Name: 마우스의 유전자 조작을 통해 시상 하부 개발 자궁 내 일렉트로 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: 배우세요 마우스 시상하부 유전자 조작을 위한 자궁내 전기천공법을 활용한 신경발생 연구 방법입니다. 이 기술은 생체 내에서 특정 유전자 기능을 활성화하거나 억제하여 뇌 발달 메커니즘을 규명하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 독일 연구 재단 (도이치 Forschungsgemeinschaft)에 의해 재정 지원되었다.

1. 주사 DNA 유리 마이크로 피펫의 준비 <ol><li> 좋은 품질의 유리 마이크로 피펫은 양수의 손실로 인해 초기 높은 낙태 비율을 줄이기 위해 필수적입니다. 유리 마이크로 피펫을 당겨하는 절차가 잘 13,18,25를 기록하고있다. 열 = 300; 1.2 mm 직경의 모세관을 사용하여 설정 P = 500와 기존의 셔터에 P-97 장치를 뽑아 = 40을 당겨 속도 = 50; 시간 = 50. 3mm &quot;구유&quot;필라멘트 (셔터 악기 FT330B)와 풀러 맞 춥니 다. 2mm 크기의 필라멘트는 우리 덜 만족스러운 결과를 굴복했다. 한편, 마이크로 피펫 팁의 경사지는 것은 우리에 대한 결과를 개선하지 않는 것. </li><li> 1 ~ 2 ㎍ / μL의 최종 농도에 녹색 빠른 0.1 %를 포함하는 PBS의 정화, 독소 무료 플라스미드 DNA를 (세포 배양 학년) 녹입니다. 빠른 그린은 배아 뇌의 뇌실에서 볼 수 주입 솔루션을 만들 것입니다. </li><li> 유리 micropipette를에 DNA 용액 10 μl를로드합니다. </lI&gt; <li> 분사 시스템 (피코 펌프)이나 입 피펫에 유리 micropipette를 연결합니다. </li></ol> 2. 마취 가열 패드와 수술기구와 수술 테이블을 준비합니다. 배아의 시각화를 촉진하는 차가운 광원을 켭니다. 예를 유리 구슬 살균기에 사용 수술 도구를 소독. 세 가지 마취 절차는 (토론 참조)이 프로토콜에 대한 가능합니다. 여기에서 우리는 우리가 (유량 0.5 L / 분) 마취 유도를 위해 isoflurane을 흡입을 사용하여 최선을 고려해야 하나뿐만 아니라 유지 보수 (유량 1 L / 분)를 설명합니다. <ol><li> 튜브의 짧은 길이로 Komesaroff 마크 5 마취 장치에 연결 (그래서 마우스가 계속 표시) 투명한 작은 용기에 임신 마우스를 소개합니다. </li><li> isoflurane을 가진 기화기를 기입 한 후 장치에 연결된 산소 병을 엽니 다. isofl 중 하나 또는 두 개의 펄스를 날려urane / 마취 안으로 설정하는을위한 마우스와 시계를 들고 용기에 산소 (0.5 L / 분) </li><li> 그들을 건조 방지하고 즉시 머리에 흐름 마취 마스크를 맞게 연고 눈을 커버, 마우스를 꺼내. </li></ol> 3. 개복술 <ol><li> 가열 패드 (그렇지 않으면 그것의 몸의 온도가 회복의 기회를 감소, 매우 빠르게 내려 갈 것이다)에 최대 배꼽에 마우스를 놓고 테이프로 옆으로는 네 다리를 고정하여 제자리에 그 몸을 고정합니다. 반사 자극 (회사의 압력 예를 들어, 발가락이나 꼬리 핀치)에 대한 응답의 손실을 확인하여 마취의 깊이를 평가합니다. </li><li> 복부 표면을 면도 iodophorpovidone 요오드 (Braunoderm)로 소독. </li><li> 복부 피부에 종 절개 (1-1.5 ㎝ 길이)를 확인합니다. 그런 복막를 잘라. 절개 주위에면 거즈를 놓습니다. 하나의 자궁을 표시하고 PBS-씻어서 gauz에 무딘 집게로 조심스럽게 잡아 당깁니다전자. 매우 자주 그것은 항상 (그림 2A와 2B) 촉촉한 유지하기 위해 PBS와 자궁을 씻어. 전체 절차를 수행하는 동안 자궁 내부의 높은 압력이 낙태의 결과로 주입시 유체의 손실의 가능성을 증가 배아를 전송합니다 때문에, 꽉 mesometrium 또는 자궁을 당겨 마십시오. </li></ol> 4. 뇌 심실로 DNA 주입 <ol><li> 뇌의 뇌실을 시각화 할 수있는 방식으로 자궁을 누릅니다. 광범위하게 불리한 위치에 놓여 태아의 위치를​​ 변경하지 마십시오 - 이것은 낙태의 가능성을 증가시킵니다. </li><li> 정상에서 배아의 머리를 보면, 왼쪽과 오른쪽 대뇌 반구 사이의 시각 차이 또는 균열을 집중. 반구 구별하기 쉽고 그 안에서 측면 심실은 (을 대상으로하지 않은) 보통 다소 어두운 모양으로 인식 할 수 있습니다. 배아 (넘겨 준다 DNA 주입을 위해 완벽 지향이 발견 된 경우에스 2C와 2D)는, 그것을 관통하여 자궁 벽에 가능하며 한 번에 세 번째 뇌실을 입력합니다. 약 1mm 대한 침투, 자궁 벽과 대뇌 피질 반구 사이의 간격의 주동이의 끝 부분에 구멍을 45 °로 유리 micropipette를 잡으십시오. 이러한 방법으로 유리 마이크로 피펫의 끝은 뇌 (안 뇌실) (그림 2C와 2D)의 세 번째 뇌실로 들어갑니다. 