Name: 이미징 및 배아 제브라 피쉬의 뇌 혈관 구조의 3 차원 재구성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-22T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: 학습하세요 제브라피쉬 뇌 혈관 구조의 3D 이미징 및 재구성 방법을. 공초점 현미경과 오픈소스 소프트웨어를 활용하여 혈관 발달과 아밀로이드 베타 효과를 연구할 수 있습니다.

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저자는 이러한 기술 개발을 도왔 우리 실험실의 과거와 현재 회원을 감사드립니다. 일부 자금은 재생 의료 / CIRM (RN1-00538)에 대한 캘리포니아 연구소에서 부여로 DE 제공.

1. Zebrafish의 축산, 배아의 생성 및 처리 <ol><li> 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의지도하에 및 NIH 또는 기타 규제 기관 / 지침의 동물 관리 가이드 라인에 다음과 같은 제브라 피쉬 프로토콜을 실시한다. </li><li> 특정 조직, 세포 또는 장기에 형광 단백질을 표현 제브라 피쉬 균주 Zebrafish의 국제 자원 센터 (ZIRC)에서 사용할 수 있습니다. 예를 들어, Tg는 (KDR : EGPF)는이 프로토콜에서와 같이 완전한 3D 혈관 구조를 제조하는데 사용될 수 혈관 내피 세포를 06 일에서 EGFP를 표현 S843. 형질 전환 제브라 피쉬의 다른 라인은 ZIRC에서 사용할 수 있습니다. </li><li> 산도, 염도, 온도, 용존 산소, 빛, 및 기타 환경 요인에 7을 모니터링 적절한 양식 시스템에서의 주택 성인 제브라 피쉬. 여기에 표시된 제브라 피쉬는 14 시간 LIG와 28.5 ° C에서 Aquaneering 주식 시스템 (샌디에고, CA)에 보관 하였다ht/10 시간 어두운주기. 성인 제브라 피쉬에게 소금물 새우와 NRD 4 / 6 물고기 음식 (소금물 새우 직접 오그 던, 유타)의 균형 잡힌 식단을 공급. </li><li> 성인 남성과 번식 연령의 여성 제브라 피쉬는 짝짓기에 성공 높이기 위해 별도로 보관해야합니다. </li><li> 함께 계란을 통해 가을에 충분히 큰 구멍이 메쉬 바닥이 결합 용기에 여성 (2-4)과 남성 (4-6)를 배치하여 달걀 누워 및 수정을 자극하지만, 너무 작은 제브라 피쉬 성인이 합격을위한 . 전에 저녁이 교배를 설정; 계란은 낮의 빛을주기 천천히 강도 (새벽)에 증가 일반적으로있는 동안, 새벽 근처에 배치됩니다. 결합 용기의 바닥 모든 15 ~ 30 분 계란을 확인합니다. </li><li> E3 버퍼 (5 ​​mM의 염화나트륨, 0.17 밀리미터의 KCl, 0.33 mM의 염화칼슘, 0.33 mM의 망초)과 메쉬 스트레이너 청소를 사용하여 계란을 수집합니다. 28 ° C 배양기에서 E3 버퍼와 상점으로 가득 100mm 배양 접시에 계란을 전송합니다. </li><li> CER을 변경 화학 물질을 연구하는ebrovascular 원하는 화학 물질의 농도를 추가 분파. 예를 들어 neovasular 분기는 24를 시작 γ-세 크레타 제 억제제를 DMSO 4 가용화 (GSI IX/DAPT/N- [N-(3,5 - Difluorophenacetyl-L-알라 닐)]-S-phenylglycinet-부틸 에스테르)로 유도 될 수있다 시간 포스트 수정 (HPF). 그 때 점 배아에서 융모막에서 여전히 많은 화학 물질은 8 통과 할 수있다. 처리 조건은 융모막의 무료 휴식 배아의 능력을 손상시킬 신경 모터 효과를 가지고 있다면, 배아는 프로 나제 (2)의 어느 겸자로 수행 될 수있다 (24) 및 HPF (48) 사이에서 디 chorionated한다. 제공되는 이미지에 표시된 태아 부드럽게 두 날카롭게 집게로 융모막을 잡아 열어 찢어 dechorionated했다. </li><li> 필요하다면 / 소망, 색소 형성은 HPF (24)에서 E3 버퍼에 0.003 % N-Phenylthiourea (PTU)를 첨가함으로써 억제 할 수있다. </li></ol> 뇌 혈관 구조체 2. 공 촛점 이미징고정 제브라 피쉬 배아에 URES <ol><li> 250 ㎎ / L의 Tricaine 메탄의 배아를 희생하고 2 침지하여이를 수정 - 4 ℃에서 하룻밤 4 % 파라 포름 알데히드 형광 태아가 들어있는 용기는 호일에 싸여되어야한다. 이미지가 될 때까지 한 번 고정, 배아는 4 ° C에서 PBS에 보관해야합니다 - EGFP 형광 강도는 약 일주일 후 작은 해결이됩니다 만, 형태는 (시야에서 볼 때) 훨씬 오래 유지됩니다. </li><li> 먼저 날카롭게 텅스텐 바늘을 사용하여 하나의 눈을 제거하여 배아를 탑재 할 준비를합니다. 