Name: 쥐 중추 신경계에서 면역 조직 화학 분석 및 주변 림프절 조직 섹션 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: 학습하세요 쥐 중추 신경계와 주변 림프절 조직에서 이중 면역 조직 화학 분석법을 이용한 단백질 국소화 시각화 기법을. 포르말린 고정 및 파라핀 매입 후 항원 회수와 면역 표지를 통해 신경과학 및 면역학 연구에 활용할 수 있는 신뢰성 있는 프로토콜을 익히세요.

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한스 라스만(Hans Lassmann)과 얀 바우어(Jan Bauer)의 지도와 지원에 감사드립니다. 또한 탁월한 기술 지원을 해준 Katalin Benedek과 비판적이고 언어적인 평가를 해준 Caroline Westerlund에게 감사드립니다.
이 연구는 Biogen Idec, Wenner-Gren Foundation, Swedish Research Council, Swedish Association of Persons with Neurological Disabilities, Swedish Brain Foundation, EU 6TH Framework EURATools(LSHG-CT-2005-019015) 및 Neuropromise(LSHM-CT-2005-018637)의 보조금으로 지원되었습니다. 자금 제공자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할도 하지 않았습니다.

윤리 정책 본 연구는 실험 동물에 대한 스웨덴 국립 이사회와 유럽 공동체위원회 지침의 지침에 따라 수행되는 윤리적 허가에 따라 (6백9분의 86 / EEC)는 N338 / 09, N15 / 10 N65 / 10에 의해 승인 된 북한 스톡홀름 동물 윤리위원회. 1. 조직 준비 <ol><li> 관류 및 고정 <ol><li> 좌심실을 통하여 관류 transcardial 수행 이소 플루 란 동물을 마취. 0.1 M PBS (PFA)에 4 % 파라 포름 알데히드 다음 혈액 성분을 제거하기 위해 인산 완충 식염수 (PBS)와 혈관의 헹굼을 시작합니다. </li><li> PFA에 침지하여 해부 뇌, 척수 및 말초 LN 조직을 흥분시키는. 4 ° C에서 24 시간 후, 추가 처리 할 때까지 4 ° C에서 PBS에 PFA에서 조직과 상점을 전송합니다. 또는 상업적 PBS에, 250 ml의의 S &amp;에 9g의 NaCl을 용해# 246; rensen은 버퍼 750 ml의를 탈 이온수를 추가 (DH 2 O); 2.5 L의 DH 2 O.에서 HPO 2 PO 4 X 2H 2 O를 4 × 상반기 2 O 및 71.2 g 2 나 0.2 M 소렌슨 완충액 (pH 7.4) 용해 13.8 g의 NaH를 준비합니다 </li></ol></li><li> 탈수 및 삽입 <ol><li> 면도날을 사용하여 약 5 ㎜의 두께 부분으로 조직을 잘라. </li><li> 크실렌 최종적 파라핀 (표 1) 다음에 조직 테크 VIP 진공 침투 프로세서 (에탄올의 농도 상승에 침수에 기초한 표준 절차를 사용하여 티슈 경화 처리 (탈수)을 시작합니다. </li><li> 금형에 조직을 올려 놓고 &quot;파라핀 블록&quot;을 형성하기 위해 샘플 주위 유동 파라핀에 붓는다. 장기 보관은 실온 (RT)가 필요합니다. 그러나, 절편하기 전에, 하룻밤, 예를 들어, 4 ℃에서 (O / N) 블록을 냉각하기를 권장합니다.</li></ol></li></ol> 2. 단면 <ol><li> 칼에 걸쳐 앞뒤로 이동할 수 썰매 마이크로톰의 고정 홀더로 파라핀 블록을 배치합니다. 블록 및 마이크로톰 나이프 (즉, 칼의 형상에 따라, 또한 절단 속도 및 기법) 사이에 최적의 각도를 조정한다. </li><li> 파라핀 블록에서 5 μm의 두께 단면 - 3 컷. </li><li> 물 용기에 바로 절단 부분을 전송하고 유리 슬라이드에 물에서 연속적으로 마운트. </li><li> 잔류 물과 잠재적 인 기포를 제거하기 위해 종이 타월에 대해 조심스럽게 장착 섹션을 누릅니다. 상업적으로 미리 접착 코팅 된 유리 슬라이드를 추천한다. </li><li> 60 °의 C - 드라이 (50)에 난로에서 두 시간 동안 슬라이드를 장착. </li></ol> 3. 탈 파라핀 (재수 및 차단 내생 퍼 옥시 다제) <ol><li> 슬라이드는 자일 렌으로 2 배 빠져 (또는 자일 렌 대체XEM-200), 각 시간 15-20 &#39;. </li><li> 99 % 에탄올로 씻어. </li><li> 내인성 퍼 옥시 다제 활성을 차단하기 위해, 0.25 %의 과산화수소를 함유하는 메탄올 용액 30 &#39;에 대한 섹션을 배양한다. </li><li> 수분 함량 (99 %, 70 % 증가하고, 증류수에서 끝나는 에탄올을 사용하여 재수 화를 계속한다. </li><li> 커버 장착 될 때까지이 시점에서 섹션을 촉촉하게 유지해야 할 전표. </li></ol> 4. 항원 검색 <ol><li> 작업을 준비하는 단계; 60 &#39;(이 경우에는 EDTA의 pH 8.5 완충액) 항원 검색 용액 슬라이드 비등하는 찜통을 사용 (EDTA 완충액 원액 DH 2 O 50 ㎖에 용해시킨 1.21 g 트리스 및 0.37 g의 EDTA를 포함 47.5 ml의 DH 2 O) 용액의 희석 2.5ml를의 EDTA 원액. </li><li> 약에 대한 RT에 슬라이드를 냉각. 1 시간 후, 3 린스 - 트리스와 배는 생리 식염수 (TBS, 사용 대안 PBS)를 0.05 M 트리스 0.15 M의 NaCl로 구성된 완충; pH를 7.5으로 조정 위스콘신일 염산. 또는 상업적 TBS를 사용합니다. </li></ol> 5. 비특이적 결합 부위를 차단 <ol><li> , 비특이적 백그라운드 반응을 피하기 10 % 소 태아 혈청 (FCS) 및 90 % DAKO 완충액을 함유하는 차단 용액에 &#39;30 RT에서 섹션을 배양. </li></ol> 6. 