Name: 의 모니터링 단백질 접힘에 대한 결합 분석 실험 사카 cerevisiae의 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 52 s
Description: 배우세요 Saccharomyces cerevisiae에서 형광 현미경과 효소 분석을 결합하여 단백질 재접힘과 재용해됨을 실시간으로 모니터링하는 방법을. 이 기법은 단백질 항상성 네트워크 구성 요소의 역할을 연구하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 KAM 우리는 또한 FFL을 제공하는 토론토 대학의 존 글로버 감사 JLA에 미생물 로버트 D. 왓킨스 대학원 학생 연구 친교의 미국 사회에 건강의 국립 연구소 (NIGMS-074696)에서 부여에 의해 지원되었다 -GFP 소스 플라스미드.

1. 플라스미드 FFL-GFP를 포함 균주의 건설 본 연구의 경우, 사카 cerevisiae의 변형 BY4741 (MAT, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0)는 효모 녹아웃 컬렉션 (오픈 바이오 시스템 / 온도 과학)에서 HSP104 삭제 변형과 함께 사용되었다. 삭제가 서양 얼룩 분석을 위해 Hsp104 특정 항체를 사용하여 확인 하였다. FFL-GFP는 저자에게 요청 토론토 17 대학교 얻을에서 글로버 실험실에서 얻은 플라스미드 LEU2 기반의 소스로부터 구성, p426MET25-FFL-GFP의 표현되었다. FFL-GFP 플라스미드 융합 단백질의 발현은 MET25 메티오닌 - repressible 프로모터에 의해 제어됩니다. 플라스미드는 Gietz 등에서 적응 된 프로토콜을 사용하여 각 균주에 형질 전환 하였다. AL, 1995 <ol><li> 25 ML (을)를 원심 분리<html> 2 분 동안 4,400 rpm에서 50 ML 원뿔 튜브 F 로그 상 세포는 두 번 증류수 H 2 0 (DDH 2 O) 500 μL로 씻어 supernate 버립니다. </li><li> TE / LiAc (트리스 - 염산 10 MM, 산도 = 7.5, 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 0.1 M 리튬 아세테이트) 250 μL의 세포를 resuspend. 20 분 동안 혼합하지 않고 30 ° C에서 알을 품다. </li><li> 캐리어 DNA의 5 ML (50 μg)와 플라스미드 DNA의 5 μL (0.1 ~ μg)과 함께 새로운 튜브에 유능한 세포의 50 μl를 전송합니다. PEG / TE / LiAc (TE / LiAc 플러스 40 % 폴리에틸렌 글리콜과 같은)이 혼합물에 300 μl를 추가하고 ° C로 30 분 30 세포를 품어. </li><li> 6 분 동안 42에서이 혼합물 및 열 충격 ° C에 1 / 10 부피 (v / v)의 DMSO를 (36 μL)를 추가합니다. </li><li> 30 초 및 제거 supernate 6,000 rpm에서 혼합물을 원심 분리기. 우라실 (SC-URA)을 부족 합성 완벽한 매체에 멸균 DDH 2 0과 플레이트 세포 100 μL의 세포를 resuspend을. </li></ol> 2. FFL-GFP 유도 이전의 열 충격 단백질의 대부분은 새로 말기 노화 관련 세포의 부적절로 인해 시간이 지남에 따라 집계 한 단백질을 방지하기 위해 만든 그래서 세포가 로그 상에 한 번 NT는 &quot;&gt; FFL-GFP가 유도된다. <ol><li> 1 일 : 30 SC-URA 5 ㎖의 세포를 품어 ° C 회전 O / N. </li><li> 주 2 : 측정 OD 600 SC-URA OD 600 ~ 0.2 5 ㎖에 접종 신선한 문화. </li><li> 그들은 로그 단계 OD 600 ~ 0.8 ~ 1.0에 도달 ° C까지 30 회전 문화를 품어. </li><li> DDH 2 0 500 μL에 3 분, 가만히 따르다 supernate 및을 Resuspend 세포 펠렛을 위해 4,400 rpm에서 15 ML 원뿔 튜브에 세포를 원심 분리, microcentrifuge 관에 전송 솔루션을 제공합니다. </li><li> 6,000 rpm에서 원심 분리 supernate 버린다. </li><li> SC-URA-MET 5 ㎖의 세포를 resuspend을. 세포는 30 ℃에서 1 시간 동안이 미디어에서 회전 배양해야한다 </li><li> 원심 분리기 세포와 반복 DDH 2 0 씻어 supernate 버립니다. </li><li> Resuspe100 ㎍ / 단백질 발현을 억제하고, 3 단계로 바로 진행 cycloheximide의 ML을 포함하는 10 ML SC-URA 미디어에서 차 전지. </li></ol> 3. 효소 FFL-GFP 복구 분석 이 분석은 인구 활성 효소의 수준을 결정하는 정량적 인 방법입니다. <ol><li> 이 분석을위한 준비 : <ol class="lroman"><li> 각 샘플의 OD 600을 측정합니다. </li><li> D-루시페린의 필요한 양을 준비하는 것은 샘플의 수를 기반으로 복제 갯수 튜브 약 1,200 μl를 원하는했습니다. D-루시페린의 최종 농도는 세포 100 μL 당 ~ 23 μg이다. 