이 배아의 머리 근처에서 첫 번째 구멍을 뚫어 질 벽 (항상 45 °에서)에 유용 덜 호의적 중심의 배아에서 대뇌 피질 반구 사이의 올바른 위치에 micropipette의 팁을 배치하고 단지 그 후에 뇌를 관통. 세 번째 뇌실 (좋은 주사 녹색 액체가 뇌실을 채우고)에 DNA 용액 1 μL에 대해 주입. 하나의 자궁 뿔의 배아와 동일한 절차를 반복합니다. 이 DNA 솔루션에 대한 약간의 시간이 심실 유체로 균일하게 혼합 entir에 도달 할 수 있습니다전자 neuroepithelium. </li></ol> 5. Electroporation에 대한 시상을 대상으로 <ol><li> 에 electroporator를 전환하고 배아 나이 (E12.5 위해 우리는 5 구형파 펄스를 사용하여, 50 V, 50 밀리 ON/950 밀리 초 OFF)에 따라 설정을 조정합니다. 양극 스테인레스 스틸 바늘 전극 (CUY550-10)로하고 부정 극 원형 평면 전극 (CUY700P4L)로 사용합니다. (그것은 그렇지 않으면 현재 그냥하지만​​ 그것을 통해 배아 주위에 흐르고 있기 때문에 전극, 배아보다 작은 것이 중요합니다.) </li><li> electroporation에 대한 그의 지느러미 쪽 (즉, 실험을 향하고)까지이다 (입니다 대부분으로) 그 배아를 선택하고, 그 방향으로 유리한되지 않은 버립니다. 그것은 에탄올 소독 손가락이나 장갑으로 자궁을 만지지 지금은 안전합니다. 집게와 자궁을 잡고, 그러나, 일렉트로 동안 전류의 흐름을 방해한다. </li><li> 피어스 AMN 사이에 태아의 머리에 의해 자궁 벽바늘 전극의 끝으로 그것을 통해 아래로 밀어하여 iotic 주머​​니와 태반. 스러스트 블록으로 다른 손의 집게 손가락을 사용합니다. 전극의 끝 부분의 약 5 mm은 중뇌 (그림은 2E 및 2 층) 약 수준에서 양막 낭과 자궁 벽 사이에 지금 있어야합니다. 이 &quot;표적 전극&quot;, 그래서 그것의 위치는 시상 하부 neuroepithelium의 일부 형질을받을 가능성이 가장 높은 결정됩니다 것을 기억하십시오. 태아는 매우 부드럽게 전극 사이에 &quot;압박&quot;으로되어 있습니다. </li><li> 다른 한편으로, 위치에 태아의 머리 (그림의 2E와 2G)의 반대편에 자궁 벽의 외부 둥근 편평한 전극. </li><li> (950 밀리 초 OFF, 5 구형파 펄스 50 V, 50 밀리 초) 전압을 적용 페달 스위치를 사용합니다. </li><li> 다른 손의 검지 손가락으로 자궁을 다시 잡고 천천히 자궁의 바늘 전극을 당겨 - 만약 양수 검진TIC 액체가 구멍이 벽을 통해 손실, 일반적으로 배아 낙태를 받게 될 것이다. 모든 배아와 절차를 반복합니다. </li><li> 복부에 자궁 경적을 반환하고 남은 경적 주사와 일렉트로를 반복합니다. </li></ol> 6. 수술 마무리 <ol><li> 모든 배아의 주입과 electroporation을 한 후, 그들은 그것을 닫기 전에 식염수로 복강 전에 촉촉하고 있었다 정확하게 위치, 아주 조심스럽게 복부에 다시​​ 자궁을 배치합니다. </li><li> 외과 장선 (Vicryl Polyglactin 910, 5-0, ETHICON V4914)와 복막을 봉합. 피부 사용의 폐쇄 methodwith 대한 저항력이 봉합 (Supramid 나일론, 6-0, Serag Wiessner 07171L TO) &quot;스티치 중단&quot;. </li><li> 포비돈 요오드 (Braunoderm)와 복부 표면을 소독 비 스테로이드 피하 항염증제 (예 : 0.9 % 염화나트륨의 Rimadyl의 1:10 용액 100 μL) 또는, 더 나은, 부와 같은 아편 주사prenorphine (Temgesic, 0.9 % 염화나트륨의 0.05-0.1 ㎎ / ㎏ 체중)은 통증을 완화한다. </li><li> 마취 기계에서 어머니를 제거하고 가열 패드에 의해 가열 케이지에 넣습니다. 완전히 마취에서 회복 될 때까지 계속 마우스를 모니터링 할 수 있습니다. 나중에, 그들은 감염이나 고통의 흔적없이 프로 시저에서 복구하는 보장하기 위해 매일 동물을 확인합니다. </li></ol> 7. 결과 분석 <ol><li> 분석 원하는 날짜에 따라 배아 (또는 postnatals) 수확. 출생 마우스 (1 - 2 일 이전)는 잘린에 의해 살해된다. </li><li> 이전 electroporation의 주석에 따라 모든 배아를 분리합니다. 입체 현미경 하에서 뇌를 해부하고 해당 지역의 녹색 형광 신호 (GFP 기자에서)에 대한 현미경으로 확인합니다. </li><li> 선택한 두뇌는 &quot;신선한&quot;을 분석 할 수있다 : 4 % 파라 포름 알데히드에 짧은 시간 동안 조직을 수정하고 아가 4 % 또는 젤라틴에 포함lbumin 후 vibratome 형 장치 부분 (그림 3). 더 자세한 면역 분석 (그림 4), 10 설치 매체 (조직 테크)에 포함 30 % 자당 용액에 뇌를 극저온 보호는 그라 이오 스탯에 20 μm의 섹션을 잘라. </li></ol>

