모르 올리고 뉴클레오티드의 Cerebroventricular 미세 주입을 사용하여 성인 Zebrafish의 두뇌에서 유전자 발현의 미세 조작

본 절차의 전반적인 목표는 성체 제브라피시 뇌의 뇌실에 morph oligonucleotide를 미세 주입하여 방사형 글리아 세포(radial glial cells) 내 유전자의 활성을 억제하는 것입니다. 이를 위해 먼저 제브라피시를 마취합니다. 그 다음, 바늘 끝에 홈이 있는 치과용 바늘(barbed dent needle)을 사용하여 시신경 융기(optic tum) 상단의 두개골에 절개선을 만듭니다.

그런 다음 절개 부위를 통해 morpho 용액을 뇌실액으로 주입합니다. 마지막으로 형광 현미경 하에서 주입 효율과 정확도를 확인합니다. 결과적으로 morpho 매개 유전자 넉다운을 통해 성체 제브라피시 뇌의 방사형 글리아 세포 내 표적 유전자의 단백질 생성 효율을 광범위하게 억제할 수 있으며, 이는 조직 절편 및 면역 조직 화학 염색을 통해 분석할 수 있습니다.

형질전환 접근법이나 전기천공법 기반의 전달 방법과 같은 기존 방법들에 비해 이 기술이 가진 주요 장점은, CVMI가 시간을 덜 소모하며 방사성 글리아 세포 전체 집단을 타겟팅하는 데 더 효율적이라는 점입니다. 조절 가능한 여러 유전자를 동시에 넉다운할 수 있습니다. 주입 혼합물을 준비하려면 먼저 500 µM Morpho 스톡 용액을 만드는 것으로 시작하십시오.

10회의 주입을 위해 PBS를 사용하여, 희석 또는 미희석 morpho 용액 9 µL와 형광 추적 염료 1 µL를 혼합하여 10 µL의 주입 혼합액을 준비합니다. 이를 상온에서 보관하십시오. 니들 풀러(needle puller)를 사용하여 다음 파라미터에 따라 유리 주입 모세관을 제작합니다.

압력원을 켜고 압력 설정을 50 PSI 또는 3.5 bars로 조정합니다. 마이크로 인젝터 설정을 다음과 같이 조정합니다: 유지 압력(Hold pressure) 20 PSI, 분사 압력(eject pressure) 10 PSI, 주기 값(period value) 2.5 및 100 milliseconds.

게이팅 범위 설정. 링 조명을 켜고 현미경 스테이지 위에 링을 위치시킵니다. 현미경 옆의 적절한 위치에 모세관 홀더를 배치합니다.

유리 모세관을 홀더에 삽입하고 주입 각도를 45도로 조정합니다. 미세 핀셋을 사용하여 유리 모세관의 끝부분을 꺾어 제거하고, 오리피스에서 나오는 압력 출력을 교정합니다. 바늘 끝을 어류의 수조에 담근 상태에서 연속적인 압력 펄스를 가했을 때, 공기 방울이 한 줄로 형성되면 압력 또는 오리피스 크기가 최적임을 나타냅니다.

유리 모세관에 주입액을 채웁니다. 기포가 생기지 않도록 압력을 가하여 유리 모세관의 끝부분과 채워진 주입액 사이의 공기를 제거합니다. 0.1% 농도의 마취제 meab 용액을 준비한 후, 원하는 수의 물고기를 물고기용 수가 들어 있는 운반 용기로 옮깁니다.

어류용수 200 milliliters와 MISP 스톡 용액 5 milliliters를 혼합하여 마취제 작동액을 준비합니다. 주입에 사용할 페트리 접시의 절반을 마취제로 채웁니다. 물고기가 움직임을 멈출 때까지 마취제에 넣어 배양합니다.

그런 다음 뜰채를 사용하여 마취제가 들어 있는 페트리 접시로 옮깁니다. 절개를 쉽게 하기 위해 포셉으로 물고기를 부드럽게 잡고 머리를 약간 아래쪽으로 기울여 방향을 잡습니다. 30 gauge 바늘 끝을 사용하여 두개골에 작은 절개선을 만드는데, 이때 너무 깊게 찌르면 뇌 조직이 손상될 수 있으므로 주의합니다.

물고기를 계속 잡은 상태에서 유리 모세관의 끝을 절개 부위를 통해 약 0.5mm 삽입하고, 뇌 조직과의 접촉을 피하면서 cephalon 방향으로 맞춥니다. 용액을 주입하면 즉시 확산될 것입니다. 물고기를 깨끗한 물로 옮겨 회복하도록 합니다.

약 30분 후, 물고기를 다시 마취시키고 형광 현미경으로 관찰하여 액체가 광범위하게 분포되었는지 확인합니다. 이는 적색 형광을 기준으로 판단합니다. 확인 후 물고기를 수조로 옮기고 다시 순환 시스템에 넣습니다.

행동 분석에 사용하거나 본 영상과 같이 조직 표본을 준비하기 전까지, 정확한 주입은 주입된 용액이 뇌 전체로 확산되어 뇌실 표면 근처의 세포들을 효율적으로 타겟팅하게 합니다. 하지만 유리 모세관이 뇌 조직을 뚫고 들어간 주입의 경우, 주입 지점에 조밀한 형광 신호가 나타나게 됩니다. 또한 주입량이 충분하지 않으면 약한 형광 신호가 관찰될 것입니다.

이 그림은 vivo morpho가 뇌실 표면 내부로 세포 몇 개 직경 정도 침투할 수 있으며, 따라서 대조군 Morpho에 비해 뇌실 세포를 효율적으로 표적으로 삼을 수 있음을 보여줍니다. PCNA에 대한 morpho 주입은 뇌실 세포의 유전자 발현을 효율적으로 억제합니다. 이러한 면역형광 이미지에서, A-B-R-D-U 펄스 체이스 실험 후의 BRDU 및 QCD 면역 염색 결과는 antisense morpho를 이용한 PCNA 억제가 신생 뉴런의 유의미한 감소로 이어진다는 것을 보여주며, 이는 CVMI가 내인성 유전자를 억제하여 결과적으로 기능적 영향을 주는 데 사용될 수 있음을 시사합니다.

따라서 이 기술이 개발된 이후, 신경과학 분야의 연구자들은 성체 제브라피시 뇌의 재생적 신경발생 반응에 관여하는 분자 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열게 되었습니다.