Name: 모르 올리고 뉴클레오티드의 Cerebroventricular 미세 주입을 사용하여 성인 Zebrafish의 두뇌에서 유전자 발현의 미세 조작 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-23T17:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: 배우세요 성어 제브라피시 뇌실에 모르 올리고 뉴클레오티드를 미세 주입하여 방사아교세포에서 유전자 발현을 효율적으로 저해하는 방법입니다. 이 기법은 신경과학 연구에 유용한 도구를 제공합니다.

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이 작품은 독일 Forschungsgemeinschaft (SFB 655)과 유럽 연합 (ZF-건강)에 의해 지원되었다.

1. 사출 혼합물의 준비 <ol><li> 세포가보다 효율적으로 정상적인 모르 분자 이상을 내면화으로 생체 morpholinos를 사용합니다. 자세한 내용은 제조업체의 정보 (: 시약 및 재료 표 1)을 참조하십시오. </li><li> 분사의 정확성을 시각화하는 형광 추적 염료 (예를 들어, CellTracker 레드 CMTPX, Invitrogen 사)를 사용합니다. 이 염료는 세포의 대사 만 섭취 후 세포에서 형광이됩니다. 따라서,이 단계를 효율적으로 cerebroventricular microinjection의 대상이되는 셀을 결정하는 매우 중요합니다. </li><li> 준비 인산 완충 식염수 (PBS) (137 mM의 NaCl을 2.7 mM의 KCl을, 10MM 나 2 HPO 4, 2 밀리미터 KH 2 PO 4, 산도 : 7.4) 모르 솔루션을 희석. 모르 솔루션의 희석이 필요한 경우, 항상 PBS를 사용합니다. </li><li> 모르 솔루션의 10 μL과 일의 1 μl를 추가하여 주입 믹스의 10 μl를 준비전자 셀 추적 염료 (희석 또는 원액을 모르 솔루션의 재고 농도가 500 μM입니다 22 모르의 여러 가지 다른 용량을 나타냅니다 우리의 이전 결과 -.. 50 μM에서 500 μM까지 - 효율적인에서 최저 서로 다른 수준의 결과 hypomorphic 표현형에 최저). 용액 1 μL 한 제브라 피쉬의 뇌에 주입 충분하다. </li><li> 잘 혼합하고 주입 할 때까지 실온에서 보관하십시오. </li></ol> 2. 사출 장치의 준비 <ol><li> 바늘 풀러를 사용하여 유리 주입 모세를 준비합니다. 난방 사이클 값 : 463, 사이클 값을 당기 : 230, 속도 : 1.5 초, 시간 : 75 밀리 초 다음 매개 변수를 사용합니다. </li><li> 압력 소스를 켜고 50 PSI 또는 3.5 바까지 압력 설정을 조정합니다. </li><li> 다음과 같이 microinjector 설정을 조정 압력 : 20 PSI, 배출 압력이 10 psi의 게이팅 2.5, 100 밀리 초 범위의 기간 값을 누릅니다. </li><li> 회전링 조명과 현미경 스테이지를 통해 반지를 찾습니다. </li><li> 현미경 옆에 적절한 위치에 모세관 홀더를 놓습니다. </li><li> 홀더에 모세관 유리를 삽입합니다. 45도까지 분사 각도를 조정합니다. </li><li> 미세 끝 집게를 사용하여 모세관 유리의 끝을 물고 오리피스의 압력 출력을 보정합니다. 이 물고기 물에 바늘의 끝을 담그고 지속적인 압력 펄스를 제공하여 테스트해야합니다. 발생하는 기포는 최적의 압력 / 오리피스의 크기 표시 하나만 행되어야한다. 