두 번 Immunolabeling : 기본 애비와 동시 배양 <ol><li> 차단 솔루션 차 항체의 필요한 양을 희석 및 O / n를 4 ° C에서 품어. (1 ED1 : 1000) α-Cd68 또는 α-Iba1 (Aif1, 1 : 1000) 또는 α-Cd8α (황소 8; 1 : 200); 이중 면역 염색에 대한 α-에오 탁신 (300 일 Ccl11)를 ​​결합 . </li><li> 슬라이드는 TBS 완충액으로 3 ~ 5 배 린스 (또는 10 배 희석 DAKO 버퍼를 사용한다). </li><li> 차단 솔루션과 RT에 1 시간을 품어 : 이차 항체의 필요량 (200 바이오틴 안티 염소와 AP-복합 항 - 마우스, 모두 1) 희석. </li><li> (우리를 TBS 버퍼와 5 배 - 슬라이드 3을 씻어대안 예 10 배) DAKO 버퍼를 희석시켰다. </li><li> RT에서 1 시간 동안 블로킹 용액으로 희석하고 아비딘 - 고추 냉이 퍼 옥시 다제 착체 (HRP)와 함께 인큐베이션 슬라이드. </li><li> 슬라이드 3 린스 - TBS 버퍼 (또는 10 배 희석 DAKO 버퍼를 사용)으로 5 배. </li></ol> 7. 시각화 <ol><li> 바운드 AP 표지 이차 항체의 시각화 <ol><li> 1 L의 DH 2 O 12.1 g의 트리스 용해시켜 0.1 M 트리스 HCl 완충액을 준비하고 염산을 이용하여 pH를 조절한다. 레바 미솔 1 M 용액을 제조하기 위해 동일한 트리스 -HCl 버퍼를 사용한다. DH 2 O.에서 갓 4 %에 NaNO 2 용액을 제조 </li><li> (37 (하나의 표준 유리 큐벳에 필요한 볼륨) 빠른 블루 (FB) 기판 유리 튜브 312.5 μL의 DMF에 6.25 mg의 나프톨-AS-MX-인산을 용해 및 사전 예열 50 ㎖로 저어 50 ㎖를 얻으려면 ° C) 트리스 - 염산 완충액. 312.5 ㎕의 2 N 염산 12.5 mg의 FB RR 소금을 용해하는 것은 처리장 이전의 312.5 μl를 추가4 %에 NaNO 2 용액은 적색 및 예열 트리스 - 염산 완충액 동일한 50 ㎖로 혼합 교반한다. 노란 액체가 분명해질 때까지 가볍게 흔들어 마지막으로 이전에 제조 된 1 M의 levamisole 용액 77 μl를 추가합니다. 여액의 혼합물을 수득하고, 유리 큐벳에 넣고 슬라이드 위에 붓는다. </li><li> 37 ° C에서 배양을 시작하고 약 광학 현미경 하에서 공정을 개발하고 제어 할 수 있습니다. 매 15-30 분. 퍼지 온 경우, 새로운 혼합물로 FB 솔루션을 교체합니다. </li><li> PBS 버퍼에이어서 TBS 버퍼 및 전송에 5 배 - 슬라이드 3을 씻어. </li></ol></li><li> 결합 된 바이오틴 이차 항체의 시각화 <ol><li> DAB는 / H 2 O 2 49 ml의 PBS 1 ml의 DAB 원액 (1 ml의 PBS 당 25 mg을 DAB)을 희석하여 솔루션을 개발 준비합니다. 쏟아져 이전 섹션에 16.5 μL의 H 2 O 2 및 여과 액을 추가합니다. </li><li> 침전 이마에 발색의 DAB의 전환n 개의 안료는 즉시 할 수 있습니다. (높은 배경을 높이고 특정 신호를 마스크 수 초 이상 배양에도 몇) 광 현미경 개발 프로세스를 제어 할 수 있습니다. </li><li> 갈색 안료 석출물의 강도는 대안 적으로 &#39;5 2 % 황산구리 및 0.9 % 염화나트륨 용액으로 이루어진 배양을 향상시킬 수있다. </li><li> 슬라이드 3 린스 - PBS로 5 배 그리고 마지막으로 DH 2 O와 함께, 또는 수돗물을 사용합니다. </li><li> 커버 수성 GelTol 설치 매체를 사용하여 물에서 직접 전표와 슬라이드를 탑재합니다. 공기 방울을 생성하지 마십시오. </li><li> 설치 매체의 완전한 건조, 예를 들어, O / N에서 4 ℃로 할 수 있습니다. 스토어 RT에 슬라이드를 건조. </li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 1. </td><td> % 에탄올 </td><td> 20 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 2. </td><td> % 에탄올 </td><td> 60# 39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 삼. </td><td> % 에탄올 </td><td> 90 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 4. </td><td> % 에탄올 </td><td> 60 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 5. </td><td> % 에탄올 </td><td> 90 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 6. </td><td> % 에탄올 </td><td> 60 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 7. </td><td> % 에탄올 </td><td> 90 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 8. </td><td> % 에탄올 </td><td> 120 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 9. </td><td> 크 실롤 </td><td> 30 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 10. </td><td> 크 실롤 </td><td> 60 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 11. </td><td> 파라핀 </td><td> 60 &#39; </td><td> 60 ° C </td></tr><tr><td> 12. </td><td> 파라핀 </td><td> 60 &#39; </td><td> 60 ° C </td></tr><tr><td> 1삼. </td><td> 파라핀 </td><td> 60 &#39; </td><td> 60 ° C </td></tr><tr><td> 14. </td><td> 파라핀 </td><td> 120 &#39; </td><td> 60 ° C </td></tr></tbody></table> 조직 테크 VIP 진공 침투 프로세서에 의해 표 1. 조직 처리.