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</ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

마취 소개 : 시상 하부에 자궁의 electroporation 기술적으로 험난 할과 긴 마취 시간을 필요로 할 수 있기 때문에, 우리는 산소와 isoflurane을의 혼합물의 관리를 통해 마취를 유도하고 유지하는 것을 선호합니다. 우리의 경험에서, 동물, 적어도 어머니의 회복이 매우 빠르고, 배아 생존율이 향상 1 시간까지의 기간 동안이 방법으로 적절한 마취 남아있을 수 있습니다. 마취 다른 방법도 사용할 수 있습니다. 가장 간단한 절차를 복강 내 주사하여 마취를 유도하고 유지 관리하는 구성 2.5 0.9 밀리리터 / 케타민 (25 밀리그램 / ML), Xylazin (1.2 ㎎ / ㎖) Acepromazin (0.35 밀리그램 / ML)의 혼합물 체중 kg % 멸균 염화나트륨 ( &quot;트리플 콤보&quot;). 혼자 혼합물로, 여기에서 권장 용량에서 약 30 분 (일부의 경우 최대 45 분)의 마취가 유도된다. 이것은 일반적으로 충분한 E12.5에서 피질로 자궁의 electropo...

배아 마우스 뇌의 유전자 조작은 개발 규제에 대해 배울 수있는 바람직한 방법입니다. 돌연변이 마우스 라인의 세대는 그러나 느리고 비싸다. 포유류의 뇌의 뉴런을 개발 특정 유전자 변화를 소개하는 하나의 강력한 방법은 자궁의 electroporation에 있습니다. 기본적으로, 기술은 그 배아는 일정 시간 동안 생존 뇌를 수집하고 가능한 한 소설, 정보 표현형을 위해 그 (것)들을 검사 할 수있는 전기 펄스에 의해 배아 뇌 neuroepithelium에 DNA를 형질로 구성되어 있습니다. 이러한 방법으로, 실험 마우스 돌연변이의 생산에 필요한 긴 대기 기간없이 즉시 가설을 테스트 할 수 있습니다. 개발 배아에 DNA의 형질 전환 병아리 배아 1 비켜 electroporation을에 시작했다. 마우스 증명 (proof-of-concept) 필수는 문화에 수행 된 <s2&gt;까지. 이것은 곧 자궁 3,4에서 마우스 기술의 첫 번째 설명으로 이어졌습니다. 주요 문제는 그 (것)들 또는 어머니를 죽이지 않고 자궁에서 개발 태아의 두뇌를 형질하는 것입니다. (개복술, 사출, 일렉트로) 필요한 수술을 배우는 것은 긴 훈련 기간이 필요합니다. 수술은 태아의 생존 비율이 허용되는 지점을 마스터하고 나면, 그 다음 중요한 질문은 뇌 구조에 액세스 할 수있는? 당연히 자궁의 electroporation에서 얻은 결과를 보여주는 첫 번째 발표 논문 대뇌 피질의 개발 5-9에 집중했다. 수술에 가장 접근 개발에 마우스 뇌의 영역은 피질 (그림 1)이기 때문에 이것은이 기술을 사용하여 출판물의 대부분을 여전히 사실이다. 피질에 자궁의 electroporation에 대한 절차는 설명했습니다인쇄 10 비디오 11~14인치 기술의 수정은 telencephalon의 복부 부분 기저 신경절 15를 대상으로 할 수 있습니다. telencephalon 이상, 간뇌는 (고전 시상과 시상 하부로 분할)에 도달하기 어려운 전뇌의 영역이다. 그 지느러미와 가장 접근 부분 시상 16-19의 대상 논문 보고서의 작은 숫자입니다. 시상 하부, 전뇌의 대부분의 복부 부분 때문에 하나의 지느러미 표면 (피질) (그림 1) 가장 깊이 지역화. 이 지역은 유전자 자궁에서 마우스 뇌를 조작하기 위해 최선을 다하고 연구자를위한 어려운 과제로 남아. 우리의 지식에, 극소수의 기사는 마우스의 시상 하부 20,21으로 자궁 형질에서의 결과를보고합니다. 그러나 시상 하부 canno의 기능적 중요성그것은, 짝짓기, 번식 및 양육 22 먹고 마시는 같은 행동을 조절 때문에 t은 아무리 강조해도 지나치지. 또한, 시상 하부 개발의 변경은 나중에 비만, 고혈압, 당뇨병 및 조숙 한 사춘기 23과 같은 생활 조건의 발생에 기여한다. 개발하는 동안 유전자 시상 하부를 변경할 수 있다는 것은 이해하기 위해 매우 강력한 도구를 제공 할 것입니다. 우리가 사용하는 임신 한 쥐의 개복 수술에 대한 기본적인 수술 프로토콜은 다른 프로토콜 11,13,14,24에서 사용하는 것과 비슷합니다. 우리는 완전성에 대해 간략히을 설명합니다. 우리의 절차의 핵심, 다른 한편으로는, 마취의 종류, 주입 위치, 전극의 종류와 삽입 및 태아의 머리에 대하여 긍정적 인 전극의 위치입니다. 전자는 대한 수 있기 때문에 우리는 간단한 복강 내 마취를 통해 가스 흡입 마취를 유도하고 유지하는 것을 선호마취의 다소 긴 기간은 어려운 수술이 필요합니다. 마취에서 빨리 회복 isoflurane을 흡입 결과, 일반적으로 어머니가 이미 수술 후 분 정상 동작을 보여줍니다 때문이다. 유리 micropipette를 가진 DNA 용액의 주입 쉬운 점은 그러나 시상 하부 electroporation을 위해 완전하게 적합하지 않은 측면 뇌실입니다. 직접 뇌실에 주입 참으로 깊은 diencephalic 구조를 대상으로 중요합니다. 이것은 표준, off-the-shelf 전극 E12.0 또는 E12.5에서 시상 하부 형질 할 수 있습니다. 우리는 특히이 목적에 적합 NEPA 유전자 (치바, 일본)에 의해 제조 된 전극의 일부를 발견했다. 우리의 절차를 우리는 전체 시상 하부 neuroepithelium 또는 전극 방향에 따라 부분, 지역 형질의 형질을 구하십시오. 