눈을 연결 조직 주위에 잘라 먼저 근육을 절단하고, 마지막으로 눈을 치환하는 시신경을 절단. (참고 : 양쪽 결상 원하는 경우 제거 두 눈을.) </li><li> 눈을 제거한 후에, 3 % 메틸 셀룰로오스의 방울을 사용 커버 글라스에 배아 마운트. 제거 된 눈을 가진면이 커버 글라스에 직면하고 가능한 한 유리에 가깝게되도록 배아의 방향. 메틸로 전체 배아를 커버이미징 동안 건조를 방지하기 위해 lcellulose. </li><li> 이미지 즉시 고품질 20X 플랜 아포 목적 (개구 = 0.75 이상)을 탑재 반전 공 촛점 현미경을 사용하여 장착 배아. 이 구성은 두 개의 유리 평면 사이 배아를 협지하고, 전면 글라스에 대해 배아를 가압 필요 비 반전 현미경 것이 바람직하다. </li><li> 중간 또는 큰 조리개 설정을 사용하여 1 μm의 단위로 광 조각을 수집합니다. 2.5 μM의 확대 단계가 또한 사용될 수 있지만, 그것은 작은 물체의 공간적 순서를 결정하는 것이 더 어려울 수있다. 작은 구멍이 선명한 디테일을 생산하지만, 필요 이상 검사는 EGFP 표백도 얻을 수있는 배아로 영상의 깊이를 제한 할 수 있습니다. 공 초점 현미경은 배아를 통해 절반 방법에 대한 영상을 허용합니다. </li><li> 전체 물고기의 영상을 원하는 경우, (단계 3.2의 주 참조) 처음에 두 눈을 제거, 걸 보면 후 배아를 회전반대편 2.5 - G 한쪽 반복 2.3 단계를 반복합니다. </li></ol> 배아 Zebrafish의 Cerebrovasculature 3. 3D 재건 <ol><li> 무료, 3D 렌더링에 최적화 및 PC, Mac 및 Linux 컴퓨터와 호환되는 오픈 소스 ImageJ에의 피지 분포 3 (http://fiji.sc)를 사용합니다. </li><li> 플러그인&gt; 궤적&gt; BioFormats 가져 오기 (9)는 다음, 니콘 스택 (그림 2A)에 대한 예를 들어 name.ids를 공 초점 파일을 선택 이동하여 피지로 가져 오기 공 초점 스택. 분할 채널을 확인, 자동 설정을 확인, 그레이 스케일 : Hyperstack, 컬러 모드와보기 스택을 선택합니다. </li><li> 이러한 선택은 네 개의 개별 채널 패널을 엽니 다; EGFP에 대해 하나는 일반적으로 세 번째 다운을 필요합니다. C = 1 (그림 2A) 다음에 긴 이름을 가진 16 비트 이미지를 떠나 다른 세 개의 패널 (빨강, 파랑 및 알파)를 닫습니다. </li><li> 이미지가 스크롤을 따 사용하지만 스캔하여 임계 값을 조정B 관심 영역 또는 구조를 가지고 조각을 찾기 위해 하단에 다음 (그림 2C)&gt; 임계 값을 조정합니다&gt; 이미지로 이동합니다. </li><li> 등장 패널의 구조는 배경에 아주 잘 볼 수 있도록 왼쪽 상단 바 (블랙 레벨)를 밀어하고 (그림 2D)입니다 하단 슬라이드 (화이트 레벨)을 둡니다. B &amp; W를 선택, 어두운 배경을 선택합니다. 다른 조정이 각 조각에, 검정색 배경을 선택해야하지 않는 한 각 이미지에 대한 계산 임계 값을 선택하지 마십시오. 이 과정은 새로운 8 비트 이미지를 생성합니다. </li><li> 경고 임계 값은 취소 또는 저장 ImageJ에있는, 그래서 공 초점 스택은 변경이 필요할 때마다 다시로드해야합니다 수 없습니다. 숫자를 기록하고 원하는 결과를 얻을 때까지 다른 설정을 시도해보십시오. </li><li> 요인 1 (최상) 또는 2 (좋은)을 재 샘플링, 플러그인&gt; 3D 뷰어&gt; 임계 값을 0으로 이동, 녹색 3D 출력을 할 수있는 빨간색과 파란색 색상 상자의 선택을 취소합니다 - 그렇지 않으면 위스콘신LL 흰색 렌더링을 생성 - (자동) (그림 2E) 적용을 선택합니다. </li><li> 회전, 스핀과 마우스와 키보드 컨트롤 (그림 2F)를 사용하여 3D 이미지를 확대. </li><li> 메뉴에서 캡처 옵션을 사용하여 어느 지점에서 정지 영상을 저장합니다. 화면에 이미지 상자의 크기는 생성 된 이미지의 픽셀 사이즈를 지시하므로 고해상도 화상 메이크 오른쪽 하단 모서리를 끌어 상자가 확대를 원하는 경우. </li><li> 보기&gt; 기록 360 ℃의 회전 (그림 2G)를 선택하여 회전하는 3D 영화를 만들 수 있습니다. 단계 당 2도까지 회전 기본적으로,하지만 훨씬 작은 파일 크기를 생성합니다 예를 들어 5도에 변경 될 수 있지만, 애니메이션에 경련을 추가 할 수 있습니다. </li><li> 나중에, 미디어 플레이어로 볼 수 인터넷에 업로드하거나, 파워 포인트 프레 젠 테이션에 사용하기위한 몇 가지 가능한 형식 중 하나에 파일을 저장합니다. 오픈 소스 미디어 플레이어, VLC ( <a href="http://www.videolan.org/vlc/index.html">HT</a>) :/ / www.videolan.org / VLC / index.html을 TP, 무료로 아주 잘 이러한 동영상을 처리합니다. </li></ol>