이 교정의 데모 비디오를 참조하십시오. </li><li> 공기 방울이없이 주사 용액을 모세관 유리를로드합니다. </li><li> 모세관 유리와로드 주입 솔루션의 끝 사이의 공기를 제거하는 압력을 적용합니다. </li></ol> 3. 마취 <ol><li> 에틸 - 마취제의 원액 (0.1 % MESAB 준비M-aminobenzoate methanesulphonate). </li><li> 물이 충분한 양의 플라스틱 마우스 케이지 또는 다른 운송 컨테이너에 자신의 탱크에서 물고기의 원하는 번호를 제거합니다. </li><li> 마취 원액 5 ㎖와 물고기 물 200 mL를 혼합하여 작은 플라스틱 상자에 진통제 솔루션을 준비합니다. 마취제의 최종 농도 : 0.0025 % (v / v)의. </li><li> 마취와 플라스틱 페트리 접시를 반 입력합니다. 주입이 접시를 사용합니다. </li><li> 물고기 정복 할 때까지 마취제에있는 물고기를 품어. </li></ol> 4. 절개 Cerebroventricular 미세 주입 <ol><li> 물고기 그물을 사용하여 상자에서 물고기를 제거하고 페트리 접시에 놓습니다. </li><li> 부드럽게 약간 아래로 기울어하는 방식으로 집게와 방향을 머리와 물고기를 잡아. 이 절개를 용이하게합니다. </li><li> 30 게이지 가시 엔드 바늘을 사용하여 두개골에 작은 슬릿을 생성합니다. 바늘의 전용 팁을 사용하고 이상 침투하지 않습니다만큼이 같은 뇌에는 뇌 조직에 손상을 일으킬 출혈로 매니페스트됩니다 것입니다. </li><li> 물고기를 잡고 유지하고 유리의 끝이 절개 사이트를 통해 모세관 삽입합니다. </li><li> 동양 유리의 끝은 telencephalon으로 모세관. 이 조직 손상을 생성하고 또한 주입 솔루션의 분산을 방지로 뇌 조직을 만지지 마십시오. </li><li> 솔루션을 주입. 액체는 즉시 주사 후 분산. </li></ol> 5. 복구 및 사출 정확도 분석 <ol><li> 신선한 생선 물을 가진 플​​라스틱 상자에 주입 설정과 장소에서 물고기를 제거합니다. </li><li> 복구 할 수 있습니다. </li><li> 간단히 0.0025 %의 MESAB로 물고기를 다시 마취시키다과 형광 현미경 물고기를 확인합니다. 빨간 형광의 철저한 분산 주입 액체의 광범위한 분포의 표시이다. </li><li> 플라스틱 상자로 물고기를 넣습니다. </li><li> t에 플라스틱 상자를 연결오랜 시간 동안 산소 물고기와 유지에 그는 순환 시스템입니다. </li><li> 같은 행동 분석 등 원하는 목적을 위해 물고기를 사용하거나 추가 분석 (조직 학적 시약 염색, 면역 등) 조직 표본을 준비하는 주사 후 원하는 시간 지점에서 동물을 희생. 9,11,17-20,24-27 다음 참조는 성인 zebrafish의 뇌를 분석하는 방법의 예를 제공합니다. (50 % 이상 최저) 효율적인 최저를 관찰하는 가장 빠른 시간은 우리의 연구 22에서 12 시간이었다. </li></ol> 6. 제안 된 과학 제어 <ol><li> 음성 대조군으로 어떤 표현형의 원인이되어 있지 않은 불일치 모르 분자를 사용합니다. 호텔의 모든 유전자는 표준 모르 분자 또는 특별히 디자인 모르 컨트롤을 사용합니다. 또한, 어법의 비 특정 효과 나 독성을 평가하기 위해 더 대조군으로 (이 경우 PBS)에 용매를 사용모르 주사를 제어 / ATCH. </li><li> PCNA morpholinos를 긍정적 인 컨트롤로 이전 22 설명한 사용합니다. 이 모르은 성인 zebrafish의 뇌 (주입 1 일 안에 75~95%의 최저 효율) 22 효율적인 최저의 원인이됩니다. </li></ol>