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<li>Ponder, B. A., Wilkinson, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+endogenous+tissue+alkaline+phosphatase+with+the+use+of+alkaline+phosphatase+conjugates+in+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry+%3A+official+journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Inhibition of endogenous tissue alkaline phosphatase with the use of alkaline phosphatase conjugates in immunohistochemistry.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 29, 981-984 (1981).</li>
<li>Petrelli, F., Coderoni, S., Moretti, P., Paparelli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+biotin+on+phosphorylation%2C+acetylation%2C+methylation+of+rat+liver+histones%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+reports%22%5BJournal%5D)">Effect of biotin on phosphorylation, acetylation, methylation of rat liver histones.</a> Molecular biology reports. 4, 87-92 (1978).</li>
<li>Yagi, T., Terada, N., Baba, T., Ohno, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+endogenous+biotin-containing+proteins+in+mouse+Bergmann+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Histochemical+journal%22%5BJournal%5D)">Localization of endogenous biotin-containing proteins in mouse Bergmann glial cells.</a> The Histochemical journal. 34, 567-572 (2002).</li>
<li>Van Hecke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+Immunohistochemical+Staining+Today%3A+Choices+to+Make%2C+Challenges+to+Take%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histotechnology%22%5BJournal%5D)">Routine Immunohistochemical Staining Today: Choices to Make, Challenges to Take.</a> Journal of Histotechnology. 1, 45-54 (2002).</li>
</ol>

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

표준 IHC 절차는 종종 일반적으로 폭 넓은 경험뿐만 아니라 &quot;시행 착오&quot;접근 방식을 의미 최적의 결과를 얻기 위해 특정 조정을 필요로한다. 티슈 제조에서 대상 가시화 될 때까지 상기 프로토콜 거의 각 단계는 개별적으로 최종 결과를 개선하기 위해 수정 설계를 실시 할 수있다. 여기에 제시된 이중 염색 프로토콜은 특히 신경 염증에 영향을 포르말린 고정 파라핀 포매 쥐 CNS 및 LN 조직 섹션에서 우리 관심 대상 단백질 사이의 상호 관계를 평가하기위한 조정 대상 IHC 계 단백질을 예시한다. 이와 같이,이뿐만 아니라 고급 시험 영감의 근원으로, IHC의 방법을 배우기위한 가이드로서 사용될 수있다. 그러나, 유념해야 / 또는 여기에서 최적의 결과를 생성 할 수있다 표시 이외의 조직 및 다른 단백질을 대상으로 본 프로토콜의 단순한 재생. Ccl11이 congenic 쥐 스트레인 (10)의 CNS에서 각각의 mRNA 수준의 상향 조절...