여기에서 우리는 틀림없이, mammillary 몸 형질하여 기술을 보여깊은 모든 시상 하부 핵의 가장 오목한. 또한, 우리는 해상도 세포 수준에 형질 전환 세포의 자세한 조직 학적 분석을 보여줍니다. 자궁에서 마우스 두뇌 개발을 형질에 대한 다른 접근 방법 자궁의 electroporation에서의 비교 토론 섹션에서 찾을 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>REAGENTS</td></tr><tr><td>Acepromazine</td><td>Sanofi GmbH</td><td></td><td>마취제</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>HDG9623</td><td>마취제</td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>Pharma GmbH</td><td></td><td>마취제</td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Fluka</td><td>44715</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Rimadyl</td><td>Pfizer</td><td></td><td>비스테로이드성 항염증제</td></tr><tr><td>Braunoderm Braun</td><td></td><td>3887138</td><td>포비돈-요오드</td></tr><tr><td>인산염 완충액 식염수 PBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Temgesic (buprenorphine)</td><td>Essex Pharma</td><td></td><td>오피오이드 진통제</td></tr><tr><td>눈 연고</td><td>Pan-Ophtal</td><td>7136926</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>자일라진</td><td>바이엘</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Anaesthetic Device Komesaroff Mark-5</td><td>Medical Developments Australia</td><td>ACN 004 903 682</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>모세관 끌어당기는 사람 P-97</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Compresstome</td><td>Precisionary Instr.</td><td>VF-300</td><td>진동형 장치</td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Zeiss</td><td>LSM700</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>저온 유지 장치</td><td>라이카</td><td>CM3050S</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Electroporator</td><td>Nepa Gene Co. Ltd. (전기천공기 Nepa Gene Co., Ltd.)</td><td>CUY21EDIT</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>전극 1</td><td>Nepa Gene Co., Ltd.</td><td>CUY550-10</td><td>스테인레스 스틸 바늘 전극, 10mm 팁, 0. 5mm 직경.</td></tr><tr><td>전극 2</td><td>Nepa Gene Co., Ltd.</td><td>CUY700P4L</td><td>커버 라운드 플래티넘 플레이트 4 mm 직경</td></tr><tr><td>광섬유 콜드 라이트 소스</td><td>Leica</td><td>KL2500 LCD&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>유리 모세관</td><td>Harvard Apparatus</td><td>GC120T-15</td><td>1. 2mm O.D. x 0. 94mm I.D.</td></tr><tr><td>유리 구슬 살균기</td><td>파인 사이언스 툴</td><td>FST250</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>히팅 패드</td><td>하버드 장치</td><td>py872-5272</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>주입 장치</td><td>세계 정밀 기기</td><td>공압 피코 펌프 PV820</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>봉합사 코팅 Vicryl</td><td>Ethicon</td><td>V4914</td><td>복막 봉합</td></tr>사 봉합사 <tr><td>Thr. Supramid</td><td>Serag Wiessner</td><td>TO07171L</td><td>피부 봉합사</td></tr></tbody></table>