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리가 여기에서 설명하는 방법은 성인 zebrafish의 두뇌에 morpholinos를 쉽고 빠르게 관리 할 수​​ 있습니다. 우리는 우리의 주입 방법은 효율적으로 심실 세포와 신경 반응의 기능적 결과의 결과에 유전자 발현을 차단하는 것을 증명하고있다. cerebroventricular 미세 주입을 실행하는 동안에 대해주의해야 할 중요한 점이있다. 예를 들어, 모르 분자의 효과는 사용되는 농도에 따라 달라집니다. 이 농도는 최종 사용자에 의해 결정되어야한다. 우리는 표준 배아 주입 프로토콜 28-30을 사용하여 배아에 주입하여 사전 테스트에 이상적 원액으로 시작 (500 μM) 및 직렬 희석을 수행하는 것이 좋습니다합니다. 이전에, 우리는 50 μM에서 500 μM (22)에 이르기까지 morpholinos를 농도와 최저 효율의 다른 수준을 얻었다. 둘째, 모세관 유리의 오리피스이 Larg 수 없습니다이 같은 E는 주사 후 뇌에 광범위한 액체 유입으로 이어질 것입니다. 이 적절한 주입을 방지하므로 마찬가지로, 오프닝이 너무 좁은 안됩니다. 하나는 물 페트리 접시에 공기를 펌핑하여 최적의 오리피스 압력 조합을 확인할 수 있습니다. 발생하는 거품이 아니라 여러 행의 단일 행에 있어야합니다. 우리는 비디오에서이 문제를 보여줍니다. 셋째, 마취제에있는 물고기를 배양하는 것은 중요합니다. 물고기 마취제의 2 분보다 더 오래 보존 할 수 없습니다. 이 주사 후 회복 속도를 방해합니다. 넷째, 절개의 위치는 철저하게 주입 된 액체를 분산 중요합니다. 광학 tectum에 심실 지역은 중앙선 위의 크고 옆으로 좁아집니다. 따라서 실험은 중간 선에 두개골 주변의 틈새를 생성해야하고 telencephalic 지역을 덮고있는 두개골 플레이트 바로 꼬리. cerebroventricular injectio의 장점 중 하나N (CVMI) 메소드는 신속성이다. CVMI 유전자 기능을 시금위한 빠른 방법입니다. 일반적으로 몇 개월이 걸릴 기능 연구를위한 유전자 변형 라인의 세대에 비해이 기능은 중요하고 유용하다. 또한, CVMI는 주입 된 액체의 균일 한 분포에 이르게하므로 초점 주사 또는 electroporation을 비교하여 유전자 활동의 상대적으로 철저한 조작을 제공합니다. CVMI하여 여러 유전자 주입을 준비하는 여러 morpholinos를 올리고 뉴클레오타이드를 포함하는 혼합하여 동시에 무너 뜨렸다 수 있습니다. CVMI은 주어진 모르의 올리고 뉴클레오티드의 다른 농도를 주입하고, 따라서 hypomorphic 표현형 분석을 위해 사용될 수있다 사용할 수 있습니다. 마지막으로,이 주사 패러다임은 독성을 일으키거나 동물의 생존을 손상하지 않습니다. CVMI 기술은 이러한 modulatory 펩티드, 마약, 플라스미드 DNA 또는 RNA modulatory 개월의 주입과 같은 연구의 다른 유형에 대한 확장 될 수세포의 생리에 영향을 미칠 수 lecules 또는 다른 물질. 분자의 조합을 시금 및 용량 반응 분석을 수행 가능 hypomorphic 표현형을 연구 있도록 우리의 방법을 사용하고 있습니다. 이러한 특성을 가진, CVMI는 성인 zebrafish의 뇌에서 발현 연구를위한 빠르고 쉽게 분석 할 증명하고 신속한 검사 및 기능 분석을 엽니 다. 성인 제브라 피쉬의 뇌는 구조적으로 전체 rostrocaudal 축을 따라 새로운 뉴런을 생성 할 수 있으며, 또한 외상성 부상 후 재생성 할 수 있습니다. 이 제한된 신경과 만약에 전혀, 오히려 가난한 재생 능력을 가진 포유 동물의 두뇌에 대조적입니다. 이러한 광범위한 줄기 세포 활동과 회복 능력은 현재 대부분 알 수 있습니다 중추 신경계 재생에 필요한 분자 프로그램을 이해하기위한 유용한 모델 생물을 제브라 피쉬 있습니다. 따라서 &#39;제의 재생 적성의 분자 기초 조사brafish 뇌는 물고기와 포유류의 뇌 부상 후 반응 또한 인간의 재생 의학 치료를위한 도로를 부여하는 방법의 근본적인 차이를 설명 할 흥미로운 연구 영역이다. 그들은 신경성 조상 3,8,20이기 때문에 척추 뇌 ​​가소성 및 재생의 분자 인프라를 이해하기 위해서는, glial 세포는 중요한 연구 영역으로 역할을합니다. 따라서, 제브라 피쉬의 뇌의 방사상 glial 세포에서 유전자 기능을 변경하는 CVMI 기술을 사용하면 해명 수단이 얼마나 물고기 뇌가 효율적으로 성인 신경과 재생 반응 커플 전구 활동을 할 수 있습니다. 우리는 최근 성인 zebrafish의 두뇌 24,26,27의 회생 신경 반응의 여러 요소와 신호 경로의 참여와 요구 사항을 보여,이 연구는 CVMI 방법의 사용에 의해 가능하게되었다. 전반적으로, 우리는 제브라 피쉬의 뇌에서 얻는 지식은 리젠를 부과 무력화 될 수있다상해에 반응하고, 따라서 인간의 신경 질환 및 급성 부상에 대한 임상 치료를 설계하는 데 도움이됩니다 포유류 glial 세포에 rative 능력.