methylome, 사체 또는 프로테옴 수준에서 수행 분석 고급 높은 처리량의 사용에도 불구하고, 면역 염색은 조직 샘플, 세포 배양에 직접 단백질 검출 또는 세포 도말 검사의 황금 표준 남아있다. 지역화 / 배광 패턴을 계시하여 면역 조직 화학 (IHC)의 상대적인 비율과 목표 단백질의 지형적 상호 관계를 평가하고, 그들의 생물학적 활성을 나타낼 수있다. 따라서, IHC 널리 임상 연구 및 진단 목적, 예를 들면, 치료 평가 질병 메커니즘 동물 모델에서 기능적 표현형 변화 등의 연구에 활용 본질적 조직학, 병리학, 생화학 및 면역학을 포함 IHC 크게 형광 표지 된 항체는 감염된 조직 1 폐렴 구균 항원을 식별하기 위해 처음에 사용 된 1941 년 이후로 진행되었다. V휴대 제품과 IHC에 의해 구성 요소의 isualization은 특정 항원은 (Ag)에 대한 항체 (ABS)의 결합을 기반으로합니다. 형광 태그 된 항체를 사용하는 외에, 면역 반응은 2,3- 옥시다아제 또는 알칼리 포스 파타 아제와 같은 효소 (4)을 이용하여 가시화 될 수있다. 방사능 라벨자가 방사선 시각화하는 동안 또한, 콜로이드 금 항체 태그 (5)는 광학 및 전자 현미경 모두에 의해 특정 항원 항체 반응을 검출하기 위해 사용된다. 용 Ag-Ab의의 면역 직접 및 간접적 인 방법을 통해 검출 할 수있다. 직접적인 방법은 직접 차 애비 6 레이블 사용하기 때문에, 본질적으로 빠르고 간단합니다. 그러나, 감도 부족으로 심각한 간접 방법이 직접 사람에게 바람직하다. 두 단계 간접 검출 방법은 상기 제 7 층과 같은 기본 복근 향한 이차 복근 첫번째로, 표지되지 않은 기본 복근 및 표지 필요로한다.신호 증폭을 더 포함함으로써 달성 될 수 있으며, 효소 - 결합 급 순이 (세 단계 간접법) 보조 AB와 결합하는 것이다. 일반적으로 사용되는 간접 검출 방법은 아비딘 - 비오틴과 퍼 옥시 다제 - antiperoxidase (PAP)입니다. 대안 적으로, 알칼리성 포스파타제 antialkaline 포스파타제 (APAAP) 복합체 대신 PAP 방법을 사용할 수있다. 특히, 알칼리성 포스파타제 (AP) 방법은 immunoperoxidase 방법 4보다 더 민감한 것으로 나타납니다. 아비딘 - 비오틴 복합체 (ABC) 방법은 표지 아비딘 - 비오틴 복합체 (LAB) 중 하나와 함께 바이오틴 차 순이를 사용, 또는 스트렙 타비 딘 - 비오틴 복합체 (SLAB) 표지. 검출 감도는 상기 퍼 옥시다아제 또는 알칼리 포스 파타 아제 표지 아비딘 (8)를 포함함으로써 증가 될 수있다. 사용의 다른 검출 방법은 고분자 라벨, 타이 라민 증폭 및 면역 구름 원 9입니다. 특히, 다른 검출 방법은 동일한 조직에 다수의 Ag 검출을 위해 결합 될 수있다여기에 제시된 1978 4. 동시 이중 면역 염색에 처음보고 된 샘플은 각각, 퍼 옥시 다제 - 결합 및 AP 접합 이차 항체를 이용하여 포르말린 고정 된 파라핀 포매 쥐 CNS 및 LN 조직 절편에서 수행 하였다. 신호는 각각 (FB) APAAP 복잡한 3,3&#39;- diaminobencidine (DAB) 색 원체 및 패스트 블루를 사용하여 시각화 하였다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">시약</td></tr><tr><td>Isoflurane (Isofluran): 1-Chlor-2,2,2-trifluorethyl (difluormethyl ether) 2-Chlor-2-(difluormethoxy)-1,1,1-trifluorethan (C3H2ClF5O)</td><td>Baxter</td><td>1001936060</td><td>눈 조사. 아마도 생식력에 영향을 미치고 자궁 내 아기를 손상시킬 수 있습니다. 적절한 장비를 갖춘 마취 환경에서만 투여하십시오.</td></tr><tr><td>염화나트륨(NaCl)</td><td>Merck</td><td>1.0604</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충액 식염수(PBS), 정제</td><td>시그마-알드리치</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드(OH(CH2O)nH(n = 8 - 100)), 1x PBS</td><td>Apl pharma</td><td>34 24 28</td><td>건강 위험에서 4%. 부식성의. 가끔씩. 급성 독성.</td></tr><tr><td>에탄올 &#8805; 99.5%, 절대 (CH3CH2OH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459844-1L</td><td>Flamable.</td></tr><tr><td>크실렌(크실렌, 조직학적 등급; C6H4(CH3)2 </td><td>시그마-알드리치</td><td>534056</td><td>Flamable. 급성 독성.</td></tr><tr><td>Histo-Comp 파라핀 왁스</td><td>Tissue-Tek</td><td>V0-5-1001</td><td></td></tr><tr><td>접착 현미경 슬라이드</td><td>Starfrost</td><td>MIC-1040-W</td><td></td></tr><tr><td>Xylol 대체품 XEM-200 </td><td>Vogel GmbH</td><td>ND-HS-200</td><td>호흡기 감작. 발암 성.