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<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%22">The Zebrafish Book</a>. , University of Oregon Press. (2007).</li>
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<li>Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-dimensional+resin+casting+and+imaging+of+mouse+portal+vein+or+intrahepatic+bile+duct+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">3-dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system.</a> J Vis Exp. 68, e4272(2012).</li>
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공개 아무것도 없다.

여기에서 설명하는 방법은 zebrafish의 개발에 혈관 시스템의 시각적 인 연구를위한 기초를 제공한다. 고정 된 샘플은 고해상도 촛점 촬상. 초파리 및 C. 위해 사용될 수있는 반면 라이브 시험편, 심박수 및 심장 박출량과 같은 생리 학적 파라미터를 평가하기 위해 사용될 수있다 엘레 전신 영상을 허용하지만, 제브라 피쉬는 척추 동물이며, 내피 세포가 늘어선 관 시스템을 포함한 척추 동물의 조직에 대한 유용한 모델을 제공합니다. 이러한 연구는 제브라 피쉬 연구 공동체에서 중요한 유전자 변형 라인과 게놈 자원을 통합 할 수 있습니다. 3D 재구성 및 배아 제브라 피쉬에서 공 촛점 이미지의 렌더링, 여기에 설명 된대로, 혈관 분기와 같은 쥐와 생쥐와 같은 큰 동물 모델을 할 수없는 혈관의 밀도에 시스템 생물학의 접근을 허용. 또한, 제브라 피쉬가 수정 환경 (E3 버퍼)에서 개발 양막 류 (amniotes)로, 어디 하나는 쉽게 C를 추가 할 수 있습니다혈관 발달에 영향을 미치는 특정 효소 나 다른 프로세스를 억제 hemicals. 화학 약품 이송의 농도 및 타이밍은 연구원 미세 조정 처리 조건을 가능하게 변경 될 수있다. 1. 수정 및 문제 해결 이 시스템에 대한 수정 사항은 조직, 기관 또는 지역 특정 패턴 (10)의 다양한 EGFP 또는 다른 형광 단백질을 발현하는 형질 전환 제브라 피쉬의 라인을 통합 할 수 있습니다. 또한, zebrafish의 망막 신생 혈관의 변화의 분석은 최근 5를 발표하고있다. 이전의 배아와 성인 제브라 피쉬의 착색 문제는 규모 안료 또​​는 망막 색소를 생성하지 않는 유전자 변형 라인과 교차에 의해 보상 될 수있다. 감소 된 형광 문제는 일반적으로 부적절한 고정 조건에서 발생합니다. 1 일 동안 파라 포름 알데히드 (4 %)이 최적입니다 만 글 루타 알데하이드 (glutaraldehyde), 오스뮴 또는 알코올 등의 강한 고정 제는, 5 월EGFP 형광을 파괴한다. 고정 후, 배아는 4 ° C에서 PBS에 보관해야하고 항상 직사광선으로부터 보호. 이 기술의 2. 제한 이 프로토콜을 사용하여 생성 된 3D 렌더링의 품질과 해상도는 생성 된 이미지의 품질에 따라 달라집니다. 이러한 배아를 통해 빛의 침투는 표준 공 초점 현미경을 사용하여 중간 시상면으로 제한됩니다. 영상의이 부분은 이전의 배아와 성인 영상의 깊이를 제한하지만, 더 진보 된 다 광자 현미경 시스템은 깊은 수심에서 이미징 할 수 있습니다. 기존의 방법에 대하여 3. 의미 이 프로토콜은 전체 동물을 통합 할 수있는 시스템 레벨에서의 혈관 망의 분석 방법을 제공한다. 이러한 데이터의 이전 표현은 종종 함께 배치 일련의 이미지에 의존하지만, 3D 렌더링 공간 상대적으로 더 나은 해상도를 제공합니다참여 tionships. 4. 미래의 응용 프로그램 이미징 및 조직 처리의 새로운 발전은 이전의 배아 또는 성인 투명 11-14을 만드는 포함 할 수있는 방법에 대한 많은 새로운 응용 프로그램을 제공 할 것입니다. 향상된 투명성이 크게 공 초점 및 다중 광자 레이저로 조직의 침투를 증가시킬 것이다. 또한, 카메라 및 광전자 증 배관 튜브의 속도로 빨리 분석의 네 번째 차원을 제공하는 실시간 물고기의 3D 렌더링을 생성하는 것이 가능할 수도 증가한다. 5. 중요한 단계 이 프로토콜의 중요한 단계는 적절한 고정을 포함 이미징을위한 준비입니다. 영상은 사용할 수있는 최고의 숫자 구멍이 높은 품질의 목표에 고정 후 가능한 한 빨리 수행해야합니다. 해상도 사용한 촬상 시스템에 달려 있으므로 고품질의 시스템은 일반적으로 더 낫다. 3D 렌더링을 생성하면 메모리를 많이 사용메모리와 좋은 그래픽 프로세서의 다량 때문에 새로운 하이 엔드 컴퓨터를 권장합니다. 이들 방법은 신경, 근육, 동맥 또는 임의의 수의 개체군에서 GFP 또는 다른 형광 단백질을 표현 형질 전환 배아에 적용 할 수 있지만 여기에 기재된 시각 생물학 시스템은, 혈관 내피 세포에서 EGFP를 표현 형질 전환 지브라 피쉬 위해 최적화 된 다른 세포. 이 시스템으로 작업의 가장 큰 장점은 고정 및 / 또는 살아있는 동물에서,이 발달 기간 동안 언제든지 전체 배아에서 무슨 일이 일어나고 있는지 연구 할 수있는 기능입니다.