성인 신경은 척추 동물에 공통적 인 특성이다, 그러나 유행과 효율성의 정도는 계통 1,2,3,4,5,6에 따라 달라집니다. 경골의 제브라 피쉬는 뇌 전체 4,5,9,10에있는 16 개의 다른 줄기 세포 도메인과 관련된 신경성 영역을 포함하는 동안 예를 들어, 성인 포유류의 뇌는 크게 전뇌 7,8로 제한 줄기 세포 영역을 포함합니다. 포유 동물과 제브라 피쉬 간의 변화는 줄기 세포의 유지 보수 및 전구 세포의 신경 인성 용량 메커니즘의 차이를 반영 할 수 있습니다. 제브라 피쉬의 뇌에 의해 고용 분자 메커니즘이 인간의 신경 퇴행성 질환을 해결하기 위해 치료 응용 프로그램에 무력화 될 수 있기 때문에 뇌의 뉴런을 생산하는 제브라 피쉬의 평생 능력은 임상 적 파급 효과를 일으킬 수 있습니다. 성인 zebrafish의 뇌의 여러 줄기 세포 영역을 분석 한 그리고 그것은 보여왔다 그그 지역의 심실 표면을 일렬로 세우는 세포 전구 세포 9,11-20 역할을합니다. 제브라 피쉬 telencephalon의 상세한 분석은, 예를 들어, 신경성 선조 19, 20 수 있도록이 뇌 영역의 심실 표면을 윤곽을 그리다 레이디 얼 glial 세포를 확인 하였다. 여기에는 소뇌와 neuroepithelial 세포가 신경 인성 입력 16,21를 제공 ventricularly - 위치 광학 tectum, 다른 지역에 대한 진정한 보유하고 있습니다. 이를 위해, 성인 zebrafish의 뇌에서 광범위한 신경 인성 역량을 지배하는 분자 메커니즘을 이해하는 것은 전구 세포에서 유전자 발현의 조작이 필요합니다. 다양한 방법 이전에 제브라 피쉬의 조절 유전자 기능에 대해 설명 하였다. 이들은 일렉트로 또는 화학 처리에 결합 된 단일 단백질 플라스미드 기반의 초점 주사 원하는 변형을 표현 조건부 유전자 변형 라인의 생성이 (가) 있습니다. 우리는 이전에 설계성인 zebrafish의 전뇌 (22)의 심실 세포 조절 유전자 기능의 신속하고 효율적인 방법으로 cerebroventricular 미세 주입을 사용하여 성인 zebrafish의 두뇌에 모르의 올리고 뉴클레오티드 또는 단백질 등 다양한 물질을 관리하기위한 방법. 우리의 연구에서 생체 morpholinos를 때문에 공유 결합 등의 electroporation 23과 같은 추가 permeabilization에 대한 필요없이 관심의 세포에 효율적으로 전달이 가능 풍부한 배달 펩티드를, 아르기닌에 링크 모르 분자를 포함하는 그들의 화학 하였다. 이 주사 후 원하는 조직의 철저한 타겟팅, 우리가 성인 zebrafish의 telencephalon 22에서 관찰 맘 허용합니다. 생체 morpholinos를 사용 따라서 이러한 일렉트로이나 DNA 분자의 초점 주사로 대상 조직의 기존 방법보다 우수합니다. 여기에, 우리는 우리가이 작업을 수행을 제공하는 방법 시각적으로 보여단계별 프로토콜입니다. 우리는 주입 혼합 및 주입 및 주입 장치를 설정하는 방법을 보여줌으로써 진행되는 물고기의 준비를 설명과 함께 시작합니다. 우리는 microinjector를 사용하여 morpholinos와의 두개골과 주입에 절개를 생성 포함 cerebroventricular 주입 방법에 대한 설명을 제공합니다. 우리는 또한 중요한 포인트 최적화 문제 해결 가이드로 진술하여 전체 과정을하는 동안주의해야 할 하나의 필요에 정교한.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagent/Material</td></tr><tr><td>CellTracker Red CMTPX</td><td>Life Technologies, Invitrogen</td><td>C34552</td><td>주입 정확도 측정을 위해 1:100 희석에서 사용</td></tr><tr><td>MESAB (에틸-m-아미노벤조에이트 메탄설포네이트)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td>물고기 마취용</td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Sarstedt</td><td>821,472</td><td>물고기 취급용 주입 및 이미징 중</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염</td>수 <td>Life Technologies, GIBCO</td><td>10010-056</td><td>멸균 희석 매체</td></tr><tr><td>Vivo morpholinos</td><td>Gene Tools Inc.</td><td>맞춤형</td><td>생체 morpholinos에 대한 추가 정보: <a href="http://www.gene-tools.com" target="_blank">www.gene-tools.com</a></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Barve-end needle</td><td>Becton-Dickinson</td><td>305178</td> 두<td>개골 절개를 생성하기 위해</td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Olympus, Leica, Zeiss</td><td>제조업체에 따라 다릅니다.</td><td> 전체 주입 설정</td></tr><tr><td>Dumont 핀셋</td><td>World Precision Instruments</td><td>501985</td><td>유리 모세관 형</td></tr><tr><td>광 카메라</td><td>Zeiss, Nikon, Leica</td>의 끝을 끊기 위해 <td>제조업체에 따라 다름</td><td>주입 후 형광을 시각화하기</td></tr><tr><td>위해 Gillies Pisecting Forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>501265</td><td>물고기를 제자리에 고정하기 위해</td></tr><tr><td>유리 주입 모세관</td><td>World Precision Instruments</td><td>TWF10</td><td>마이크로 주입 용</td></tr><tr><td>PicoNozzle 키트 (마이크로 인젝터 홀더)</td><td>World Precision Instruments</td><td>5430-12</td><td>마이크로 주입</td></tr><tr><td>용 공압 PicoPump (마이크로 인젝터)</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYS-PV820</td><td>마이크로 주입</td></tr><tr><td>용 링 일루미네이터; 링 라이트 가이드</td><td>Parkland Scientific</td><td>ILL-RLG</td><td>표본 조명용</td></tr></tbody></table>

