마우스의 유전자 조작을 통해 시상 하부 개발

본 실험 절차의 전반적인 목적은 자궁 내에서 발달 중인 생쥐 배아의 시상하부에 플라스미드 DNA를 형질전환하여 표적 유전자의 기능을 활성화하거나 억제하는 것입니다. 이를 위해 먼저 임신한 생쥐를 마취시키고 개복술을 통해 자궁을 노출시킵니다. 두 번째 단계로, 배아 뇌의 제3뇌실에 DNA 용액을 주입합니다.

다음으로, 양극을 태반과 배아 머리 사이의 자궁 내부에 위치시킵니다. 음극은 자궁 외벽에 배치하고 전기 펄스를 가합니다. 마지막 단계는 6일 후에 형질전환된 배아 뇌를 적출하는 것입니다.

최종적으로, 형광 현미경을 사용하여 형질전환된 세포의 수, 모양, 위치, 마커 발현 등과 같은 표현형 변화를 분석합니다. 바이러스 형질전환과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 첫째, 특별한 주의 사항이나 두 가지의 시설이 필요하지 않으며, 둘째, 특정 부위를 표적으로 지정하는 것이 가능하다는 점입니다. 셋째, 전기천공법을 이용하면 후보 유전자의 스크리닝 속도가 더 빠릅니다.

일반적으로 이 방법이 처음인 연구자는 DNA 용액을 제3뇌실에 주입하고 니들 전극을 적절하게 배치하는 데 고도의 수작업 숙련도와 경험이 필요하므로 어려움을 겪을 수 있습니다. 이 방법은 시상하부 발달 분야, 특히 세포 이동과 관련된 질문뿐만 아니라 개별 영역과 핵이 유전적으로 어떻게 지정되는지에 관한 의문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 양수 손실로 인한 초기 높은 유산율을 줄이는 것이 필수적이므로, 품질이 좋은 유리 마이크로 피펫을 제작하는 것으로 이 절차를 시작하십시오.

DNA를 준비하려면, 정제된 엔도톡신 프리 플라스마 DNA를 0.1% fast green이 포함된 PBS에 녹여 최종 농도가 1~2 µg/µL가 되도록 합니다. fast green은 주입된 용액을 배아 뇌실에서 시각적으로 확인할 수 있게 해줍니다. 그 다음, DNA 용액 10 µL를 유리 마이크로 피펫에 충전합니다.

그 다음 유리 마이크로 피펫을 주입 시스템 또는 마우스 피펫에 연결합니다. 이 단계에서는 가열 패드와 수술 도구를 사용하여 수술대를 준비합니다. 배아의 시각화를 용이하게 하기 위해 냉광원을 켭니다. 그런 다음 유리 비드 멸균기를 사용하여 수술 도구를 소독합니다.

다음으로, 임신한 마우스를 isof fluorine으로 마취합니다. 마우스가 마취되면, 안구 건조를 방지하기 위해 눈에 연고를 바릅니다. 이후 마취 상태를 지속적으로 유지하기 위해 마우스의 얼굴에 마스크를 씌웁니다.

이제 마우스를 배가 위로 향하게 하여 가열 패드 위에 놓습니다. 테이프로 네 다리를 고정하여 몸이 움직이지 않게 합니다. 꼬리를 집어 반사 반응을 확인하여 마우스가 완전히 마취되었는지 확인하십시오.

그런 다음 복부 표면을 제모하고 요오드 용액으로 소독합니다. 복부 피부에 약 1~1.5 cm 길이의 종절개를 가합니다. 그 후 복막을 절개합니다.

다음으로 절개 부위 주변에 면 거즈를 배치합니다. 거즈를 PBS로 헹굽니다. 둔탁한 포셉을 사용하여 자궁각 하나를 조심스럽게 당겨 노출시킵니다.

자궁근층이나 자궁을 세게 잡아당기지 않도록 주의하십시오. 자궁 내부의 압력이 높아지면 주입 시 배아 유출 가능성이 증가하여 유산으로 이어질 수 있기 때문입니다. 그 다음, 자궁각을 PBS로 헹군 거즈 위에 놓고, 몇 분마다 PBS로 헹구어 습윤 상태를 유지하십시오.

이제 현미경 하에서 뇌실을 시각화할 수 있도록 자궁을 유지하십시오. 불리한 위치에 있는 배아를 과도하게 재배치하지 마십시오. 이는 유산 가능성만 높일 뿐입니다.

배아의 머리를 위에서 내려다보며 좌우 대뇌 피질 반구 사이의 틈새가 있는 위치를 찾으십시오. 반구는 쉽게 구별할 수 있으며, 그 내부에 있는 외측 뇌실은 보통 약간 더 어두운 형태로 보입니다. DNA 주입을 위해 배아가 완벽하게 정렬된 상태라면, 자궁벽을 뚫어 즉시 제3뇌실로 진입하는 것이 가능합니다.

앞서 준비한 DNA가 들어있는 유리 미세 피펫을 자궁벽과 45도 각도가 되도록 잡고, 대뇌 반구 간 틈새(interhemispheric fissure)의 앞쪽 끝부분을 약 1mm 깊이로 뚫습니다. 이렇게 하면 유리 미세 피펫의 팁이 외측 뇌실이 아닌 뇌의 제3뇌실로 진입하게 됩니다. 이후 제3뇌실로 약 1µL의 DNA 용액을 주입합니다. 주입이 잘 되었다면 녹색 액체가 뇌실을 채우게 되며, 동일한 자궁각 내의 모든 배아에 대해 동일한 과정을 반복합니다.

