니다.

플레이트를 얼음 위에 다시 놓은 후 위아래로 피펫팅하여 웰 믹스당 50마이크로리터의 증류수를 추가하고 3, 500RPM 및 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리를 진행합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 X 택 혼합물을 준비한 후 96웰 PCR 플레이트에 웰당 40마이크로리터의 혼합물을 분배합니다. 웰당 10마이크로리터의 용해된 효모를 추가하고 텍스트 프로토콜에 나열된 대로 증폭을 수행합니다.

PCR 양성 클론을 검출하기 위해 1.2%agros 겔에 3마이크로리터의 PCR 제품을 실행합니다. 3개의 양성 클론에서 분리된 PCR 증폭 단편의 염기서열을 분석합니다. 그런 다음 blast 분석을 수행하여 세포 개방 판독 프레임을 식별하고, 세포 transfection 전에 염기서열을 포함하는 프레임시프트 및 조기 중지 코드뿐만 아니라 낮은 신뢰도 정렬을 폐기합니다.

병원체 단백질 및 세포질 단백질 열려있는 독서 구조를 그들의 각각 벡터로 옮기십시오 350, 항생제 없이 10%fetal 소 혈청을 가진 DMEM의 밀리리터 당 000 세포에 원본 의정서 씨 2 9 3 T 세포에서 선술된 것과 같이 Gaia luciferase의 파편에 융합된 단백질을 생성하기 위하여 세포를 엽니다. 멸균 백색 배양 플레이트에 웰당 100마이크로리터를 분배한 후 다음 날 5%의 이산화탄소로 섭씨 37도에서 24시간 동안 성장합니다. 적절한 transfection 프로토콜을 사용하는 transfection 세포는 병원균 및 숙주 개방형 판독 프레임 플라스미드 둘 다 웰당 100나노그램을 사용하여 transfection 효율을 정규화하기 위해 CMV 반딧불이 루시페라제 플라스미드를 웰당 10나노그램씩 transfection합니다.

각 포인트는 배양된 2 9 3 T 세포의 플레이트에 대한 삼중 전달 형질주입 혼합물로 테스트됩니다. 2, 9, 3 T 세포는 강하게 부착되지 않고 웰 배양 인큐베이터에서 24-30 시간 동안 세포 배양 인큐베이터에서 24-30 시간 동안 웰 당 100 마이크로 리터의 PBS로 PBS로 5 % 이산화탄소 세척 셀을 배양하므로 DNA 혼합물을 세포에 부드럽게 증착시키도록주의하십시오. 40마이크로리터의 1 x 바닐라 용해액, 완충액을 넣고 실온에서 30분 동안 배양합니다.

교반 하에서, 가이아 활성을 측정하기 위해 섭씨 4도 또는 천장이있는 섭씨 20 도에 저장된 반딧불이 루시 페라아제의 후속 투여를 위해 다른 흰색 플레이트에 10 마이크로 리터의 세포 용해물을 저장하십시오. 플레이트를 광도계에 놓고 100마이크로리터의 바닐라 루시페라제 분석 시약을 세포 용해물에 주입합니다. 그런 다음 10초 동안 발광을 계산합니다.

96 웰 플레이트의 복용량은 약 30 분이 걸립니다. 냉동 또는 장기 보관은 나머지 10마이크로리터 세포 추출물에 대한 상호 작용 매개 가이아 활성에 영향을 미칠 수 있으므로 항상 신선한 추출물을 사용하십시오. 50마이크로리터의 반딧불이 루시퍼라제 분석 시약을 발광계를 사용하여 세포 용해물에 주입하고 10초 동안 발광을 계수합니다.

96웰 플레이트의 투여량은 각 상호 작용에 대해 약 30분이 걸립니다. 정규화된 GAIA 발광 값을 얻기 위해 Gaia luciferase 활성과 반딧불이 luciferase 활성 간의 비율을 계산합니다. transfection 효율성과 세포 생존율을 고려합니다.

상호 작용을 모니터링하기 위해 삼중의 평균을 계산합니다. 각 병원체 숙주 쌍에 대해 정규화된 발광 비율 또는 NLR을 추정합니다. 이를 위해 병원체와 숙주 단백질이 모두 존재할 때 감지된 정규화된 GAIA 발광 활성을 대조군 우물에서 측정된 활성의 합으로 나눕니다.

긍정적인 상호 작용에 대한 NLR 컷오프 값은 이전 연구에서 약 3.5로 추정되었습니다. 고처리량 GIA 프리셉트, 단백질 보완 분석 또는 H-T-G-P-C-A의 주요 강점은 위음성 비율을 결정하기 위해 HPVE 두 단백질에 대한 위양성 및 위음성 비율 평가에서 알 수 있듯이 높은 민감도에 있습니다. HPV 16에서 E의 알려진 상호작용 2건은 H-T-G-P-C-A에 의해 평가되었으며, 18건의 상호작용 중 4건은 회복되지 않았으며, 이는 22%의 위음성률에 해당한다.

위양성 상호작용은 무작위 세포 단백질 세트에 대해 12개의 HPVE 2개 단백질을 사용하여 5.8%로 측정되었습니다. 이 방법의 강력한 특이성은 이 그림에서 강조되어 세포 파트너인 BRD 4에 대한 E 2 결합을 방해하는 것으로 알려진 단일 점 돌연변이가 NLR 비율을 소멸시킨다는 것을 보여줍니다. 이 대규모 비교 외피 접근법은 최근 인유두종 바이러스의 3가지 초기 단백질인 E 2, E 6 및 E 7에 성공적으로 적용되었으며, 이는 서로 다른 유전자형에서 유래했으며, 이는 각 초기 단백질의 영양성 및 병리학의 자연적인 다양성을 나타냅니다.

상호 작용 프로파일의 계층적 클러스터링은 대부분 HPV 계통 발생을 요약하여 접근 방식의 견고성과 상호 작용 데이터 세트의 이점을 입증합니다. 특정 바이러스 숙주 상호 작용 프로파일과 병리학적 특성을 연관시키는 데 사용할 수 있으므로 바이러스 단백질의 관여에 대한 단서를 제공할 수 있습니다. 발병기전에서는 유전자형 특이적 상호작용을 추출할 수 있으며, 이는 잠재적으로 tropism 또는 병원성 바이오마커에 해당합니다.

여기에서 E 6개의 상호 작용 파트너에 대해 설명된 바와 같이, 세포 표적은 상호 작용 강도에 따라 분류되고 상호 작용하는 HPV 유형에 따라 그룹화되었습니다. 이 표현을 통해 발암성 HPV의 E 6개 단백질과만 상호 작용하는 fad와 같은 특정 바이오마커를 식별할 수 있습니다. 이러한 표적화는 모든 발암성 HPV의 발암성 형질에 결정적이어야 하며, 따라서 HPV 감염에 대한 대리 마커 또는 치료 표적으로 사용할 수 있는 좋은 후보를 구성합니다.

이 절차를 따릅니다. H-T-G-P-C-A는 비오틴 태그와 융합체로 발현되는 세 번째 단백질과 함께 사용하도록 조정할 수 있습니다. 이를 통해 연쇄상구균 다이빙 컬러 플레이트에서 3개의 파트너 복합체를 캡처할 수 있으며, 이는 큰 단백질 복합체의 형성에 대한 질문에 답할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 병원체, 숙주 냄비 상호 작용을 특성화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 셋째, 여러 균주 변이체의 상호 작용 파트너를 조사합니다. 둘째, 포유류 세포에서 단백질 지속 시간을 사용하여 전체 병원체 유형과의 상호 작용을 비교합니다.