모르 올리고 뉴클레오티드의 cerebroventricular 미세 주입을 사용하여 성인 zebrafish의 두뇌에서 유전자 발현의 미세 조작

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

조직에서 유전자 발현의 조작은 기능 연구를 수행하기 위해 필요합니다. 본 논문에서, 우리는 성인 zebrafish의 두뇌에서 유전자 발현을 조절하는 수단으로 cerebroventricular 미세 주입 (CVMI) 기술을 보여줍니다. CVMI를 사용하여 물질 cerebroventricular 유체로 관리 할 수​​ 있으며, 철저하게 뇌의 rostrocaudal 축을 따라 배포 될 수. 우리는 특히 생체 내에서 유전자 발현을 쓰러 뜨린위한 강력한 도구입니다 안티센스 모르의 올리고 뉴클레오티드의 사용에 초점을 맞 춥니 다. 우리의 방법에 적용될 때, 모르 분자는 심실 표면을 일렬로 세우는 세포에 의해 수행된다. 이러한 세포는 신경 인성 조상의 역할 레이디 얼 glial 세포를 포함합니다. 그러므로, 레이디 얼 glial 세포에서 유전자 발현을 노크하는 제브라 피쉬의 광범위한 신경 반응을 분석하는 가장 중요하고, 또한 척추 성인 neurogen을 유지할 수있는 방법에 대한 통찰력을 제공 할 것입니다ESIS 응답. 이러한 이해는 인간의 신경 퇴행성 질환 및 중추 신경계 재생의 임상 응용을위한 노력을 도울 것입니다. 따라서, 우리는 유전자 발현 및 성인 제브라 피쉬 전뇌의 신경 반응을 변경하는 신속하고 효율적인 방법으로 cerebroventricular 미세 주입 방법을 제시한다. 우리는 또한 CVMI 절차를 수행하는 방법에 대한 문제 해결 팁 및 기타 유용한 정보를 제공합니다.