제브라 피쉬는 발달 생물학을 연구 할 수있는 강력한 시스템을 제공하고, 그들의 태아의 상대적인 투명성 영상 기반 연구 1 의무이다. 제브라 피쉬는 이제 수십 년 동안 척추 동물의 개발을위한 모델로 사용되어왔다. 제브라 피쉬를 포함 Teleosts는 무척추 동물에 적당한 동체가없는 단순화 된 척추 혈관 시스템이 있습니다. 혈액이 산소를 함유 아가미를 통해 두 챔버 마음의 전방 펌핑된다. 아가미에서 피가 등쪽 대동맥에 수렴하고 더 작은 혈관에 동맥 분기, 장기 조직에 결국 도달하는 모세 혈관을 통과한다. 모세관 산소 이내에 해제되고 이산화탄소가 흡수된다. 모세 혈관의 정맥 측에 피가 더 큰 혈관에 흐르고 마침내 사이클이 반복 심장의 후방 챔버로 유입된다. 성인 제브라 피쉬는 한 번에 200 개 이상의 알을 낳기 및 ONC 수전자가 수정 된, 그들은 신속하게 2를 개발. 하루 만에 몸의 축이 아니라 융모 막 내부에 주변의 배아를 이동 계약과 근육을 포함하여, 개발되고있다. 2-7일에서 포스트 수정 (DPF)는 대부분의 신체 시스템은 눈과 식품 안쪽 또는 바깥쪽으로 밝은 빛에서 수영을 조정할 수있는 중추 신경계를 포함하여, 개발. 최대 7 DPF의 배아는 현미경과 시각화 수 있도록 충분히 작은 수 있습니다. 형광 단백질을 발현하는 형질 전환 라인은 공 촛점 또는 형광 현미경으로 몇 군데 있습니다. 공 촛점 이미징은 혈관 개발의 시스템 생물학의 관점을 제공 제브라 피쉬 배아에 완전한 혈관 구조의 3 차원 렌더링을 만들 수있는 오픈 소스 소프트웨어 3와 결합 할 수 있습니다. 그것은 혈관 네트워크 4,5의 시스템 수준의 분석을 허용하는 혈관과 뇌 혈관 복잡성의 변화와 관련된 연구는이 프로토콜에서 도움이 될 것입니다. 방법과 자원의 컴파일이 제공됩니다배아 제브라 피쉬의 혈관 구조의 영상을 필요로 연구에 쉽게 채택 및 이러한 기술을 허용하는 D. 동물 모델로서 지브라 피쉬의 비용 효율은 척추 동물 발달 및 항상성 분자 경로의 혈관 신생 효과를 평가와 새로운 플랫폼을 제공하기 위해 새로운 이미징 기술들과 결합된다.

