쥐 중추 신경계에서 면역 조직 화학 분석 및 주변 림프절 조직 섹션

이 절차의 전반적인 목표는 쥐 조직의 특정 단백질을 표적으로 삼는 것입니다. 이것은 먼저 조직을 분리, 고정 및 파라핀 삽입한 다음 조직을 절단하고 슬라이드에 장착함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 파라핀이 함유된 조직 절편을 파라핀화하고 재수화한 다음 내인성 과산화효소를 차단하는 것입니다.

다음으로, 항원결정기는 항원 검색에 의해 밝혀집니다. 그 후, 항체를 도입하기 전에 비특이적 결합을 줄이기 위해 차단을 수행합니다. 마지막 단계는 1차 및 2차 항체로 면역 표지하여 특이적 항원결정기를 검출하고, 표지된 2차 항체에서 신호를 발생

궁극적으로 신호는 조직 단면의 단백질 국소화 패턴을 보여주기 위해 광학 현미경을 사용하여 시각화됩니다. 이 방법은 쥐의 중추 신경계와 말초 림프절의 단백질 국소화 및 발현 패턴에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 다른 장기 및 종에도 적용할 수 있습니다. 절차를 시연하기 위해 기술자가 될 것입니다.

그녀의 이름은 카롤린스카 연구소(Karolinska Institutet)의 미생물학 종양 및 세포 생물학 센터의 핵심 시설에서 근무하는 카탈린 베네덱(Katalin Benedek)입니다. 조직 준비를 시작하려면 절개된 뇌, 척수 및 말초 림프절 조직을 4% 파라포름알데히드에 담그고 섭씨 4도에서 24시간 동안 둡니다. 조직이 고정된 후 조직을 P-B-S로 옮기고 추가 처리까지 섭씨 4도에서 보관합니다.

조직 처리를 시작하려면 면도날을 사용하여 조직을 약 5mm 크기로 자릅니다. 그런 다음 진공 침투 프로세서로 조직 경화 과정을 시작합니다. 표준 절차는 에탄올의 농도가 상승하는 것을 기반으로 하며, 그 다음에는 자일롤, 마지막으로 파라핀이 뒤따릅니다.

다음으로 조직을 틀에 넣습니다. 샘플 주위에 액체 파라핀을 부어 파라핀 블록을 형성하고 실온에서 보관하십시오. 조직을 절단하기 전에 파라핀 블록을 냉각판이나 냉장고에서 밤새 식히십시오.

파라핀 블록이 식은 후 칼을 가로질러 앞뒤로 움직일 수 있는 썰매 마이크로톰의 고정 홀더에 블록을 놓습니다. 그런 다음 블록과 마이크로톰 나이프를 나이프의 형상과 절단 속도 및 기술에 따라 달라지는 최적의 각도로 조정합니다. 파라핀 블록에서 5미크론 두께의 단면 3개를 자릅니다.

그런 다음 절단된 부분을 물통으로 옮기고 물에서 나온 부분을 미리 코팅된 상업용 접착 유리 슬라이드에 장착합니다. 그런 다음 장착된 부분을 종이 타월에 조심스럽게 눌러 잔여 물과 잠재적인 기포를 제거합니다. 장착된 슬라이드를 섭씨 50도에서 60도로 설정된 스토브에서 몇 시간 동안 건조시킵니다.

슬라이드가 마르면 슬라이드를 자일롤에 두 번 각각 15-20분 동안 담그십시오. 그런 다음 각 슬라이드를 99% 에탄올로 헹굽니다. 내인성 과산화효소 활성을 차단하려면 0.25% 과산화수소를 함유한 메탄올 용액에서 절편을 30분 동안 배양합니다.

그런 다음 수분 함량이 증가하는 에탄올 용액으로 헹궈 조직 부분을 계속 수분을 보충합니다. 증류수에서 최종 재수화 단계를 수행합니다. 커버 슬립이 장착될 때까지 섹션을 촉촉하게 유지하십시오.