Cerebroventricular 미세 주입은 주입 솔루션의 광범위한 배포에 이르게 그림 1에 묘사 된 cerebroventricular 미세 주입의 흐름과 기술 체계 사용하여, 우리는 성인 zebrafish의 두뇌에 모르의 올리고 뉴클레오티드를 관리. 정확한 주입 프로토콜은 심실 표면 (그림 2A)에 가까운 세포를 표적으로 뇌와 효율을 통해 주입 된 액체의 분산에 이르게한다. 모세관 유리의 뇌 조직을 impales 주사 주입 지점 (그림 2B)에서 조밀 한 형광 신호를해야합니다. 주입 된 양이 충분하지 않은 경우, 약한 형광 신호는 (그림 2C) 관찰됩니다. Cerebroventricular 미세 주입은 성인 zebrafish의 두뇌의 심실 영역에서 유전자 발현을 쓰러 뜨린 사용할 수 있습니다 우리는 일을 보여생체 morpholinos를에서 심실 표면 내부에 몇 가지 세포의 직경을 관통 할 수 있고, 따라서 효율적으로 심실 세포 (그림 3A의, 3B) 타겟팅 할 수 있습니다. 모르 주입은 해당 단백질 (그림 3C, 3D에서와 같이 예 PCNA입니다)의 생산을 완화하므로 최저 유전자 발현 할 수 있습니다. 우리는 이전에이 기술을 사용하여 유전자를 노크하는 성인 신경 세포 (그림 3E, 3F) 또는 재생 응답 (그림 3 세대, 3H) 동안 작동 결과에 이르게 것을 증명하고있다. 우리는 효율적인 최저 범위는 (50 % 이상 최저) morpholinos를 22 주사 후 약 12 시간을 달성 것을 보여 주었다. 우리는 또한 효율적인 최저 기간은 약 5 ~ 일 PCNA 단백질 22 주사 후까지입니다 것을 관찰했다. 70 % 이상 최저 3 일 주사 22 후까지 보였다. 최저 곡선은 따라 오입니다N 내인성 단백질과 모르 분자의 효율성의 표현의 수준, 그리고이 실험에 의해 모든 유전자에 대해 결정해야합니다. 우리의 연구에서 우리는 모르 분자의 관리가 로컬 및 전신 독성을 일으키지 않는 탓 CVMI 절차는 동물의 생존을 위태롭게 것을 보지 않았다. <img alt="그림 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50415/50415fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50415/50415fig1.jpg" /> 그림 1. cerebroventricular 주입 기술의 도식 표현. (A) 주사 광학 tectum의 수준 (구약 2)에서 성인 zebrafish의 (1)의 등쪽에서 수행됩니다. 절개는 30 게이지 바늘 (3)와 광학 tectal 두개골 접시 위에 만든다. 유리 모세관 사용 모르 분자는 심실 유체 (4)에 주입된다. 철저한 분산은(5) 즉시 chieved. (B) canula과 가시 끝이 높은 배율로 표시됩니다. (C) 절개하기 전에 바늘의 방향. (D) 절개 동그라미와 점선에 의해 설명된다. (E) 표시 및 사출이 수행되는 모세관 주입에 있습니다. 모든 패널은 심판에서 적응되었다. 22. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50415/50415fig1large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/50415/50415fig2.jpg" /> 그림 2. 분사의 효율성과 정확성의 비교. (A) 좋은 주사는 심실 표면에 가까운 세포를 표적으로 이어집니다. 모세관 유리의 뇌 조직에 삽입되어있는 경우 (B)이 중앙에 위치한 형광 신호를 생성합니다. (C </strong&gt;) 분사의 양이 낮은 경우이 약한 형광 신호로 이어질 것입니다. <img alt="그림 3" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50415/50415fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50415/50415fig3.jpg" /> 그림 3. . GFP 양성 핵을 보여주는 유전자 변형 라인 : 모르 침투, 유전자 knockdowns 및 기능 결과의 효율성 (A) GFP 컨트롤의 telencephalic 단면 전이를 (GFP H2A) 모르 주입에 면역 염색. GFP 양성 핵을 보여주는 유전자 변형 라인 (B) GFP가 전이 (GFP H2A)를 모르 주입 GFP 안티센스의 telencephalic 단면에 면역 염색. 심실 지역에서 GFP 신호의 차이를 확인합니다. V : 뇌실. (C) PCNA 제어 모르 주입 PCNA 양성 세포의 광범위한 분포를 보여주는 두뇌에 면역 염색. ( <strong&gt; D) PCNA는 CVMI 수있는 최저 내생 유전자를 보여주는, PCNA 양성 세포의 크게 감소 양을 보여주는 PCNA 안티센스 모르 주입 두뇌에 면역 염색. (E) BrdU의와 HUC / D 컨트롤에 대한 면역 염색 모르 주입 뇌 22 앞에서 설명한 BrdU의 펄스 추적 실험 후 신생아 뉴런을 결정합니다. (F) BrdU의와 HUC / D 22 앞에서 설명한 BrdU의 펄스 추적 실험 후 신생아 뉴런을 결정하기 위해 PCNA 안티센스 모르 주입 두뇌에 면역 염색. (G) 노크 다운 PCNA는 CVMI이 기능 결과를 야기 최저 내생 유전자에 이용 될 수 있음을 나타내는 신생아 뉴런의 생성이 크게 감소로 연결됩니다. 모든 패널은 심판에서 적응되었다. 22 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50415/50415fig3large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

이 문서에서는, 우리는 안티센스 모르의 올리고 뉴클레오티드를 이용하여 성인 제브라 피쉬 telencephalon의 심실 세포에서 유전자 발현을 조작하는 방법을 보여줍니다. 우리는 성인 척추 뇌 기능 연구에 사용할 수있는 효율적이고 빠른 프로토콜로이 방법을 제시한다.