처음에이 7.5 밀리그램 / ML의 원액 농도에서 물에 용해되어 이전의 실험 455 ㎍ / SC에서 ML로 희석. 각 샘플은 D-루시페린이 사용되는 2.4 ML의 총에서 발생 하였다는 그림 2에서는 세 복제합니다. </li><li> 플래시 루미위한 프로그램 플레이트 리더nescence 분석 (BioTek GEN5 &quot;주입 발광 플래시 분석&quot;에서 적응하며 다른 악기 제조 업체의 지침을 따르십시오 경우) <ol class="lalpha"><li> 30 ° C로 온도를 설정 </li><li> , D-루시페린을 추가 흔들어 개별적 잘 읽어 플레이트 리더를 설정합니다. </li><li> 발광을 읽고 (엔드 포인트 읽기, 5 초 적분 시간, 180 감도 레벨) </li><li> 5 분마다 독서 동요 사이에 복구 분석을 위해 20 분 지연 및 추가 5 분 흔들. </li><li> 인젝터에서 D-루시페린의 50 μl를 분배. </li></ol></li></ol></li><li> 세포는 단백질 합성을 중단 cycloheximide를 포함하는 미디어에 추가 한 후 예열 충격 발광은 즉시 측정한다. <ol class="lroman"><li> 단색 흰색 96 웰 플레이트에 복제의 원하는 번호와 함께 샘플 세포를 100 μl를 전송합니다. </li><li> 컨트롤은 물을 빈 빈 벡터를 포함하는 세포를 포함해야합니다. </li><li> SPE와 읽기를 시작합니다cifications 위에 나열된. </li></ol></li><li> FFL-GFP의 FFL 부분을 변성, 42에서 유리 문화 튜브에 5 ML 문화를 품어 ° C 25 분 동안 흔들어. </li><li> 세포는 시점 0입니다 인큐베이터에서 제거 된 후 복구 분석 발광 판독이 즉시 시작됩니다. 처음 점과 90 분마다 30 분 동안 위에서 설명한 동일한 측정 발광. </li><li> OD 600 (OD 600로 예열 충격 값을 분할)에 따라 조정되었습니다 예열 충격 발광 값으로 샘플을 정상화. </li></ol> 4. 형광 현미경 이 분석은 세포의 인구에서 시간이 지남에 따라 골재의 가용화를 결정하는 정량적 인 방법입니다. <ol><li> 유도 2 절에 설명 된대로 동일한 프로토콜의 1-8 단계를 반복합니다. </li><li> 동시에 점 (제 3, 4 단계) 위에서 설명한대로 수행되지만 마이크에 대한roscopy 1 예열 충격에서 세포의 ML 각 복구 시점 및 ° C 배양 관에서 30 회전 부화 샘플을 수집합니다. </li><li> 시각화 : <ol class="lroman"><li> 30 초 및 제거 supernate 6,000 rpm에서 전지 1 ㎖를 원심 분리기. </li><li> DDH 2 O 2 μL의 세포 펠렛을 Resuspend </li><li> 셀 플러스 슬라이드에 2 % 낮은 용융 아가로 오스 2 μL 2 μL를 혼합 커버 슬립을 추가합니다. 세포의 단일 비행기를 얻기 위해 가볍게 커버 슬립의 중앙에 손가락을 아래로 눌러 커버 슬립 이동하기 어려울 때까지 돌립니다. </li><li> 세포는 형광 현미경 100X 오일 목표를 사용하여 시각화, GFP의 형광을 시각화하는 세포와 FITC 필터를 시각화하는 DIC 사용합니다. </li><li> 정량 각 시점에서 각 변형에 대한 여러 사진을 촬영합니다. 사진에 대한 필드는 양적 사후 실험 분석을 위해 ~ 15-30 세포를 포함해야합니다. </li><li> 집계를 포함하는 세포의 비율을 계산하려면 50을 계산-100 세포는 총 집계를 포함하는 셀의 수를 나눕니다. </li></ol></li></ol> 5. 단일 셀 현미경 이 방법은 시간이 지남에 따라 단일 셀에서 개별 집계의 가용화를 따라하는 데 사용됩니다. <ol><li> 제 2 장에서 설명한대로 FFL-GFP의 발현을 유도, 1-8 단계를 반복합니다. </li><li> 후 열 충격, 2 분 동안 4,400 rpm에서 15 ML 원뿔 튜브 원심 분리기 세포. </li><li> DDH 2 O 20 μL에 물을 Resuspend 500 μL와 세포를 씻으 </li><li> 각 변형에 대해, SC-URA 한천 플레이트 5X5 mm 섹션을 잘라 페트리 접시, 피펫 팁과 한천의 표면 주위 세포의 확산 μL 피펫 4와 접촉 한 표면을 사용. ~ 1 분 동안 서 보자. </li><li> ~ 55mm 유리 바닥 요리의 번호 0에 얼굴을 아래로 한천 큐브 섹션을 배치하고 가볍게 눌러 핀셋을 사용합니다. </li><li> 시각화 : <ol class="lroman"><li> 분파에 I-III를 참조하십시오이온 4. </li><li> 세트는 문화의 밀도에 따라 각 균주 2-4 초점 포인트에 대한 좌표. </li><li> (- 0.5-1.0 μm의 슬라이스 두께 / + 15 μM) 90 분 동안 5 분마다 적절한 범위 Z-스택 사진을 찍을 카메라를 설정합니다. </li></ol></li></ol>