<table><tbody><tr><td>N &ndash; 페닐티오우레아&nbsp;</td><td>Alfa Aesar, 카탈로그 #41972</td><td></td><td>E3 버퍼에서 0.2M, 4 &#176으로 유지; C</td></tr><tr><td>E3 버퍼</td><td>시그마</td><td></td><td>5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4</td></tr><tr><td>Confocal microscope&nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td>D-EclipseC1 on a Nikon TE-2000U</td></tr><tr><td>유리 바닥 접시</td><td>Mat-Tek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GSI IX/DAPT</td><td></td><td></td><td>N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycinet-butyl ester EMD Biosciences</td></tr><tr><td>24 웰 플레이트&nbsp;</td><td>Becton-Dickinson, cat# 351147</td><td></td><td>BD Falcon</td></tr><tr><td>이송 피펫&nbsp;</td><td>VWR, cat #414004-001</td><td></td><td>VWR 일회용 전송 피펫</td></tr><tr><td>메틸-셀룰로오스&nbsp;</td><td>Alfa Aesar, cat#43146</td><td></td><td>E3 버퍼</td></tr><tr><td>NRD 4/6 생선 음식에서 3%&nbsp;</td><td>브라인 쉬림프 직접</td><td></td><td>건조</td></tr><tr><td>브라인 쉬림프</td><td>브라인 쉬림프 다이렉</td><td></td>트 <td>라이브</td></tr><tr><td>텅스텐 와이어&nbsp;</td><td>소형 부품 # TW-016-60</td><td></td><td>0.016 " OD</td></tr><tr><td>트리카인</td><td>VWR # 101107-950</td><td></td><td>E3 완충액의 트리카인 메탄설포네이트 250mg/L</td></tr></tbody></table>

이미징 및 배아 제브라 피쉬의 뇌 혈관 구조의 3 차원 재구성

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

제브라 피쉬는 생체 내에서 발생 생물학 및 병리학을 연구 할 수있는 강력한 도구입니다. 작은 크기와 제브라 피쉬 배아의 상대적으로 투명성이 심장과 혈관의 개발과 같은 프로세스의 시각적 심사에 특히 유용합니다. 최근의 여러 연구에서 혈관 내피 세포에서 EGFP를 표현 형질 전환 지브라 피쉬는 화상에 사용하고, 공 초점 현미경을 사용하여, 뇌 및 망막 혈관 복잡한 네트워크를 분석한다. 설명은, 준비 치료 및 이미지 강화 녹색 형광 단백질 (EGFP)를 표현하는 제브라 피쉬 배아를 한 다음 뇌 혈관 시스템의 종합적인 3D 렌더링을 생성하기 위해 제공됩니다. 프로토콜은 배아의 처리, 공 촛점 이미징 및 EGFP 형광을 유지 고정 프로토콜 (가) 있습니다. 또한, 이러한 손상 근처의 신경 조직을 제거하지 않고 눈과 같은 뇌 혈관 구조의 고품질 이미지를 구하는 방법에 대한 유용한 정보가 제공됩니다. 잠재적 인 함정공 촛점 이미징은 자유롭게 사용할 수있는 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여 공 초점 이미지 스택에서 3D 복원을 생성하는 데 필요한 단계와 함께 설명합니다.

