사용 생체 내 이미징 신생아의 실험 쥐 거대 세포 바이러스 감염의 진행 상황을 모니터링 할 수

이 절차의 전반적인 목표는 마우스 신생아의 생체 내 이미징을 수행하여 발광 거대세포바이러스의 전파를 조사하는 것입니다. 이는 먼저 원액에서 바이러스를 적절하게 희석하여 준비함으로써 수행됩니다. 다음으로 신생아에게 발광 MCMV를 복막강에 주입합니다.

주입 후 시점에서. 새끼는 생체 내 이미징 전에 마취되고 루시퍼를 주입됩니다. 궁극적으로, 생체 내 이미징은 복막강과 중추 신경계에서 바이러스의 복제 및 전파를 보여주고 정량화하는 데 사용됩니다.

감염된 동물을 안락사한 후 장기에서 바이러스를 여과하는 것과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 시간과 자원이 덜 소비된다는 것입니다. 이 과정을 시연하는 사람은 제 연구실의 기술자인 마칸 Mr.Il( Macan)입니다. Ulrich Kowski 실험실에서 얻은 Luciferase를 발현하는 MCMV 균주를 다음 연구에서 사용합니다.

균주를 증폭하려면 섭씨 37도의 무혈청 배지에서 배양된 세포에 바이러스를 첨가합니다. 1시간 후, 상층액을 제거하고 10%의 태아 송아지 혈청이 보충된 DMEM으로 교체하십시오. 5일 후, 배양액을 수확하고 분취액을 영하 80도에서 보관합니다.

더 사용할 때까지. 플라크 분석으로 바이러스 현탁액을 적정한 후, 50마이크로리터의 DMEM에서 샘플을 50pfu로 희석하고 4시간에서 20시간 사이의 신생아에서 주사를 사용할 준비가 될 때까지 얼음에 그대로 둡니다. 새끼를 다루기 전에 장갑을 낀 손으로 배설물과 배설물을 조작하십시오.

산모가 연습 주사를 맞도록 스트레스를 줄 수 있는 외부 냄새가 나는 것을 피하려면 DPBS로 희석된 1% 메틸렌 블루를 인슐린 주사기에 채웁니다. 준비가 되면 여기에서 볼 수 있듯이 복부 쪽이 위로 향하게 하여 신생아의 등 피부를 잡습니다. 네 다리 아래에 바늘을 삽입하고 복막강에 피하로 부드럽게 밀어 넣습니다.

바늘 끝이 올바른 위치에 있으면 메틸을 파란색으로 주입합니다. 그런 다음 천천히 바늘을 빼내고 주사 부위의 혈액을 닦아냅니다. 성공적인 연습 주사 후 주입 후 신생아를 가정용 케이지로 다시 되돌리고 이전에 준비한 바이러스 현탁액으로 이 절차를 반복합니다.

이미지는 주사 후 7일 후에 촬영되며, 앞서 보여준 것처럼 신생아를 조심스럽게 다루고 있습니다. 12-15분 동안 기다리는 동안 마취제와 루시퍼의 혼합물을 각각 주입합니다.루시퍼리안이 최대 방출에 도달할 때까지 이미징 장치의 획득 챔버에 있는 플랫폼이 올바른 체온을 유지하기 위해 가열되었는지 확인합니다. 새끼를 마취하고 식별을 위해 태그를 붙인 후 이미징 시스템에 배치할 준비가 된 것입니다.

먼저 몸 전체에서 방출되는 빛을 획득합니다. 바이러스는 여러 표적 장기에서 복제되었기 때문에 노출 기간은 짧아야 합니다. 여기서 획득은 10초에서 20초 동안 수행됩니다.

한 번의 획득 라운드 내에서 여러 동물의 저해상도 이미지를 얻은 다음 특정 동물의 한 부분이나 해부 후 격리된 장기에 초점을 맞추기 위해 플랫폼을 더 가깝게 이동하는 것이 도움이 됩니다. 머리에서만 광 신호를 획득하려면 광자를 가리는 두껍고 어두운 종이로 몸의 나머지 부분을 덮고 5-10분 동안 수집을 수행한 다음 동물의 반대쪽에 대해 이 작업을 반복합니다. 같은 조건에서.

이미징 후 새끼는 마취된 동안 체온을 유지하기 위해 가열된 케이지로 돌아갑니다. 이 이미지는 감염 후 7일, 9일, 11일, 14일에 촬영되었으며, 동물의 전반적인 바이러스 역가는 시간이 지남에 따라 감소하는 것으로 보입니다. 이 예에서는 몸이 덮이고 머리가 노출됩니다.

이는 왼쪽 귀 수준에서 7일째에서 14일 사이에 강도가 증가하는 눈에 띄지 않는 점을 보여주며, 이는 MCMV의 뇌 전파가 생체 내에서 동적으로 관찰될 수 있음을 시사합니다. 이 절차에 따라 뇌에서 바이러스의 정확한 위치에 대한 추가 질문에 답하기 위해 면역조직화학과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.