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 문서에서는 모델 단백질은 FFL-GFP는 효모 disaggregase이 Hsp104 단백질 재 가용화 및 수리에 기여하는 것을 보여주기 위해 사용되었다. 효소 분석과 현미경 차동 접힘 효율과 수율을 결정하기 위해 동일한 기판 단백질의 상태를 심문. 효소 복구 분석의 결과는 비효율적 hsp104D 균주의 최대 복구 만이 아니다하는 것이 좋습니다,하지만 전개 스트레스의 초기 크기는 돌연변이 균주 (그림 2)에서 더 컸다. 분석은 또한 hsp104D 세포가 복구를 시도하는 것으로 나타났다 동안, 그들은 빨리 WT 세포와 같은 단백질을 재 접힘 할 수 없습니다 것을 보여줍니다. 이 메서드는이 단백질의 수리 Hsp104의 중요한 역할을 드러내는 FFL-GFP 활동의 민감하고 정량 분석​​을 허용했다. 현미경 결과 변성 FFL 효소의 비효율적 인 수리에 대한 이유는 T 때문이라고 제안오 단백질은 집계에서 트래핑. 인구 분...

인간의 알츠하이머, 파킨슨 병, 헌팅턴의 질환 등 퇴행성 신경 질환은 단백질의 misfolding 및 집계 10에 연결되어있다. 세포는 잘못 접힌 비활성 구조 6으로 세포 단백질의 운동 포획을 방지하기 위해 분자 보호자를 사용합니다. 보호자는 세포 내의 복잡한 상호 작용 네트워크에 참여하지만, 그것은 완전히 이러한 상호 작용의 합이 생명체의 proteostasis에 기여하는 방법을 이해하지 않습니다. 세포질 단백질 폴딩의 대부분을 담당하는 주 보호자의 하나는 70 kD의 열 충격 단백질 (Hsp70의) 가족 19이다. 이 표시되었음을 Hsp70의 감소 효모 손실 초기 발현 된 FFL을 접을 생체 18, 7 내인성 단백질, 오르니 틴 transcarbamoylase를 재 접힘 할 수있다. 실시간에 가까운 해상도로 접는 분석 할 수있는 능력은 이해를 촉진하는 방법을 추가로 휴대 요인 연속이 Hsp70의 종속 프로세스에 ribute. 또한, 폴딩 / 반응 접힘은이 기여하는 단백질에 완전히 의존하지 않을 수 있으므로 분석은 반응 속도와 효율성에 크고 작은 변화를 모두 감지 할 정도로 민감해야합니다. 효모 세포 disaggregase, Hsp104는 집계 잘못 접힌 단백질을 수리에서 중요한 역할을합니다. Hsp104 상동는 곰팡이와 식물에서 발견되었지만,이 가족은 후생에없는 것 같습니다. 이 같은 Hsp110 가족들과 같은 다른 보호자는 포유류 16 알려진 Hsp104 활동의 일부를 수행 할 것을 제안하고있다. Hsp104는 AAA +, hexameric 단백질 복합체입니다 리모델링 단백질 집계에 효모의 기능, 재 접힘 및 수리 13에 기여. Hsp70의 효모, Ssa1, 그리고 효모 Hsp40, Ydj1와 함께 Hsp104는, 효모 세포 5, 8 변성 FFL을 복구해야합니다. 작은 열 충격 단백질, Hsp26은 또한 requi 것으로 표시되었습니다FFL 2 Hsp104 매개 세분화 빨간색. FFL은 기판의 활성 부위에있는 루시페린과 ATP, 산소, decarboxylates을 필요로하는 구조적 변화에 따라 바인딩 두 개의 도메인 단백질 oxyluciferin, 이산화탄소 (CO 2), 아데노신 일 인산염 (AMP), 가벼운 11를 풀어 기판 9, 3. 상업적으로 이용 가능한 FFL 기판, D-루시페린, luminometer 15를 사용하여 검색 할 수 있습니다 550-570 nm의 사이에 발광 결과. FFL은 전개시 화학 물질 또는 열처리 빠르게 집계에서 변성을 정교하게 구분합니다. 39-45 사이의 온도에 노출되었을 때 ° C FFL은 가역적으로 전개 및 비활성화 12입니다. 