</td></tr><tr><td>&alpha;-CD8 (Ox-8) 마우스 anti-rat, 1차 항체</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA48G</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Iba1 (AIF1) 마우스 anti-rat, 1차 항체</td><td>Millipore</td><td>MABN92</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-CD68 (ED1) 마우스 anti-rat, 1차 항체</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA341R</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-eotaxin C-19 (CCL11) 염소 anti-rat, 1차 항체</td><td>Santa Cruz BT</td><td>SC-6181</td><td></td></tr><tr><td>알칼리성 포스파타제(AP)-접합 2차 항체</td><td>Dakopatts, 덴마크</td><td>D0314</td><td></td></tr><tr><td>비오틴화 2차 항체</td><td>Amersham Biotech</td><td>RPN1025</td><td></td></tr><tr><td>Avidin-horseradish peroxidase complex (HRP) </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3151</td><td></td></tr><tr><td>Naphthol AS-MX phosphate (C19H18NO5P)</td><td>시그마-알드리치</td><td>N4875-1G</td><td>급성 독성.</td></tr><tr><td>패스트 블루 RR 솔트, 아조익 디아조 No. 24 (C15H14ClN3O3 x 1/2 ZnCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FBS25</td><td></td></tr><tr><td>레바미솔 염산염(C11H13ClN2S)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31742</td><td>급성 독성.</td></tr><tr><td>3,3'-디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드(DAB 크로모겐)</td><td>DAKO</td><td>S3000</td><td>고인화성. 유독.</td></tr><tr><td>황산구리(CuSO4)</td><td>Merck</td><td>1.02791</td><td>급성 독성. 환경 위험.</td></tr><tr><td>GelTol 수성 장착 매체</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td>230100</td><td></td></tr><tr><td>과산화수소, 30%(H2O2)</td><td>Merck</td><td>107210</td><td>급성 독성.</td></tr><tr><td>메탄올 (CH3OH)</td><td>Fluka</td><td>65543</td><td>급성 독성. 호흡기 감작. 발암 성. 가연성.</td></tr><tr><td>트리스(하이드록시메틸) 아미노메탄, 트리스 베이스(C4H11NO3 )</td><td>AppliChem</td><td>A1379</td><td>피부 및 눈 자극.</td></tr><tr><td>Tris Buffered Saline (TBS), 정제</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5030</td><td></td></tr><tr><td>Di- 인산수소나트륨 이수화물(Na2HPO4 x 2H2O)</td><td>Merck</td><td>1.0658</td><td></td></tr><tr><td>인산이수소나트륨(NaH2PO4 x 1H2O) </td><td>Merck</td><td>1.06346</td><td></td></tr><tr><td>태아 종아리 세럼 (FCS) </td><td>Cambrex BioScience</td><td>DE-14-802F</td><td></td></tr><tr><td>DAKO cytomation 세척 버퍼 10x </td><td>DAKO</td><td>S3006</td><td>2-8°C에서 보관해야 합니다; C는 박테리아 성장을 억제합니다. 거품을 피하십시오.</td></tr><tr><td>N, N-디메틸포름아미드; DMF (C3H7NO)</td><td>Fluka</td><td>40250</td><td>가연성. 급성 독성.</td></tr><tr><td>유리 커버슬립 24 x 36 mm </td><td>Menzel-Gl&#228; ser</td><td>BB024036A1</td><td></td></tr><tr><td>염산, conc. (HCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30721</td><td>부식성, 자극성, 투과제. 폐 감작제(산성 미스트). 유독.</td></tr><tr><td>염산 용액 부피, 2 M HCl (2 N)</td><td>Fluka</td><td>71826</td><td>부식성, 자극성, 투과제. 폐 감작제(산성 미스트). 유독.</td></tr><tr><td>나트륨 아질산염, ReagentPlus, &#8805; 99.0 % (NaNO 2 )</td> <td>시그마 - 알드리치</td><td>S2252</td><td>산화제. 유독. 환경에 위험합니다.</td></tr><tr><td>에틸렌디니트릴로테트라아세트산이나트륨염 이수화물(EDTA; C10H14N2Na2O8 x 2H2O)</td><td>Merck</td><td>1.08454</td><td>경구 노출은 생식 및 발달 효과를 유발할 수 있습니다.</td></tr><tr><td colspan="4"> Equipment</td></tr><tr><td>Tissue-TekV.I.P 진공 침투 프로세서</td><td>Sakura</td><td>5902 VIP Jr. 115V, 60Hz</td><td></td></tr><tr><td>Hacker-Bright 8000 시리즈 기본 썰매 Microtome </td><td>해커 기기</td><td></td><td></td></tr><tr><td>가정용 식품 기선 </td><td>Braun</td><td>MultiGourmet FS 20</td><td></td></tr><tr><td>광학 현미경 </td><td>Leica Polyvar 2</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