모르 올리고 뉴클레오티드의 Cerebroventricular 미세 주입을 사용하여 성인 Zebrafish의 두뇌에서 유전자 발현의 미세 조작

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

본 절차의 전반적인 목표는 성체 제브라피시 뇌의 뇌실에 morph oligonucleotide를 미세 주입하여 방사형 글리아 세포(radial glial cells) 내 유전자의 활성을 억제하는 것입니다. 이를 위해 먼저 제브라피시를 마취합니다. 그 다음, 바늘 끝에 홈이 있는 치과용 바늘(barbed dent needle)을 사용하여 시신경 융기(optic tum) 상단의 두개골에 절개선을 만듭니다.그런 다음 절개 부위를 통해 morpho 용액을 뇌실액으로 주입합니다. 마지막으로 형광 현미경 하에서 주입 효율과 정확도를 확인합니다. 결과적으로 morpho 매개 유전자 넉다운을 통해 성체 제브라피시 뇌의 방사형 글리아 세포 내 표적 유전자의 단백질 생성 효율을 광범위하게 억제할 수 있으며, 이는 조직 절편 및 면역 조직 화학 염색을 통해 분석할 수 있습니다.형질전환 접근법이나 전기천공법 기반의 전달 방법과 같은 기존 방법들에 비해 이 기술이 가진 주요 장점은, CVMI가 시간을 덜 소모하며 방사성 글리아 세포 전체 집단을 타겟팅하는 데 더 효율적이라는 점입니다. 조절 가능한 여러 유전자를 동시에 넉다운할 수 있습니다. 주입 혼합물을 준비하려면 먼저 500 µM Morpho 스톡 용액을 만드는 것으로 시작하십시오.10회의 주입을 위해 PBS를 사용하여, 희석 또는 미희석 morpho 용액 9 µL와 형광 추적 염료 1 µL를 혼합하여 10 µL의 주입 혼합액을 준비합니다. 이를 상온에서 보관하십시오. 니들 풀러(needle puller)를 사용하여 다음 파라미터에 따라 유리 주입 모세관을 제작합니다.압력원을 켜고 압력 설정을 50 PSI 또는 3.5 bars로 조정합니다. 마이크로 인젝터 설정을 다음과 같이 조정합니다: 유지 압력(Hold pressure) 20 PSI, 분사 압력(eject pressure) 10 PSI, 주기 값(period value) 2.5 및 100 milliseconds.게이팅 범위 설정. 링 조명을 켜고 현미경 스테이지 위에 링을 위치시킵니다. 현미경 옆의 적절한 위치에 모세관 홀더를 배치합니다.유리 모세관을 홀더에 삽입하고 주입 각도를 45도로 조정합니다. 미세 핀셋을 사용하여 유리 모세관의 끝부분을 꺾어 제거하고, 오리피스에서 나오는 압력 출력을 교정합니다. 바늘 끝을 어류의 수조에 담근 상태에서 연속적인 압력 펄스를 가했을 때, 공기 방울이 한 줄로 형성되면 압력 또는 오리피스 크기가 최적임을 나타냅니다.유리 모세관에 주입액을 채웁니다. 기포가 생기지 않도록 압력을 가하여 유리 모세관의 끝부분과 채워진 주입액 사이의 공기를 제거합니다. 0.1% 농도의 마취제 meab 용액을 준비한 후, 원하는 수의 물고기를 물고기용 수가 들어 있는 운반 용기로 옮깁니다.어류용수 200 milliliters와 MISP 스톡 용액 5 milliliters를 혼합하여 마취제 작동액을 준비합니다. 주입에 사용할 페트리 접시의 절반을 마취제로 채웁니다. 물고기가 움직임을 멈출 때까지 마취제에 넣어 배양합니다.그런 다음 뜰채를 사용하여 마취제가 들어 있는 페트리 접시로 옮깁니다. 절개를 쉽게 하기 위해 포셉으로 물고기를 부드럽게 잡고 머리를 약간 아래쪽으로 기울여 방향을 잡습니다. 30 gauge 바늘 끝을 사용하여 두개골에 작은 절개선을 만드는데, 이때 너무 깊게 찌르면 뇌 조직이 손상될 수 있으므로 주의합니다.물고기를 계속 잡은 상태에서 유리 모세관의 끝을 절개 부위를 통해 약 0.5mm 삽입하고, 뇌 조직과의 접촉을 피하면서 cephalon 방향으로 맞춥니다. 용액을 주입하면 즉시 확산될 것입니다. 물고기를 깨끗한 물로 옮겨 회복하도록 합니다.약 30분 후, 물고기를 다시 마취시키고 형광 현미경으로 관찰하여 액체가 광범위하게 분포되었는지 확인합니다. 이는 적색 형광을 기준으로 판단합니다. 확인 후 물고기를 수조로 옮기고 다시 순환 시스템에 넣습니다.행동 분석에 사용하거나 본 영상과 같이 조직 표본을 준비하기 전까지, 정확한 주입은 주입된 용액이 뇌 전체로 확산되어 뇌실 표면 근처의 세포들을 효율적으로 타겟팅하게 합니다. 하지만 유리 모세관이 뇌 조직을 뚫고 들어간 주입의 경우, 주입 지점에 조밀한 형광 신호가 나타나게 됩니다. 또한 주입량이 충분하지 않으면 약한 형광 신호가 관찰될 것입니다.이 그림은 vivo morpho가 뇌실 표면 내부로 세포 몇 개 직경 정도 침투할 수 있으며, 따라서 대조군 Morpho에 비해 뇌실 세포를 효율적으로 표적으로 삼을 수 있음을 보여줍니다. PCNA에 대한 morpho 주입은 뇌실 세포의 유전자 발현을 효율적으로 억제합니다. 이러한 면역형광 이미지에서, A-B-R-D-U 펄스 체이스 실험 후의 BRDU 및 QCD 면역 염색 결과는 antisense morpho를 이용한 PCNA 억제가 신생 뉴런의 유의미한 감소로 이어진다는 것을 보여주며, 이는 CVMI가 내인성 유전자를 억제하여 결과적으로 기능적 영향을 주는 데 사용될 수 있음을 시사합니다.따라서 이 기술이 개발된 이후, 신경과학 분야의 연구자들은 성체 제브라피시 뇌의 재생적 신경발생 반응에 관여하는 분자 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열게 되었습니다.