마우스의 유전자 조작을 통해 시상 하부 개발<em&gt; 자궁 내</em&gt; 일렉트로

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

개발 포유류 뇌의 특정 영역의 유전자 변형은 매우 강력한 실험적인 방법입니다. 그러나 새로운 마우스 돌연변이를 생성하는 것은 종종 절망적 느립니다. 그것은 합리적인 포스트 치료실 생존 자궁에서 발전 마우스 뇌에 액세스 할 수 있습니다 것으로 나타났습니다. 하지만이 절차의 결과가 두뇌 개발의 가장 피상적 쉽게 접근 할 부분에 거의 독점적으로보고되었습니다 피질 즉. 시상, 좁은보다 중간 지역은, 대상에 대한 더 어려운 입증되었습니다. 특히 깊은 핵, 시상 하부의 사람들로 형질은 가장 도전하기 때문에 거의 결과가보고되었다 아마도. 여기에서 우리는 전체 시상 하부 neuroepithelium 또는 electroporation을 통해 형질 전환을위한 그것의 일부를 (시상 하부 지역) 대상으로하는 절차를 보여줍니다. 우리의 접근에 키는 t의 긴 마취 시간, 주입하다HIRD 뇌실, 적절한 종류와 전극의 위치. 또한, 우리는 대상과 가장 오목한 시상 하부 핵, mammillary 몸의 후속 조직 학적 분석 결과를 보여줍니다.

대부분의 시상 하부 뉴런은 다소 짧아 마우스 개발 27,28로 번역 쥐 26 출생 연대 분석에 따르면, E11.5 사이 E15.2에 태어난다. 시상 하부 신경의 피크 E12.5 29-31에 도달합니다. 따라서, 본 연구 (E12.5)에 대해 선택된 형질의 나이에, 시상 하부 뉴런의 큰 비율은 주어진 rostro - 꼬리 수준에서 표시 할 수 있습니다. 두꺼운 vibratome 유형 섹션에 E18.5에서 분석 (그림 3A 및 3B) 시상 하부 neuroepithelium의 전체 rostro - 꼬리 확장 일렉트로 (그림 3A)에 액세스 할 수 있는지 보여줍니다. 특정 나이에, 뉴런 계보 연구 32과 일치, 모든 메디 - 측면 수준 (그림 3B)에서 표시 할 수 있습니다. mammi...

시상 하부의 기능 및 의료 중요성에도 불구하고,<em&gt; 자궁 내</em개발의&gt; 유전자 조작은 거의 시도되지 않았습니다. 우리는 당신을위한 자세한 절차를 보여<em&gt; 자궁 내</em마우스 시상 하부 총과 부분 (지역) 시상 하부 형질의 쇼 대표적인 결과로&gt; 일렉트로.