쥐 중추 신경계에서 면역 조직 화학 분석 및 주변 림프절 조직 섹션

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

면역 조직 화학 (IHC)이 높은 특정 안정적이고 매력적인 단백질의 시각화를 제공합니다. IHC 기반의 빛깔 표지의 정확한 성능과 해석은 중추 신경계 (CNS) 등의 지방 함량이 높은 조직에서 목적 단백질 사이의 상호 관계를 평가하기 위해 사용될 때 특히 도전적이다. 우리의 프로토콜은 특히 쥐 CNS와 신경 염증에 의해 영향을받는 주변 림프절 (LN) 모두 구조 및 가용성 단백질의 검출을 위해 조정 된 표준 immunolabeling 기술의 정교화를 나타냅니다. 그럼에도 불구하고, 추가 수정하거나하지 않고, 우리의 프로토콜 가능성도 여기에 제시된 것보다 다른 기관과 종, 기타 관련 단백질 표적의 탐지를 위해 사용될 수있다.

더블 immunostainings (공동의 염색)는 포르말린 고정 파라핀 포함 된 쥐 CNS 및 LN 절에서 수행되었다. 3-5 μm의 두께 조직 슬라이스 사전 코팅 접착 유리 슬라이드에 연속적으로 설치 이전에 10,11,12 설명으로 처리, 썰매 마이크로톰을 사용하여 절단 하였다. 간단히 deparaffinizing, 조직 재수 내생 퍼 옥시 다제 불 활성화 한 후, 절편을 비특이적 결합 부위를 제거하는 단계를 차단 한 다음, 항원 검색 과정을 실시한다. 공동의 염색은 다음의 조합으로 수행되었다 : ⅰ) Ccl11 / 년 Iba-1, II) Ccl11 / ED1 및 ⅲ) Ccl11 / CD8. 각 공동 염색에 사용되는 주요 애비는 자신의 동시 배양을 사용할 수 두 개의 서로 다른 종 (각각 염소 및 마우스)에 제기되었다. 이바-1 ED1과 CD8은 청색 AP 신호 시각화 동안 Ccl11는 갈색 퍼 옥시 다제 반응 생성물에 의해 가시화 하였다. </...

여기에서는 포르말린 고정, 파라핀 포매 쥐 중추신경계(CNS) 및 말초 림프절(LN) 조직 절편에서 이중 면역 염색을 위한 최적화되고 상세한 프로토콜을 제시합니다.