혈관 구조의 3 차원 재구성은 제브라 피쉬 개발의 포괄적이고 시각적으로 흥미로운 관점을 제공합니다. 그들은 일반적으로 수행으로 1, 2는 방법을 도시한다. 그림 3은 내피 세포에서 EGFP을 표현 제브라 피쉬 배아 DPF 6 혈관 구조의 여러 각도를 보여줍니다. 단색 녹색 또는 흰색 색상으로 신호 강도를 평가하기가 어려울 수 있습니다; 의사 색상은 룩업 테이블에서 이미지 강도를 제공하고 구조가 겹치는 경우에 더 깊이 인식 할 수 있습니다. 소재 맥관의 의사 - 컬러 3D 화상의 예 6 지브라 피쉬는도 4에 제공된다 DPF. 살아있는 배아의 형광 이미징은 눈 및 신체 움직임을 포함 생리적 특성을 연구하기 위해 이용 될 수 있으며, 심장 활동. 3,4 피규어 형질 전환 제브라 피쉬 줄을 사용하여, 이러한 방법으로 얻은 대표적인 결과를 보여<html> 설명. 이미징 분해능 현미경 특성에 따라 다르지만, EGFP 신호의 밝기는 대부분의 상용 시스템과 양호한 화질 충분하다. 3D 표현의 재건 및 렌더링은 일관성이 오픈 소스 소프트웨어 내 옵션은 지속적으로 좋은 결과를 제공합니다. <img alt="그림 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig1highres.jpg" width="600" /> 그림 1. 눈 제거. A) 텅스텐 필요없이 고정 세 DPF 배아는 눈 옆에 위치. 조직이)이 위치. B에서 눈 주위를 잘라 눈이가 빠지고 기본 안구 근육과 시신경이 절단된다. 빈 눈구멍은 점선 원으로 표시됩니다. C) 같은 배아 인계 및 메틸 셀룰로오스와 함께 장착되어, 최대 직면하고있는 그대로 눈으로.<html> hres.jpg &quot;대상 =&quot;_blank &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig2highres.jpg" width="600" /> 그림 2. 단계별 공 초점 이미지 스택의 3D 재건. A) 관심 영역으로 조각을 찾은 후. B)을 선택 플러그인&gt; 궤적&gt; Bioformat를 사용하여 피지 내에로드 파일 열기 (4104.1.ids), 임계 값 조정이 표시. C)로 선택 임계 값은 최고를 사용하여 (214)에 조정 슬라이더 적용이 선택됩니다. 같이 D) 3D 뷰어가 호출됩니다. E) 3 차원 재구성이 방향의 경우 그대로 눈을 가진 제브라 피쉬,. F) 이미지를 확대합니다. G) 360도 회전 동영상을 회전 한으로 표시됩니다 도시 된 바와 같이 이루어진다.<html> res.jpg &quot;대상 =&quot;_blank &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig3highres.jpg" width="600" /> 그림 3. 3D 재건의 전망. A) 10 배 목적으로 이미지화 6 DPF 배아의 내측 관점, 입이 오른쪽에, 입안하지 아가미. B 동일한 배아의) 측면, 주 지느러미 중간에 루프입니다. 20 배 목적으로 몇 군데 C) 같은 배아, 20 배 목표 영상의 중간 관점, 주 아가미 해상도. D) 측면 관점. 핀이 패널의 오른쪽 가장자리에 있습니다. 20 배 목적 영상의 E) 전후면 중간보기, 오른쪽에 20 배 목표, 머리 그것으로 몇 군데 같은 태아의 입 안에 주 아가미. F) 복부. 오른쪽 아래에 난황에 혈관을합니다.jove.com/files/ftp_upload/50417/50417fig3highres.jpg &quot;대상 =&quot;_blank &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig4highres.jpg" width="600" /> 신호 강도에 대한 사색의 룩업 테이블을 사용하여 6 DPF 재건의 6 DPF의 배아 그림 4. 강도의 차이는. 이미지. 입, 뇌, 아가미 및 난황이 방향에 표시되어 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50417/50417fig4highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50417/Zfish_still.jpg" width="500" /> 4 DPF의 제브라 피쉬의 재구성 혈관 시스템의 그림 5. 영화. 물고기는 2.5 μm의에서 몇 군데 있었다. 이미지가 있었다배아의 절반을 이미징. 그림 6에서 제공하는 GSI 처리 된 제브라 피쉬의 구조와 혈관 구조를 비교. 머리에 혈관의 밀도가 낮은 큰 아가미합니다. (다운로드 아래에있는 &quot;Zfish_spin.avi&quot;보충 파일을 참조하십시오) <img alt="그림 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50417/Zfish_still1.jpg" width="500" /> 그림 6. 4 DPF에서 GSI 처리 된 배아의 혈관 시스템의 3D 영화. 물고기는 중간 선에 측면에서 통해 2.5 μm의에서 몇 군데 있었다. 그림 5와 같이 물고기 DPF 제어 4 혈관 구조를 비교. 아치형 다시 작은 크기는이 화학 물질로 처리 된 배아에서 전형적인이다. (다운로드 아래에있는 &quot;GSI-treated_4dpf_fish.avi&quot;보충 파일을 참조하십시오)

애벌레 제브라 피쉬의 뇌 발달의 영상이 설명되어 있습니다. 3D 영상을 촉진하고 화학적 처리를 사용하여 뇌 혈관 발달을 수정하는 기술도 제공됩니다.

