이미징 및 배아 제브라 피쉬의 뇌 혈관 구조의 3 차원 재구성

이 절차의 전반적인 목표는 배아 제브라 피쉬의 뇌혈관 구조를 평가하는 것입니다. 이것은 먼저 수정된 얼룩말 물고기 알을 수집하고 처리 조건을 설정하여 수행됩니다. 3일의 성장 기간이 지난 후, 얼룩말 물고기를 희생으로 고정하고 표본을 커버 유리에 장착하기 전에 눈을 조심스럽게 제거합니다.

그런 다음 대뇌 혈관 구조를 컨포칼 현미경으로 이미지화합니다. 마지막으로, 혈관 구조의 3D 렌더링은 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여 생성됩니다. 궁극적으로, 재건 분석은 치료 조건이 혈관 분기 및 밀도에 미치는 영향을 결정하는 데 사용됩니다.

발달 중인 얼룩말 물고기의 뇌에서. 이 기술은 배아 제브라피쉬의 전체 혈관 시스템을 평가합니다. 이를 통해 우리는 장기 시스템 수준에서 아밀로이드 베타의 생물학을 연구할 수 있었습니다.

이 방법의 시각적 시연은 해부 및 이미지 분석이 기술적으로 까다롭기 때문에 배우기 어렵기 때문에 매우 중요합니다. 시작하려면 섭씨 28.5도에서 14시간 밝기, 10시간 어둡기 주기로 원하는 조직에서 향상된 녹색 형광 단백질을 발현하는 형질전환 제브라피시 균주를 제기합니다. 이 예에서 혈관 내피 세포에서 EGFP를 발현하는 형질전환 물고기는 알 채취 전날 밤에 사육되어 그물망 바닥이 있는 짝짓기 탱크에 수컷과 암컷을 설정합니다. 다음 날 아침, 칸막이를 제거하고 물고기가 짝짓기를 할 수 있도록 15분마다 알을 확인합니다.

메쉬 스트레이너를 사용하여 난자를 모으고 E 3 배지를 사용하여 씻은 후 E 3을 사용하여 난자를 100mm 배양 접시에 옮기고 섭씨 28도에서 부화시켜 뇌 혈관 분지 화를 변경합니다. 수정 후 24시간부터 DMSO에 용해된 감마 분비효소 억제제와 같은 화학 물질을 첨가합니다. 원하는 경우 0.03%PTU를 첨가하여 색소 형성을 억제합니다.

용액에 담긴 배아를 12의 웰로 옮긴 후, 웰 플레이트는 배아가 원하는 발달 단계에 도달할 때까지 섭씨 28.5도에서 배양합니다. 트리카에서 배아를 희생하고 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 알데히드로 고정한 후. 배아를 섭씨 4도의 어둠 속에서 PBS에 보관하십시오.

배아에서 눈을 제거하려면 날카로운 텅스텐 바늘을 사용하여 한쪽 눈을 연결하는 조직 주위를 자릅니다. 그런 다음 근육을 자르고 마지막으로 시신경을 잘라 눈을 제거합니다. 안구가 제거되면 배아를 빈 안와가 아래를 향하게 하고 커버 유리에 닿

3% 메틸셀룰로오스 한 방울을 첨가하여 배아를 제자리에 고정하고 배아 전체를 덮어 건조를 방지합니다. 20 x plan APO 대물렌즈 이미지가 있는 도립 컨포칼 현미경을 사용하여 이미징하는 동안 배아를 즉시 이미징하는 동안 많은 이미징 시스템은 이 표본의 절반만 혈관 구조를 해결할 수 있습니다. 이 경우 PBS에 배아를 매달아 반대쪽에 다시 장착하여 추가 이미징을 수행하고 3D 렌더링에 최적화된 이미지 J를 사용하여 뇌혈관 이미지의 3D 재구성을 수행합니다.

plugins, loci, bio formats importer로 이동하여 컨포칼 스택을 가져온 다음 Nikon 스택에 대한 컨포칼 파일을 선택하고 하이퍼 스택이 있는 보기 스택을 선택한 다음 색상 모드를 그레이 스케일로 설정합니다. 그런 다음 자동 크기 조정 및 채널 분할을 확인합니다. 이러한 선택은 4개의 개별 채널 패널을 엽니다.

파일 이름 뒤에 c가 1인 16비트 이미지를 제외한 모든 이미지를 닫습니다. 아래쪽에 있는 스크롤 탭을 사용하여 임계값을 조정하여 관심 있는 영역 또는 구조가 있는 조각을 찾기 위해 스캔합니다. 그런 다음 이미지 조정 임계값으로 이동합니다.

나타나는 패널에서 상단 막대를 왼쪽으로 밀어 구조가 배경에서 꽤 잘 보이도록 하고 하단 슬라이드는 원래 위치에 두어 새로운 8비트 이미지를 만듭니다. b와 w를 선택합니다. 그런 다음 어두운 배경.

각 슬라이스에 대해 다른 조정이 필요하지 않은 경우 각 이미지에 대한 임계값 계산을 선택하지 마십시오. 그런 다음 플러그인 3D 뷰어 임계값 0 리샘플링 요소 1 또는 2로 이동하여 빨간색과 파란색 상자를 선택 취소하여 녹색 3D 출력을 만듭니다. 그렇지 않으면 흰색 렌더링이 생성됩니다.

그런 다음, 적용을 선택합니다. 마우스와 키보드 컨트롤을 사용하여 3D 이미지를 회전, 회전 및 확대/축소하여 언제든지 정지 이미지를 저장할 수 있습니다. 메뉴에서 캡처 옵션을 사용합니다.

화면에서 이미지 상자의 크기는 생성된 이미지의 픽셀 치수를 결정하므로 고해상도 이미지를 원하는 경우 오른쪽 하단 모서리를 드래그하여 상자를 더 크게 만듭니다. 360도 회전 기록 보기를 선택하여 회전하는 3D 동영상을 만듭니다. 마지막으로 사용 가능한 여러 형식 중 하나로 파일을 저장하고 무료 오픈 소스 미디어 플레이어 VLC를 사용하여 3D를 봅니다.

혈관 구조의 재구성은 얼룩말 물고기 발달에 대한 포괄적이고 시각적으로 흥미로운 관점을 제공합니다. 여기에 표시된 것은 수정 후 6일 동안 제브라피시 배아에서 EGFP를 단색의 녹색 또는 흰색으로 발현한 혈관 구조의 여러 각도입니다. 신호 강도를 인식하는 것은 어려울 수 있지만, 유사 채색은 룩업 테이블에서 이미지 강도를 제공하여 중첩 구조에 대한 더 나은 깊이 인식을 가능하게 합니다.

예를 들어, 이 그림은 수정 후 6일 후 얼룩말 물고기의 발달 후 혈관 구조의 의사 컬러 3D 이미지를 보여줍니다. 이 기술을 통해 척추동물의 뇌에서 아밀로이드 베타의 혈관 효과를 탐구할 수 있었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 혈관 신생을 연구하기 위한 경제적이고 접근 가능한 시스템을 제공하는 배아 제브라피시의 혈관 네트워크를 시각화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.