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

본 실험 절차의 전반적인 목적은 자궁 내에서 발달 중인 생쥐 배아의 시상하부에 플라스미드 DNA를 형질전환하여 표적 유전자의 기능을 활성화하거나 억제하는 것입니다. 이를 위해 먼저 임신한 생쥐를 마취시키고 개복술을 통해 자궁을 노출시킵니다. 두 번째 단계로, 배아 뇌의 제3뇌실에 DNA 용액을 주입합니다.다음으로, 양극을 태반과 배아 머리 사이의 자궁 내부에 위치시킵니다. 음극은 자궁 외벽에 배치하고 전기 펄스를 가합니다. 마지막 단계는 6일 후에 형질전환된 배아 뇌를 적출하는 것입니다.최종적으로, 형광 현미경을 사용하여 형질전환된 세포의 수, 모양, 위치, 마커 발현 등과 같은 표현형 변화를 분석합니다. 바이러스 형질전환과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 첫째, 특별한 주의 사항이나 두 가지의 시설이 필요하지 않으며, 둘째, 특정 부위를 표적으로 지정하는 것이 가능하다는 점입니다. 셋째, 전기천공법을 이용하면 후보 유전자의 스크리닝 속도가 더 빠릅니다.일반적으로 이 방법이 처음인 연구자는 DNA 용액을 제3뇌실에 주입하고 니들 전극을 적절하게 배치하는 데 고도의 수작업 숙련도와 경험이 필요하므로 어려움을 겪을 수 있습니다. 이 방법은 시상하부 발달 분야, 특히 세포 이동과 관련된 질문뿐만 아니라 개별 영역과 핵이 유전적으로 어떻게 지정되는지에 관한 의문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 양수 손실로 인한 초기 높은 유산율을 줄이는 것이 필수적이므로, 품질이 좋은 유리 마이크로 피펫을 제작하는 것으로 이 절차를 시작하십시오.DNA를 준비하려면, 정제된 엔도톡신 프리 플라스마 DNA를 0.1% fast green이 포함된 PBS에 녹여 최종 농도가 1~2 µg/µL가 되도록 합니다. fast green은 주입된 용액을 배아 뇌실에서 시각적으로 확인할 수 있게 해줍니다. 그 다음, DNA 용액 10 µL를 유리 마이크로 피펫에 충전합니다.그 다음 유리 마이크로 피펫을 주입 시스템 또는 마우스 피펫에 연결합니다. 이 단계에서는 가열 패드와 수술 도구를 사용하여 수술대를 준비합니다. 배아의 시각화를 용이하게 하기 위해 냉광원을 켭니다. 그런 다음 유리 비드 멸균기를 사용하여 수술 도구를 소독합니다.다음으로, 임신한 마우스를 isof fluorine으로 마취합니다. 마우스가 마취되면, 안구 건조를 방지하기 위해 눈에 연고를 바릅니다. 이후 마취 상태를 지속적으로 유지하기 위해 마우스의 얼굴에 마스크를 씌웁니다.이제 마우스를 배가 위로 향하게 하여 가열 패드 위에 놓습니다. 테이프로 네 다리를 고정하여 몸이 움직이지 않게 합니다. 꼬리를 집어 반사 반응을 확인하여 마우스가 완전히 마취되었는지 확인하십시오.그런 다음 복부 표면을 제모하고 요오드 용액으로 소독합니다. 복부 피부에 약 1~1.5 cm 길이의 종절개를 가합니다. 그 후 복막을 절개합니다.다음으로 절개 부위 주변에 면 거즈를 배치합니다. 거즈를 PBS로 헹굽니다. 둔탁한 포셉을 사용하여 자궁각 하나를 조심스럽게 당겨 노출시킵니다.자궁근층이나 자궁을 세게 잡아당기지 않도록 주의하십시오. 자궁 내부의 압력이 높아지면 주입 시 배아 유출 가능성이 증가하여 유산으로 이어질 수 있기 때문입니다. 그 다음, 자궁각을 PBS로 헹군 거즈 위에 놓고, 몇 분마다 PBS로 헹구어 습윤 상태를 유지하십시오.이제 현미경 하에서 뇌실을 시각화할 수 있도록 자궁을 유지하십시오. 불리한 위치에 있는 배아를 과도하게 재배치하지 마십시오. 이는 유산 가능성만 높일 뿐입니다.배아의 머리를 위에서 내려다보며 좌우 대뇌 피질 반구 사이의 틈새가 있는 위치를 찾으십시오. 반구는 쉽게 구별할 수 있으며, 그 내부에 있는 외측 뇌실은 보통 약간 더 어두운 형태로 보입니다. DNA 주입을 위해 배아가 완벽하게 정렬된 상태라면, 자궁벽을 뚫어 즉시 제3뇌실로 진입하는 것이 가능합니다.앞서 준비한 DNA가 들어있는 유리 미세 피펫을 자궁벽과 45도 각도가 되도록 잡고, 대뇌 반구 간 틈새(interhemispheric fissure)의 앞쪽 끝부분을 약 1mm 깊이로 뚫습니다. 이렇게 하면 유리 미세 피펫의 팁이 외측 뇌실이 아닌 뇌의 제3뇌실로 진입하게 됩니다. 이후 제3뇌실로 약 1µL의 DNA 용액을 주입합니다. 