이렇게 하면 DNA 용액이 뇌실액과 고르게 섞여 신경 상피 전체에 도달할 수 있는 시간이 확보됩니다. 이제 전기천공기를 켜고 배아의 연령에 따라 설정을 조정하십시오. 스테인리스 스틸 바늘 전극을 양극으로, 원형 평면 전극을 음극으로 사용하며, 등 쪽이 위로 향한 배아를 선택하여 전기천공을 수행합니다.

그런 다음 바늘 전극의 끝을 아래로 밀어 넣어 양막과 태반 사이, 배아의 머리 옆 자궁벽을 관통합니다. 이때 다른 쪽 손의 검지를 지지대로 사용하십시오. 전극 끝의 약 5mm 부분이 중뇌 높이의 양막과 자궁벽 사이에 위치해야 합니다.

이것이 타겟 전극이므로, 전극의 위치에 따라 시상하부 신경 상피의 어느 부분이 가장 잘 형질전환될지가 결정됩니다. 다음으로, 다른 한 손을 사용하여 배아 머리의 반대편 자궁벽 바깥쪽에 둥글고 평평한 전극을 배치하십시오. 그런 다음 전극 사이에서 배아를 부드럽게 누릅니다.

페달 스위치를 사용하여 전압을 가합니다. 그 다음, 다른 쪽 손의 검지로 자궁을 누른 상태에서 바늘 전극을 자궁에서 천천히 뽑아냅니다. 천공된 벽을 통해 양수가 유출되면 일반적으로 배아는 유산됩니다.

모든 배아의 주입과 전기천공이 완료되면, 자궁을 생쥐의 복강 내에 매우 조심스럽게 다시 넣고 이전과 동일한 위치에 배치합니다. 그런 다음 복강을 식염수로 적신 후 폐쇄합니다. 외과용 캣것(cat gut)으로 복막을 봉합한 다음, 더 내구성이 강한 봉합사로 피부를 봉합합니다.

요오드 용액으로 복부 표면을 소독하고 통증 완화를 위해 비스테로이드성 항염증제를 피하 주사합니다. 다음으로, 모체 쥐를 마취기에서 분리하여 가열 패드로 가온된 케이지에 넣습니다. 마우스가 마취에서 완전히 회복될 때까지 관찰하고, 매일 상태를 확인하여 감염이나 통증의 징후 없이 시술로부터 회복되고 있는지 확인합니다.

이 단계에서는 분석하고자 하는 날짜에 맞춰 배아 또는 출생 후 개체를 수확합니다. DNA를 주입하고 전기천공법을 처리한 배아를 선택하여 이 실체현미경 하에서 뇌를 적출합니다. 그런 다음 해당 영역에서 녹색 형광 신호를 확인합니다.

선택한 배아의 뇌를 분석하려면, 조직을 4%paraldehyde에 짧은 시간 동안 고정하십시오. 다음으로, 이를 aros 4% 또는 gelatin albumin에 매몰하십시오. 그런 다음 vibrato를 사용하여 뇌를 절편화하십시오.

이 사진들은 E 12.5 단계에서 형광 리포터 유전자인 GFP 또는 CFP를 포함하는 플라스미드 DNA를 자궁 내 전이(transfection)시킨 후의 시상하부를 보여줍니다. 이것은 주둥이 쪽에서 꼬리 쪽까지 전이된 시상하부를 보여주는 시상면 절편이며, 여기는 내측-외측 축을 따라 서로 다른 높이에서 라벨링된 세포들을 보여주는 횡단면 절편입니다. 이 시상면 절편은 특이적으로 전이된 유두체와 그 특징적인 축삭 수지상 구조의 라벨링을 보여주며, 이 횡단면 절편의 전교차 측면은 E 12.5에 생성된 뉴런에 해당하는 라벨링된 띠를 보여줍니다.

절편을 더 자세히 분석하기 위해, 유두함몰부(mammillary recess)에서 뻗어 나오는 방사성 글리아 돌기(radial glial processes)의 평면에 평행한 수평 절편을 제작하였습니다. E 12.5일에 형질전환된 신경상피에서 생성된 ambi O 뉴런을 E 18.5일에 GFP 항체를 이용하여 식별하였습니다.

본 예시에서 항체는 제한된 MBO 세포군을 표지하였습니다. 이 세포군은 E 12.5 전후로 생성된 MBO 뉴런에 해당하는, 표지되지 않은 두 개의 외측 및 내측 MBO 영역 사이에 위치하였으며, nestin에 대한 항체와 공동 염색되었습니다. 빨간색으로는 신경상피의 방사형 글리아 돌기 위에서 개별적으로 표지된 뉴런의 이동 양상이 나타나 있습니다. 이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 30분 이내에 완료할 수 있습니다.

이 영상을 시청한 후, 여러분은 제3뇌실에 DNA를 주입하는 방법과 시상하부를 효율적으로 타겟팅하기 위해 배아, 머리 및 태반 사이에 바늘을 양극으로 배치하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 수행한 후, 형질전환된 뉴런의 표현형에 관한 추가적인 의문점을 해결하기 위해 면역조직화학 염색이나 인시튜 하이브리다이제이션과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.