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

본 실험 절차의 전체적인 목표는 쥐 조직 내의 특정 단백질을 표적화하는 것입니다. 이를 위해 먼저 조직을 분리, 고정 및 파라핀 포매한 후, 조직을 절편화하여 슬라이드에 부착합니다. 두 번째 단계는 파라핀 포매된 조직 절편의 파라핀을 제거하고 재수화시킨 다음, 내인성 퍼옥시다아제를 차단하는 것입니다.다음으로, 항원 회복 과정을 통해 에피토프를 노출시킵니다. 이어서 항체를 도입하기 전, 비특이적 결합을 줄이기 위해 블로킹을 수행합니다. 마지막 단계는 1차 및 2차 항체를 이용한 면역 표지로 특정 에피토프를 검출하고, 표지된 2차 항체로부터 신호를 발색시키는 것입니다.최종적으로, 조직 절편 내 단백질 국소화 패턴을 확인하기 위해 광학 현미경을 사용하여 신호를 시각화합니다. 이 방법은 쥐의 중추신경계 및 말초 림프절 내 단백질 국소화와 발현 패턴에 대한 통찰을 제공할 수 있으며, 다른 장기 및 종에도 적용 가능합니다. 실험 절차 시연은 기술자가 수행합니다.Karolinska Institutet의 미생물학 종양 및 세포 생물학 센터 핵심 시설 소속 Katalin Benedek입니다. 조직 준비를 시작하려면, 적출한 뇌, 척수 및 말초 림프절 조직을 4% 파라포름알데히드에 담근 후 4°C에서 24시간 동안 보관하십시오. 조직 고정이 완료되면, 조직을 P-B-S로 옮겨 추가 처리 시까지 4°C에서 보관하십시오.조직 처리를 시작하려면 면도날을 사용하여 조직을 약 5mm 크기로 절단하십시오. 그런 다음 진공 침투 처리기를 사용하여 조직 경화 과정을 시작합니다. 표준 절차는 에탄올의 농도를 단계적으로 높여 침전시킨 후, 자일롤(xylol), 마지막으로 파라핀에 침전시키는 방식입니다.다음으로, 조직을 몰드에 넣습니다. 샘플 주변에 액체 파라핀을 부어 파라핀 블록을 형성하고 실온에서 보관합니다. 조직을 절편하기 전에 콜드 플레이트나 냉장고에서 파라핀 블록을 하룻밤 동안 냉각시킵니다.파라핀 블록이 냉각되면, 나이프를 가로질러 전후로 이동할 수 있는 슬레지 마이크로톰(sledge microtome)의 고정 홀더에 블록을 장착하십시오. 그런 다음, 나이프의 기하학적 구조와 절단 속도 및 기술에 따라 블록과 마이크로톰 나이프를 최적의 각도로 조정하십시오. 파라핀 블록에서 5 µm 두께의 횡단면을 3개 절단하십시오.그 다음, 절단된 섹션들을 물 컨테이너로 옮기고, 물속의 섹션들을 상용 프리코팅 접착 유리 슬라이드에 마운팅합니다. 이어서, 마운팅된 섹션을 페이퍼 타월로 조심스럽게 눌러 잔류 수분과 발생 가능한 기포를 제거합니다. 마운팅된 슬라이드를 50 to 60 °C로 설정된 오븐에서 몇 시간 동안 건조합니다.슬라이드가 마르면, 각 15~20분씩 2회 exiled-xylol에 침지합니다. 그런 다음, 각 슬라이드를 99% 에탄올로 헹굽니다. 내인성 peroxidase 활성을 차단하기 위해, 0.25% 과산화수소가 포함된 메탄올 용액에서 절편을 30분 동안 배양합니다.그 다음, 수분 함량이 점점 높아지는 에탄올 용액으로 헹구어 조직 절편의 재수화를 계속 진행합니다. 마지막 재수화 단계는 증류수에서 수행합니다. 커버슬립을 덮을 때까지 절편이 마르지 않도록 주의하십시오.항원을 회수하기 위해, 가정용 스티머와 pH 8.5의 EDTA 버퍼를 사용하여 슬라이드를 60분 동안 가열합니다. 그 후, 슬라이드를 실온에서 약 1시간 동안 냉각합니다. 슬라이드가 식으면, 각 슬라이드를 Tris-buffered saline(또는 T-B-S)으로 3~5회 헹굽니다.다음으로, 비특이적 배경 반응을 차단하기 위해 10% fetal calf serum과 90% 세척 완충액이 포함된 블로킹 용액에서 조직 절편을 실온에서 30분 동안 배양합니다. 조직 절편의 블로킹이 완료되면, 필요한 양의 1차 항체를 블로킹 용액에 희석하고, 이 1차 항체 용액에서 슬라이드를 4°C로 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, T-B-S 완충액으로 슬라이드를 3~5회 헹굽니다.그런 다음 블로킹 용액에 희석한 2차 항체와 함께 슬라이드를 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 이후 T-B-S 버퍼로 슬라이드를 3~5회 다시 세척합니다. 이어서 블로킹 용액에 1:100로 희석한 avidin horseradish peroxidase complex와 함께 슬라이드를 실온에서 1시간 동안 배양합니다.1시간의 배양이 완료되면, 슬라이드를 T-B-S 버퍼로 3~5회 헹굽니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 fast blue 용액을 준비한 후, 디쉬를 가볍게 흔들어 얻은 혼합물을 여과합니다. 이 용액을 유리 큐벳에 담긴 슬라이드 위에 붓습니다.37 °C에서 배양을 시작하고, 15분에서 30분마다 광학 현미경으로 발색 과정을 관찰합니다. 배양이 완료되면 슬라이드를 T-B-S 완충액으로 3~5회 헹군 후, 이어서 P-B-S 완충액으로 옮깁니다. D-A-B 과산화수소 발색 용액을 제조하려면, 먼저 D-A-B 스톡 솔루션 1 mL를 49 mL의 P-B-S에 희석합니다.과산화수소 16.5 µL를 첨가한 후 용액을 여과합니다. 용액을 슬라이드 위에 붓고, 특이적 신호를 가릴 수 있는 높은 배경값을 방지하기 위해 광학 현미경 하에서 발색 과정을 반드시 조절하십시오. 그 다음, 슬라이드를 PBS로 3~5회 헹구고, 마지막으로 증류수 또는 수돗물로 세척합니다.수성 마운팅 매질을 사용하여 물에서 바로 슬라이드에 커버 슬립을 덮습니다. 커버 슬립과 슬라이드 사이에 기포가 생기지 않도록 주의하십시오. 절편을 마운팅한 후, 마운팅 매질이 완전히 건조될 수 있도록 슬라이드를 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.건조된 슬라이드는 상온에서 보관하십시오. 면역화 7일 후 쥐에서 분리한 말초 림프절 조직 절편을 이중 염색한 결과, cd8 양성 t 림프구는 케모카인 C-C-L 11을 분비하지 않는 것으로 나타났습니다. 대신, C-C-L 11은 활성화된 대식세포의 리소좀 단백질 마커인 E-D one과 공국소화되는 것이 확인되었습니다.쥐 척수의 IHC 이중 염색 결과, neuronal perikarya, 수지상 돌기 및 축삭에서 CCL11 생성은 확인되었으나, IBA1 양성 대식세포와 뇌 상주 미세아교세포에서는 확인되지 않았습니다. 또한, ED1 양성 대식세포와 뇌 상주 미세아교세포의 대부분 역시 CCL11 양성이 아닌 것으로 나타났습니다. 이 영상을 시청한 후, 조직 절편에서 단백질을 직접적으로 표적하는 구체적이고 신뢰할 수 있는 면역조직화학법 수행 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.

immunohistochemical-analysis-rat-central-nervous-system-peripheral

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 마우스 뇌 절편의 Meynert 영역의 핵 기저부에 있는 콜린성 섬유의 면역조직화학적 염색을 보여줍니다. 절편을 차단하고 콜린 아세틸전이효소에 대한 1차 투여한 후 비오틴화된 2차 항체를 투여합니다. Avidin-biotin-peroxidase 복합체가 추가되어 2차 항체에 결합한 다음 발색 기질에 결합합니다. 그런 다음 단면을 탈수하고 장착한 후 현미경으로 시각화합니다.