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

이 절차의 전반적인 목표는 제브라피쉬 배아의 뇌혈관 구조를 평가하는 것입니다. 이를 위해 먼저 수정된 제브라피쉬 알을 수집하고 처리 조건을 설정합니다. 3일간의 성장 기간이 지난 후, 제브라피쉬를 희생시켜 고정하고, 표본을 커버글라스에 마운팅하기 전에 눈을 조심스럽게 제거합니다.그런 다음 공초점 현미경으로 뇌혈관을 촬영합니다. 마지막으로, 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여 혈관의 3D 렌더링 이미지를 생성합니다. 최종적으로, 재구성된 이미지를 분석하여 처리 조건이 혈관 분지 및 밀도에 미치는 영향을 결정합니다.발달 중인 제브라피쉬 뇌에서 수행합니다. 이 기술은 제브라피쉬 배아의 전체 혈관계를 평가합니다. 이를 통해 우리는 기관계 수준에서 아밀로이드 베타의 생물학적 특성을 연구할 수 있었습니다.해부 및 이미지 분석은 기술적으로 까다로워 습득하기 어렵기 때문에 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 우선, 원하는 조직에서 enhanced green fluorescent protein을 발현하는 형질전환 제브라피쉬 계통을 28.5 °C에서 14시간 광주기, 10시간 암주기로 사육하십시오. 본 예시에서는 혈관 내피세포에서 EGFP를 발현하는 형질전환 물고기를 사용하며, 난자 수집 전날 밤에 수컷과 암컷을 망사 바닥이 있는 교배 탱크에 배치하여 사육합니다. 다음 날 아침, 구분막을 제거하여 물고기가 교배하도록 하고 15분마다 알이 나왔는지 확인하십시오.메쉬 스트레이너를 사용하여 알과 E3 배지를 수집하여 세척한 후, E3 배지를 이용해 알을 100 mm 배양 접시로 옮기고 28 °C에서 배양하여 뇌혈관 분기를 유도합니다. 수정 후 24시간부터 DMSO에 용해된 gamma secretase inhibitor와 같은 화학 물질을 첨가합니다. 필요한 경우, 색소 형성을 억제하기 위해 0.03% PTU를 첨가합니다.용액에 담긴 배아를 12-웰 플레이트의 웰로 옮긴 후, 배아가 원하는 발달 단계에 도달할 때까지 28.5 °C에서 배양합니다. trica로 배아를 희생시킨 후 알데하이드로 4 °C에서 하룻밤 동안 고정합니다. 배아는 PBS에 담아 4 °C의 암소에 보관하십시오.배아에서 눈을 제거하려면, 날카롭게 갈린 텅스텐 바늘을 사용하여 한쪽 눈을 연결하고 있는 조직 주변을 절개하십시오. 그다음 근육을 자르고 마지막으로 시신경을 절단하여 눈을 제거합니다. 눈이 제거되면, 배아의 빈 안와(eye socket)가 아래로 향해 커버 글라스에 닿도록 배아를 뒤집어 놓으십시오.배아를 고정하고 건조를 방지하기 위해 3% Methylcellulose를 한 방울 떨어뜨려 배아 전체를 덮어줍니다. 20 x plan APO 대물렌즈가 장착된 도립 공초점 현미경을 사용하여 배아를 즉시 촬영하십시오. 많은 이미징 시스템에서는 이 시료의 혈관 구조를 절반 정도까지만 분해능으로 포착할 수 있습니다. 이 경우, 배아를 PBS에 다시 현탁시킨 후 반대편으로 다시 마운트하여 추가 이미징을 수행하고, 3D 렌더링에 최적화된 Image J를 사용하여 뇌혈관 영상의 3D 재구성을 진행하십시오.Plugins, loci, bio formats importer로 이동하여 공초점 스택을 가져온 다음, Nikon 스택용 공초점 파일을 선택하고 hyper stack으로 스택 보기(view stack)를 선택한 후 컬러 모드를 그레이스케일(gray scale)로 설정하십시오. 그런 다음 자동 스케일(auto scale)과 채널 분할(split channels)을 체크하십시오. 이 선택을 통해 4개의 별개 채널 패널이 열립니다.파일 이름 뒤에 c=1이 붙은 16비트 이미지만 남기고 나머지는 모두 닫으십시오. 하단의 스크롤 탭을 사용하여 관심 영역이나 구조가 포함된 슬라이스를 찾을 때까지 임계값을 조정하십시오. 그런 다음 Image &gt; Adjust &gt; Threshold 메뉴로 이동하십시오.나타나는 패널에서 상단 바를 왼쪽으로 밀어 배경 대비 구조가 잘 보이도록 조정하고, 하단 슬라이더는 그대로 두어 새로운 8비트 이미지를 생성합니다. b and w를 선택한 후, dark background를 선택하십시오.각 슬라이스마다 다른 조정이 필요한 경우가 아니라면, 이미지별 임계값 계산(calculate threshold for each image)을 선택하지 마십시오. 다음으로, plugins > 3D viewer로 이동하여 threshold를 0으로, resampling factor를 1 또는 2로 설정하고, 빨간색과 파란색 색상 상자를 선택 해제하여 녹색 3D 출력물을 생성하십시오. 그렇지 않으면 흰색 렌더링 결과가 생성됩니다.그 다음 적용(apply)을 선택하십시오. 마우스와 키보드 컨트롤을 사용하여 3D 이미지를 회전, 스핀 및 확대/축소하여 원하는 지점에서 정지 영상을 저장하십시오. 메뉴의 캡처(capture) 옵션을 사용하십시오.화면에 표시되는 이미지 상자의 크기에 따라 생성되는 이미지의 픽셀 해상도가 결정되므로, 고해상도 이미지를 원할 경우 오른쪽 하단 모서리를 드래그하여 상자 크기를 키우십시오. 'view record 360 degree rotation'을 선택하여 회전하는 3D 동영상을 생성하십시오. 마지막으로, 제공되는 여러 형식 중 하나로 파일을 저장하고 무료 오픈 소스 미디어 플레이어인 VLC를 사용하여 3D 영상을 확인하십시오.혈관 구조의 재구성은 제브라피시 발달 과정에 대한 포괄적이고 시각적으로 흥미로운 관점을 제공합니다. 여기서는 내피세포에서 EGFP를 발현한 수정 후 6일 된 제브라피시 배아의 혈관 구조를 단색 녹색 또는 흰색으로 나타낸 여러 각도의 모습이 제시되어 있습니다. 신호 강도를 파악하기 어려울 수 있으나, 의사 색상(pseudo coloring)을 적용하면 룩업 테이블(lookup table)을 통해 이미지 강도를 제공하므로 중첩된 구조의 깊이감을 더 잘 인식할 수 있습니다.예를 들어, 이 그림은 수정 후 6일이 지난 제브라피쉬의 발달 과정 이후 혈관계를 의사 색채 처리한 3D 이미지입니다. 이 기술을 통해 우리는 척추동물 뇌에서 아밀로이드 베타가 혈관에 미치는 영향을 탐구할 수 있었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 혈관 신생 연구를 위한 경제적이고 접근 가능한 시스템인 제브라피쉬 배아의 혈관 네트워크를 시각화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오에서는, 우리는 공촛점 현미경으로 단세포 해상도 라이브 zebrafish의 배아에서 개발 척추 두뇌를 분석하는 방법을 보여줍니다. 이것은 우리가 단일 셀 zebrafish 배아를 주입하고 이후 개발 두뇌를 마운트와 이미지하는 방법을 포함합니다.