주입이 잘 되었다면 녹색 액체가 뇌실을 채우게 되며, 동일한 자궁각 내의 모든 배아에 대해 동일한 과정을 반복합니다.이렇게 하면 DNA 용액이 뇌실액과 고르게 섞여 신경 상피 전체에 도달할 수 있는 시간이 확보됩니다. 이제 전기천공기를 켜고 배아의 연령에 따라 설정을 조정하십시오. 스테인리스 스틸 바늘 전극을 양극으로, 원형 평면 전극을 음극으로 사용하며, 등 쪽이 위로 향한 배아를 선택하여 전기천공을 수행합니다.그런 다음 바늘 전극의 끝을 아래로 밀어 넣어 양막과 태반 사이, 배아의 머리 옆 자궁벽을 관통합니다. 이때 다른 쪽 손의 검지를 지지대로 사용하십시오. 전극 끝의 약 5mm 부분이 중뇌 높이의 양막과 자궁벽 사이에 위치해야 합니다.이것이 타겟 전극이므로, 전극의 위치에 따라 시상하부 신경 상피의 어느 부분이 가장 잘 형질전환될지가 결정됩니다. 다음으로, 다른 한 손을 사용하여 배아 머리의 반대편 자궁벽 바깥쪽에 둥글고 평평한 전극을 배치하십시오. 그런 다음 전극 사이에서 배아를 부드럽게 누릅니다.페달 스위치를 사용하여 전압을 가합니다. 그 다음, 다른 쪽 손의 검지로 자궁을 누른 상태에서 바늘 전극을 자궁에서 천천히 뽑아냅니다. 천공된 벽을 통해 양수가 유출되면 일반적으로 배아는 유산됩니다.모든 배아의 주입과 전기천공이 완료되면, 자궁을 생쥐의 복강 내에 매우 조심스럽게 다시 넣고 이전과 동일한 위치에 배치합니다. 그런 다음 복강을 식염수로 적신 후 폐쇄합니다. 외과용 캣것(cat gut)으로 복막을 봉합한 다음, 더 내구성이 강한 봉합사로 피부를 봉합합니다.요오드 용액으로 복부 표면을 소독하고 통증 완화를 위해 비스테로이드성 항염증제를 피하 주사합니다. 다음으로, 모체 쥐를 마취기에서 분리하여 가열 패드로 가온된 케이지에 넣습니다. 마우스가 마취에서 완전히 회복될 때까지 관찰하고, 매일 상태를 확인하여 감염이나 통증의 징후 없이 시술로부터 회복되고 있는지 확인합니다.이 단계에서는 분석하고자 하는 날짜에 맞춰 배아 또는 출생 후 개체를 수확합니다. DNA를 주입하고 전기천공법을 처리한 배아를 선택하여 이 실체현미경 하에서 뇌를 적출합니다. 그런 다음 해당 영역에서 녹색 형광 신호를 확인합니다.선택한 배아의 뇌를 분석하려면, 조직을 4%paraldehyde에 짧은 시간 동안 고정하십시오. 다음으로, 이를 aros 4% 또는 gelatin albumin에 매몰하십시오. 그런 다음 vibrato를 사용하여 뇌를 절편화하십시오.이 사진들은 E 12.5 단계에서 형광 리포터 유전자인 GFP 또는 CFP를 포함하는 플라스미드 DNA를 자궁 내 전이(transfection)시킨 후의 시상하부를 보여줍니다. 이것은 주둥이 쪽에서 꼬리 쪽까지 전이된 시상하부를 보여주는 시상면 절편이며, 여기는 내측-외측 축을 따라 서로 다른 높이에서 라벨링된 세포들을 보여주는 횡단면 절편입니다. 이 시상면 절편은 특이적으로 전이된 유두체와 그 특징적인 축삭 수지상 구조의 라벨링을 보여주며, 이 횡단면 절편의 전교차 측면은 E 12.5에 생성된 뉴런에 해당하는 라벨링된 띠를 보여줍니다.절편을 더 자세히 분석하기 위해, 유두함몰부(mammillary recess)에서 뻗어 나오는 방사성 글리아 돌기(radial glial processes)의 평면에 평행한 수평 절편을 제작하였습니다. E 12.5일에 형질전환된 신경상피에서 생성된 ambi O 뉴런을 E 18.5일에 GFP 항체를 이용하여 식별하였습니다.본 예시에서 항체는 제한된 MBO 세포군을 표지하였습니다. 이 세포군은 E 12.5 전후로 생성된 MBO 뉴런에 해당하는, 표지되지 않은 두 개의 외측 및 내측 MBO 영역 사이에 위치하였으며, nestin에 대한 항체와 공동 염색되었습니다. 빨간색으로는 신경상피의 방사형 글리아 돌기 위에서 개별적으로 표지된 뉴런의 이동 양상이 나타나 있습니다. 이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 30분 이내에 완료할 수 있습니다.이 영상을 시청한 후, 여러분은 제3뇌실에 DNA를 주입하는 방법과 시상하부를 효율적으로 타겟팅하기 위해 배아, 머리 및 태반 사이에 바늘을 양극으로 배치하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 수행한 후, 형질전환된 뉴런의 표현형에 관한 추가적인 의문점을 해결하기 위해 면역조직화학 염색이나 인시튜 하이브리다이제이션과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