반면, GFP 및 그 유도체는 스트레스 14 전개 단백질이 뛰어납니다. 따라서이 두 단백질의 융합 기능 G를 타겟팅 할 수있는 실험적으로 불안정한 부분의 기능을 FFL 수 있습니다FP는 인구와 단일 세포 수준 모두에서 형광 현미경을 사용하여 시각화 할 수있는 예금을 세포 내. 자동화 된 현미경과 결합 반자동 멀티 플레이트 리더 효소 분석의 응용 프로그램 속도론 및 반응 접힘 수율의 전례없는 동시 평가를 할 수 있습니다. 또한, 모델 진핵 생물 인 Saccharomyces cerevisiae의의 손쉬운 분자 유전학 정확한 단백질 품질 관리 네트워크의 조작과 세포 스트레스 반응 및 proteostasis에 기여하는 새로운 플레이어를 식별하는 검색 기반의 접근 기회를 모두 할 수 있습니다. 본 연구에서는 FFL-GFP를 표현 야생형 (WT)와 HSP104 삭제 변종 단백질 변성 열 충격을받습니다. FFL-GFP의 재 접힘은 복구 시간 과정을 통해 표현 프로테옴의 수리를 위해 프록시 판독 등의 효소 분석 및 현미경 모두를 통해 모니터링됩니다. WT 세포에 비교하면, 우리는 일을 보여전자 Hsp104 삭제 균주는 변성 FFL 2의 재 활성화에 Hsp104의 역할을 확립 이전의 연구를 지원, FFL-GFP를 접힘시 ~ 60 % 덜 효율적이다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>Synergy MX 마이크로플레이트 리더</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX81-ZDC 컨포칼 도립 현미경</td><td>Olympus, 일본</td><td></td><td></td>도쿄</tr><tr><td>Lumitrac 200 흰색 96웰 플레이트</td><td>USA Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SlideBook 5.0 디지털 현미경 소프트웨어</td><td>Intelligent Imaging Innovations, Inc. 미국 콜로라도주 덴버</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>(LiAc) 리튬 아세테이</td>트 <td>시그마</td><td>L6883</td><td></td></tr><tr><td>PEG(폴리에틸렌 글리콜)</td><td>Fisher</td><td>BP233-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>BP120-1</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Malinckrodt</td><td>4948</td><td></td></tr><tr><td>SC</td><td>Sunrise</td><td>1300-030</td><td></td></tr><tr><td>SC-URA</td><td>Sunrise</td><td>1306-030</td><td></td></tr><tr><td>cycloheximide</td><td>Acros Organics</td><td>357420050</td><td></td></tr><tr><td>D-luciferin</td><td>Sigma</td><td>L9504</td><td></td></tr><tr><td>저용융 아가로스</td><td>NuSieve</td><td>50082</td><td></td></tr><tr><td>침지 오일</td><td>Cargille</td><td>16484</td><td></td></tr></tbody></table>