마우스 뇌의 Meyner의 핵 기저부에서 신경 섬유의 면역조직화학적 염색

출처: Evilsizor, M. N., et. al., 저온 절개 쥐 뇌 조직에 대한 면역 조직 화학을 위한 프라이머: 미세아교세포 및 뉴런에 대한 염색 예. J. Vis. Exp. (2015)이 비디오는 미세아교세포와 뉴런의 공간 배열을 시각화하기 위해 동결절제된 쥐 뇌 조직에 대한 단계별 면역조직화학 염색 절차를 보여줍니다.

미세아교세포와 뉴런을 위한 쥐 코로나 조직 동결절편의 면역조직화학적 염색

이 입문 수준 프로토콜은 미세아교세포와 신경 요소에 대한 마커를 예로 들어 설치류 뇌의 면역조직화학적 염색을 완료하는 데 필요한 시약, 장비 및 기술을 설명합니다.

미세 아교 세포와 신경 세포에 대한 예 염색 : 저온 절단 된 쥐의 뇌 조직에서 면역 조직 화학에 대한 입문서

여기서, 우리는 림프절 (LN) 저온 절에 접착제 종양 세포의 정량화를 허용하는 간단하고 저렴한 방법을 설명합니다. LN 부착 종양 세포는 가벼운 현미경 검사법에 의해 용이하게 규각되고 형광 기반 방법에 의해 확인되며, LN parenchyma에 종양 세포 결합 친화도를 드러내는 접착 지수를 제공합니다.

림프절 저온 절에서 종양 세포 접착의 정량화

주요 골반 신경절은 골반 기관을 속이 되는 부교감 및 교감 신경세포를 포함합니다. 여기에서 우리는 해부 방법을 설명하고 이 중추및 관련 신경의 확인을 위한 회로도를 제공합니다. 이들 방법은 추가 연구를 위해 생체 내 이러한 중추골의 실험적 조작 또는 제거 사후 처리에 적용될 수 있다.

남성과 여성 쥐에서 골반 자율 신경절 및 관련 신경의 해부

이 원고는 마우스에서 활성 실험자가 면역 뇌척수염(EAE)을 유도하는 프로토콜을 제시한다. 중추신경계(CNS)에서 침투된 림프구의 분리 및 특성화 방법도 림프구가 CNS 자가면역 질환의 발병에 어떻게 관여하는지 보여주기 위해 제시된다.

실험적인 자가면역 뇌척수염 중 중추신경계에서 림프구 침투의 흐름 세포 분석

이 논문은 뇌, 척수 및 수막을 포함한 중추 신경계 내에서 상주 및 말초 유래 면역 세포를 검사하기 위한 두 가지 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 이러한 각 프로토콜은 정상 상태 및 염증 조건에서 이러한 구획을 차지하는 세포의 기능과 구성을 확인하는 데 도움이 됩니다.

면역 세포의 다운스트림 분석을 위한 중추신경계 조직 및 관련 수막 분리

여기서는 흉부 덕트 림프구를 수집하고 시간 경과 사진을 사용하여 3 시간 동안 쥐 페이어의 패치에서 장 열대 림프구의 이동을 관찰하는 정확한 방법을 설명합니다. 이 기술은 림프구의 역학이 염증 성 조건하에서 어떻게 영향을 받는지 명확히 할 수 있습니다.

쥐 페이어의 패치에서 림프구 역학의 현미경 관찰

자유 부동 기술을 통해 연구원들은 고정된 조직 절편에서 면역조직화학을 포함한 조직학적 기반 염색을 수행하여 생물학적 구조, 세포 유형, 단백질 발현 및 국소화를 시각화할 수 있습니다. 이것은 뇌, 심장 및 간과 같은 여러 조직을 조사하는 데 유용할 수 있는 효율적이고 신뢰할 수 있는 조직화학 기술입니다.

자유 부유 조직 절편을 사용한 조직학적 기반 염색

마우스 중추 신경계의 조직학적 분석을 위한 편리한 중력 공급 관류 방법이 제시된다. 인산화된 α시누클레인의 면역형광 검출은 파킨슨병의 마우스 모델에서 입증된다. 이 연구는 또한 심질 관류, 해부, 조직 동결 / 임베딩 및 냉동 절개 단계를 포괄적으로 설명합니다.

마우스 중추 신경계의 조직학적 분석을 위한 중력 공급 심질 관류 방법

이 프로토콜은 알레르기 비염의 쥐 모델을 평가하기 위한 다색 면역형광 기법을 설명합니다.

Multicolor Immunoassay를 통한 알레르기 비염 쥐의 코 점막 조직 절편에서 면역형광 라벨링

학습하세요 쥐 중추 신경계와 주변 림프절 조직에서 이중 면역 조직 화학 분석법을 이용한 단백질 국소화 시각화 기법을. 포르말린 고정 및 파라핀 매입 후 항원 회수와 면역 표지를 통해 신경과학 및 면역학 연구에 활용할 수 있는 신뢰성 있는 프로토콜을 익히세요.

쥐 중추 신경계에서 면역 조직 화학 분석 및 주변 림프절 조직 섹션

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