공촛점 현미경으로 Zebrafish 배아 뇌 영상 라이브

신경 튜브 형성 후, neuroepithelium은 수축과 튜브가 배아 두뇌 심실을 형성하기 위해 배아 뇌척수 (eCSF)로 채우고 동안 주름. 우리는 더 나은 라이브 배아에서 neuroepithelial 모양 대조적으로 액체 채워진 공간을 시각화이 뇌실 주입 기술을 개발했습니다.

Zebrafish의 두뇌 뇌실 주입

시간 경과 공 촛점 이미징은 배아 발달의 특성에 유용한 강력한 기술이다. 여기에서, 우리는 방법을 설명하고 두개 안면 야생 형에서 형태 형성뿐만 아니라 PDGFRA, smad5 및 SMO 돌연변이 배아를 특징.

4D 공 초점 현미경을 사용하여 제브라 피쉬의 두개 안면 형태 형성 분석

생체 내에서 세포 기관 및 기타 세포 내 구조의 동적 거동을 이미징하면 생리학적 및 질병 조건에서 그 기능을 밝힐 수 있습니다. 여기에서는 중심체와 미토콘드리아의 두 소기관을 유전적으로 태그하고 광시야 및 컨포칼 현미경을 사용하여 살아있는 제브라피시 배아에서 이들의 역학을 이미징하는 방법을 제시합니다.

살아있는 Zebrafish의 배아에서 세포 이하 구조를 이미징

여기에서는 정상적인 발달을 방해하지 않고 살아있는 제브라피시 배아의 후체 발달을 장기간 타임 랩스 이미징할 수 있는 다목적 장착 방법을 제시합니다.

Zebrafish의 개발의 장기 이미징을위한 다목적 장착 방법

생체 내 이미징은 신경계 발달의 근본적인 세포 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수있는 강력한 도구입니다. 여기에서 우리는 개발 제브라피시 신경계 내의 다중 색깔 Brainbow 표지세포의 다수를 구상하기 위하여 시간 경과 공초점 현미경 검사법을 이용하기 위한 기술을 기술합니다.

무지개와 타임랩스 공초점 이미징을 사용하여 살아있는 제브라피시의 뇌 발달 시각화

이 프로토콜은 제브라피시의 토토 라벨링 및 다차원 이미징의 접근 방식을 초기 눈 발달에 설명합니다. 당사는 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 이용한 라벨링, 임베딩 및 4차원(4D) 이미징을 설명하고, 광학컵 형태발생의 해부 메커니즘을 위한 데이터 집합의 획득을 최적화하기 위한 고려 사항을 설명합니다.

제브라피쉬 광학컵 모르포발생4차원 이미징

여기서 우리는 생체 내 최대 애벌레와 청소년 단계에서 제브라피시 배아 뇌를 이미지화하는 방법을 제시합니다. 전기 생리학적 접근법에서 채택된 이 미세침습 절차는 성숙한 뉴런의 세포 및 세포 세포 이하 세부 사항에 대한 액세스를 제공하며 뇌 기능 및 약물 개입을 특성화하기 위한 광유전학 및 신경 약리학과 결합될 수 있습니다.

두개골과 피부 제거에 의해 깨어 얼룩말 물고기 애벌레와 청소년에서 완전히 활성 뇌 조직의 생체 내 이미징

여기에 제시된 것은 3차원 형광 현미경을 사용한 유충 제브라피쉬의 생체 내 전뇌 이미징을 위한 프로토콜입니다. 실험 절차에는 샘플 준비, 이미지 획득 및 시각화가 포함됩니다.

생체 내 3차원 형광 현미경을 사용한 제브라피쉬 유충의 전뇌 이미징

이 프로토콜은 제브라피쉬 배아의 심장 형태 및 기능을 평가하기 위한 저비용 광학 현미경 방법을 설명하여 고급 이미징 시스템 없이도 발달 심장 독성을 재현 가능하게 평가할 수 있습니다.

표준 현미경 및 비디오 분석을 사용한 제브라피쉬 배아의 기능적 심장 영상: 환경 및 생물 의학 연구에서의 응용

학습하세요 제브라피쉬 뇌 혈관 구조의 3D 이미징 및 재구성 방법을. 공초점 현미경과 오픈소스 소프트웨어를 활용하여 혈관 발달과 아밀로이드 베타 효과를 연구할 수 있습니다.

이미징 및 배아 제브라 피쉬의 뇌 혈관 구조의 3 차원 재구성

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