micromanipulation-gene-expression-adult-zebrafish-brain-using

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

Microinjection은 수정된 zebrafish의 배아에 이물질을 소개하는 잘 설립하고 효과적인 방법입니다. 여기, 우리는 강력한 mRNA의 overexpression을 수행하기위한 microinjection 기술 및 zebrafish에서 morpholino의 oligonucleotide 유전자 최저 연구를 보여줍니다.

Zebrafish 태아의 mRNA와 Morpholino의 안티 센스 Oligonucleotides의 Microinjection.

이 동영상은 morpholino 또는 mRNA가 감소 또는 후속 개발 중에 특정 유전자 제품의 수준을 높일 수있는 한 세포 단계에서 zebrafish 배아에 주입 수있는 방법을 보여줍니다.

유전자 기능을 분석 Zebrafish 배아들 중 Microinjection

24hpf에서 zebrafish otocyst에 직접 morpholinos를 전달하는 방법이 개발되었습니다. 귀의 소포 및 침투력을 효과 electroporation의 루멘에 morpholinos의 microinjection을 사용하여, 우리는 두뇌에 morpholinos의 효과를 무시하고 내이 (内耳)에 특정 효과를 얻을 수 있었다.

사출 및 Electroporation에 의해 Zebrafish Otocyst으로 MIF Morpholinos 직접 배달 내이 (内耳)의 개발 미치는 영향

조건부 성인 zebrafish의 망막에서 대상 단백질의 표현을 분해하는 방법은 intravitreally 안티 센스 morpholinos를 주입하여 망막에 그들을 electroporating 포함하는, 설명되어 있습니다. 그 결과 단백질은 재생이나 그대로 망막에있는 단백질의 역할을 테스트 수 며칠에 대한 무너뜨렸다입니다.

Morpholinos의 생체내의 Electroporation에서 성인 Zebrafish의 망막에

우리는 조건부 성인 zebrafish 지느러미 재생 중에 대상 단백질의 표현을 분해하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 마이크로 주사와 상처 치유, 아체 형성 및 재생 파생물을 포함하여 지느러미 재생의 다양한 단계에서 단백질의 역할을 테스트하고 있습니다 지느러미 조직,에 안티 센스 oligonucleotide의 morpholinos를 electroporating을 포함한다.

생성중 성인 Zebrafish 테일 핀으로 Morpholinos의 생체내 Electroporation에

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