의 모니터링 단백질 접힘에 대한 결합 분석 실험<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

단백질 폴딩 / 생합성의 통합 프로세스로 정의 Proteostasis는 재 접힘 / 수리, 그리고 성능 저하, 해로운 결과 1을 방지하기 위해 유지해야하는 섬세한 세포의 균형이다. 이 균형을 방해 외부 또는 내부 요인 단백질 응집, 독성 및 세포 죽음으로 이어질 수 있습니다. 인간이는 헌팅턴의, 파킨슨, 알츠하이머 병 10 신경 퇴행성 질환과 관련된 증상에 대한 주요 기여 요소이다. 그것은 proteostasis의 유지 보수에 관련된 단백질이 쇠약 질병에 대한 치료법을 개발하기 위해 확인하는 것이 필수적이다. 이 문서에서는 녹색 형광 단백질 (FFL-GFP)을 융합 한 모델 단백질 반딧불 루시 페라 제를 사용하여 실시간에 가까운 해상도로 생체 내 단백질 폴딩의 모니터링을위한 기술을 설명합니다. FFL 부분은 스트레스 유발 m에 매우 민감로 FFL-GFP는 고유 모델 키메라 단백질효소 12 불 활성화 isfolding 및 집계. 루시 페라 제 활동은 효소 분석을 사용하여 모니터링하고, GFP 부분은 자동화 된 현미경을 사용하여 수용성 또는 집계 FFL을 시각화하는 방법을 제공합니다. 이러한 결합 방법은 재 접힘과 스트레스 후 효소의 기능을 재 활성화 모두를 분석하기 위해 두 개의 병렬 기술적으로 독립적 인 접근 방식을 통합합니다. 활동 복구는 직접 더 나은 이러한 단백질 보호자와 같은 단백질 품질 관리 요소가 이러한 기능을 수행하기 위해 협력하는 방법을 이해하기 위해 세분화하고 다시 가용화 반응 속도와 상관 될 수 있습니다. 또한, 유전자 삭제 또는 돌연변이는이 과정에 특정 단백질 또는 단백질 소단위의 기여를 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 이 문서에서 우리는이 방법의 유효성을 검사하는 단백질 재 접힘에 시스템 5 접힘 Hsp40/70/nucleotide 교환 계수 (NEF) 파트너로 알려진 단백질 disaggregase Hsp104 13 일의 기여를 검사합니다.

효모 disaggregase에 의존, Hsp104 효율적으로 열 변성 단백질을 재 접힘 수 있습니다. FFL-GFP의 활동은 발광 플래시 분석 그림 1을 사용하여, 25 분 열 충격 후 측정 하였다. 그림 2에서와 같이이 자동화 된 분석의 결과는 궁극적으로 WT 세포의&gt; 80 % 회복했다 90 분 이상 활동 단계적 증가를 발표했다. hsp104Δ 변형은 동일한 시간 프레임에 원래 활동의 19 %를 회복. 또한, 초기 불 활성화의 정도는 Hsp104는 동안 FFL-GFP를 변성과 빠르게 연결을 보호 역할을 미리 스트레스를 제공하거나 수 있다는 것을 제안 보호자 돌연변이 균주 (WT 26 % 활동과 hsp104Δ 11 %)에서 더 높았다 열 불 활성화 단계는 효소 활성의 손실을 줄일 수 있습니다. 인구 현미경 효소 활성 분석을 뒷받침. hsp104D 돌연변이 스트라 ...