항원을 회수하려면 가정용 찜기와 EDTA 버퍼로 슬라이드를 pH 8.5에서 60분 동안 가열합니다. 그런 다음 슬라이드를 실온에서 약 1시간 동안 식힙니다. 슬라이드가 식으면 각 슬라이드를 Tris-buffered saline 또는 T-B-S로 3-5회 헹굽니다.

다음으로, 10%의 태아 송아지 혈청과 90%의 세척 완충액을 함유한 차단 용액에서 조직 절편을 실온에서 30분 동안 배양하여 비특이적 배경 반응을 차단합니다. 조직 절편이 차단된 후, 차단 용액에 필요한 양의 1차 항체를 희석하고 이 1차 항체 용액의 슬라이드를 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 다음날, T-B-S 버퍼로 슬라이드를 3-5회 헹굽니다.

그런 다음 차단 용액에 희석된 2차 항체와 함께 슬라이드를 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 그 후, 다시 T-B-S 버퍼로 슬라이드를 3-5회 헹굽니다. 그런 다음, 슬라이드를 avidin horseradish peroxidase complex로 배양하고, 차단 용액에 1 내지 100으로 희석하고, 실온에서 1 시간 동안 배양한다.

1시간 배양이 완료되면 T-B-S 버퍼로 슬라이드를 3-5회 헹굽니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 빠른 청색 용액을 준비한 후 접시를 가볍게 흔들고 얻어진 혼합물을 여과합니다. 용액을 유리 큐벳의 슬라이드에 붓습니다.

섭씨 37도에서 배양을 시작하고 15-30분마다 광학 현미경으로 현상 과정을 관찰합니다. 일단 배양이 완료되면, T-B-S 완충액으로 슬라이드를 3-5회 헹구고, 그 후에 슬라이드를 P-B-S 완충액으로 옮깁니다. D-A-B 과산화수소 현상액을 만들려면 먼저 D-A-B 원액 1ml를 P-B-S 49밀리리터에 희석합니다.

16.5마이크로리터의 과산화수소를 첨가한 다음 용액을 여과합니다. 용액을 슬라이드에 붓고 특정 신호를 가릴 수 있는 높은 배경을 피하기 위해 광학 현미경 아래에서 현상 과정을 제어해야 합니다. 그런 다음 P-B-S로 슬라이드를 3-5회 헹구고 증류수 또는 수돗물로 마지막으로 씻습니다.

수성 장착 매체를 사용하여 물에서 직접 커버 슬립이 있는 슬라이드를 장착합니다. 커버 슬립과 슬라이드 사이에 기포가 생기지 않도록 하십시오. 섹션을 장착한 후 섭씨 4도에서 밤새 슬라이드를 배양하여 장착 매체가 완전히 건조되도록 합니다.

건조된 슬라이드는 실온에서 보관하십시오. 면역 접종 후 7일째에 쥐에서 분리한 말초 림프절 조직 절편을 이중 염색한 결과, cd8 양성 t 림프구가 케모카인 C-C-L 11을 분비하지 않는 것으로 밝혀졌습니다. 대안적으로, C-C-L 11은 활성화된 대식세포에서 리소좀 단백질에 대한 마커인 E-D one과 공동 국소화하는 것으로 밝혀졌습니다.

쥐의 척수에 대한 I-H-C 이중 염색은 신경세포 페리카리아, 수상돌기 및 축삭돌기에서 C-C-L 11 생성을 확인했지만 I-B-A 1 양성 대식세포와 뇌 상주 미세아교세포에서는 확인되지 않았습니다. 또한, 대다수의 E-D one 양성 대식세포와 뇌에 상주하는 미세아교세포도 C-C-L 11 양성이 아닌 것으로 밝혀졌다. 이 동영상을 시청한 후에는 조직 절편에서 단백질에 대한 특이적이고 신뢰할 수 있는 면역조직화학적 표적화를 직접 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.