genetic-manipulation-mouse-developing-hypothalamus-through-utero

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

E15 마우스 태아의 Utero의 심실 주입 및 Electroporation에

여기에서 망막 신경절 murine 세포 (RGCs)의 유전자 발현을 조작 두 가지 기법을...

마우스 망막 신경절 세포의 유전자 발현에 대한 utero 및 전직 생체내의 Electroporation에

utero의 electroporation에서 개발 중추 신경계 (CNS)에서 공간과 temporally 제어 방식으로 신속한 유전자 전달 수 있습니다. 여기서 우리는 telencephalon, diencephalon 및 망막을 포함한 여러 배아 CNS의 도메인으로 표현 구조를 제공하는 데 사용할 수있는 utero의 electroporation 프로토콜에 매우 적응을 설명합니다.

사용하여 여러 개의 CNS 준주로 효율적인 유전자 전달 Utero에서 Electroporation

개발 뇌 마우스로 유전자 전송 방법은 고유한 수술 방법과 전극의 특별한 모양을 사용하여 설명합니다. 이 독특한 기술은 두뇌 개발을 공부에 많은 도움이됩니다 neuroscientists temporally과 공간 플라스미드 DNA의 transfection 수 있습니다.

마우스 Utero에 Electroporation : 통제 Spatiotemporal 진 Transfection

Midgestation 마우스 태아의 아래쪽 사방 정계 립의 시험 관내 Electroporation에

이 문서에서는 자세히 utero에서 대뇌 피질과 생쥐의 E14.5에서 해마를 electroporate하는 프로토콜을 설명합니다. 또한이 두 대뇌 지역에서 dendrites 및 쪽이을 연구하는 귀중한 방법임을 보여줍니다.

사용하는 마우스 대뇌 피질과 해마의 시각화 및 Dendrites와 쪽이의 유전자 조작<em&gt; utero에서</em&gt; Electroporation

여기에서는 해마 발달 중 특정 유전자의 조절 메커니즘을 조사하는 도구를 제공하는 프로토콜을 제시합니다. 자궁외 전기천공법(ex utero electroporation) 및 유기형 절편 배양을 사용하면 단세포에서 관심 유전자의 발현을 상향 및 하향 조절하고 발달 과정에서 이들의 운명을 따를 수 있습니다.

마우스 해마 조직의 예 자궁 Electroporation에와 Organotypic 슬라이스 문화

이 프로토콜은 자궁 내 전기천공법을 통해 C57BL/6 중추신경계의 다른 영역을 구체적으로 transfection하는 방법을 자세히 설명합니다. 이 프로토콜에는 피질, 해마, 시상, 시상하부, 외측 중격 핵 및 선조체로 발달하는 영역의 형질주입에 대한 자세한 지침이 포함되어 있습니다.

코어 텍스, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, 횡 중격 Nucleus-과 줄무늬 별<em&gt; 자궁 내</em&gt; C57BL / 6 마​​우스에서 Electroporation에

신경 정신 장애의 병인에 있는 최근에 발견된 질병 관련 유전자의 역할은 모호하게 남아 있습니다. 자궁 전기 기화 기법에서 수정된 양자간은 뉴런의 큰 인구에서 유전자 전송을 허용하고 사회적 행동에 대한 유전자 발현 변화의 원인 효과의 검사를 허용한다.

자궁 전자기화에서 양자 간을 사용하여 설치류 행동에 대한 유전적 영향을 심문하는 파이프라인

이 프로토콜에서는 E7.5의 마우스 양수에 렌티 바이러스를 주입하여 생존 또는 배아 발달에 미치는 해로운 영향을 최소화하면서 전체 신경판을 균일하게 형질 도입하는 방법을 설명합니다.

배아 일 7.5에서 자궁 내 나노 주사 (NEPTUNE)에 의한 뮤린 신경 판 표적화

배우세요 마우스 시상하부 유전자 조작을 위한 자궁내 전기천공법을 활용한 신경발생 연구 방법입니다. 이 기술은 생체 내에서 특정 유전자 기능을 활성화하거나 억제하여 뇌 발달 메커니즘을 규명하는 데 활용됩니다.

마우스의 유전자 조작을 통해 시상 하부 개발

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