이 문서에서는 조사 반딧불 루시 페라 제 - GFP 융합 단백질의 사용을 설명합니다<em&gt; 생체 내</em&gt;의 단백질 폴딩<em&gt; 사카 cerevisiae의</em&gt;. 모델 열 변성 된 단백질의 접힘이 시약을 사용하면 형광 현미경 및 단백질 품질 관리 proteostasis 네트워크 구성 요소의 역할을 조사하는 효소 분석에 의해 동시에 모니터링 할 수 있습니다.

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 형광 현미경 및 효소 분석법을 통해 생체 내(in vivo)에서 단백질의 재용해 및 재접힘을 실시간에 가깝게 모니터링하는 것입니다. 이를 위해 먼저 반딧불이 루시퍼레이스가 녹색 형광 단백질과 융합된 플라스미드(F-F-L-G-F-P)를 세포에 형질전환시킵니다. 두 번째 단계로 F-F-L-G-F-P 단백질의 발현을 유도한 후, 사이클로헥시미드(cycloheximide) 처리를 통해 단백질 생산을 중단시킵니다.다음으로, 열 변성 전과 열 변성 후 일정 기간 동안 루시퍼레이스 활성을 측정합니다. 마지막 단계는 세포를 시각화하여 F-F-L-G-F-P 단백질의 용해도를 결정하는 것입니다. 최종적으로 형광 현미경 관찰과 효소 분석을 통해 여러 균주에서 모델 변성 효소의 재활성화 효율을 정량화합니다.종점 분석(endpoint analysis)과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 시간 경과에 따른 단백질의 활성과 응집 상태를 상관관계 지어 분석할 수 있다는 점입니다. 이 두 현상 사이의 관계를 규명함으로써, 이 방법은 특정 샤페론과 COS 샤페론이 모델 단백질의 응집 해제 및 재폴딩(refolding)에 어떻게 기여하는지, 그리고 세포 내의 이 두 활성이 서로 어떻게 의존하는지와 같은 단백질 항상성 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 얻는 데 도움을 줄 수 있습니다. 반딧불이 루시페라아제-녹색 형광 단백질 융합 단백질인 F-F-L-G-F-P는 MET 25 메티오닌 억제성 프로모터의 제어 하에 이 플라스미드로부터 발현됩니다.수정된 아세트산 리튬 매개 프로토콜을 사용하여, 플라스미드를 두 가지 croce visier 균주, 즉 야생형 균주와 응집된 미스폴딩 단백질의 복구에 중요한 역할을 하는 효모 분해효소인 HSP 1 0 4가 결실된 균주에 형질전환합니다. 이 실험의 성공은 적시에 수행하는 것에 달려 있으므로, F-F-L-G-F-P 유도 전에 배지가 담긴 배양 튜브, 마이크로 원심분리기 튜브 및 luciferian을 준비해야 합니다. 필요한 Lucifer의 양은 샘플 수와 원하는 반복 횟수를 기준으로 하며, 튜브 사용분을 위해 약 1, 200 µL를 추가로 준비합니다.항온수조를 42 °C 프로그램으로 예열합니다. 플래시 발광 분석용 플레이트 리더기의 온도를 30 °C로 설정합니다. 플레이트 리더기가 루시페린(Luciferian)을 첨가하고 각 웰을 개별적으로 읽도록 설정하며, 발광

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

여기 Saccharomyces cerevisiae의에서 단백질 단지를 식별하기위한 새로운 양적 proteomics 기술을 설명합니다. 본 연구에서는, 우리는 높은 특이성과 ER 단백질 Scs2p의 바인딩 파트너를 식별하는 탠덤 질량 분석계 다음 친화 정화와 함께 SILAC 방법을 사용했습니다.

S. cerevisiae의의 양적 proteomics와 단백질 단지의 식별

이 프로토콜의 열충격 후 세포내 단백질 refolding을 측정하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 자신의 활동에 영향을 미칠 수있는 분자 보호자 및 공동 요소 또는 혼합물과 같은 foldases을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 반딧불 루시페라제 활동은 보호자 역할 refolding 활동을 측정하는 기자로 사용됩니다.

세포 Refolding 분석

이 비디오는 세제 분획법과 함께 시클로헥시미드 처리를 사용하여 잘못 접힌 단백질에 대한 분해 분석을 설명합니다. 이 방법은 잘못 접힌 단백질의 역학을 연구하고 단백질 회전율의 심층적인 메커니즘을 밝히는 데 도움이 됩니다.

Misfolding-prone Protein Degradation Assay: Cycloheximide 처리 및 세제 분획을 사용하여 잘못 접힌 단백질 분해를 모니터링하는 기술

단백질 항상성, 스트레스 및 노화 사이의 관계를 연구하기 위해 유전적으로 다루기 쉬운 후생동물인 Caenorhabditis elegans를 모델 시스템으로 사용하여 단백질 기능 장애, 세포 내 단백질 국소화 및 유기체, 세포 및 단백질 수준에서의 단백질 안정성을 추적하여 단백질 접힘의 변화를 모니터링했습니다.

사용 예쁜 꼬마 선충 다세포 생물의 단백질 항상성을 연구하는 모델 시스템으로

이 기사는 단백질 분해에 대한 유전적 요구 사항을 결정하기 위한 효모 성장 기반 분석에 대해 설명합니다. 또한 효모 단백질을 신속하게 추출하는 방법을 보여주며, 이는 분해 요구 사항을 생화학적으로 확인하기 위한 웨스턴 블로팅(western blotting)에 적합합니다. 이러한 기술은 다양한 단백질의 분해를 모니터링하도록 조정할 수 있습니다.

성장 기반의 결정 및 단백질 분해에 대한 유전 요구 사항의 생화학 적 확인에<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em

우리는 Saccharomyces cerevisiae에서 지시된 진화 캠페인을 위한 돌연변이 라이브러리를 구축하고 스크리닝하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다.

진화 방법에 감독<em&gt; 사카로 마이 세스 세레 비지에</em&gt; : 돌연변이 라이브러리 생성 및 검사

단백질 상호 작용은 세포의 기능의 핵심이다. 열량 및 분광 기술은 일반적으로 그 특성을하는 데 사용됩니다. 여기에서 우리는 Shwachman - 다이아몬드 증후군 (SBDS)에 돌연변이 단백질과 신장 인자 같은 1는 GTPase (EFL1) 사이의 상호 작용을 연구하는 도구로 형광 이방성을 설명합니다.

단백질 - 단백질 상호 작용을 연구하는 도구로 형광 이방성

본 문서는 S. 세레비시아 및 HEK293T 세포 모두에서 단백질 자가 조립을 정량화하는 FRET 기반 유동 세포 분석 프로토콜에 대해 설명합니다.

유세포분석으로 생체내 단백질 자가 조립 검출 및 특성화

여기에서는 효소 변형 분석을 위해 효모 표면 표시 기질을 사용하기 위한 프로토콜을 소개합니다. 이 플랫폼은 대표적인 효소 변형 분석법으로 기질 중 하나에 대한 티로신 인산가수분해효소 SHP-2의 탈인산화 활성 분석을 사용하여 시연되었습니다.

효모 표면에 표시된 단백질의 Enzymatic modification and flow cytometry assessment (효소 변형 및 유세포 분석 평가)

여기서는 80S 입자 형성 분석을 위한 정제되고 염분 세척된 진핵 리보솜 소단위체의 시험관 내 재결합에 관한 상세한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 사 카로마이시스 세레비시아의 야생형 균주와 리보솜 단백질 eL24가 결핍된 돌연변이 균주에서 분리된 리보솜 소단위를 분석함으로써 설명됩니다.

시험관 내 염에 씻겨진 리보솜 소단위를 이용한 80S 리보솜 입자 형성을 측정하는 재결합 분석

배우세요 Saccharomyces cerevisiae에서 형광 현미경과 효소 분석을 결합하여 단백질 재접힘과 재용해됨을 실시간으로 모니터링하는 방법을. 이 기법은 단백질 항상성 네트워크 구성 요소의 역할을 연구하는 데 활용됩니다.

의 모니터링 단백질 접힘에 대한 결합 분석 실험

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