Name: Caenorhabditis의 엘레 모델 시스템 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: 학습하세요 아밀로이드 베타 독성이 신경 기능과 생존에 미치는 영향을 Caenorhabditis elegans를 이용한 화학추성 분석과 약리학적 검증으로 평가하는 방법을. 이 연구는 신경퇴행성 질환의 기전 규명과 치료 전략 개발에 중요한 통찰을 제공합니다.

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<p class="jove_content"&gt; 우리는 원고의 중요한 읽기 박사 슈앙 리우 감사합니다. PCL12 구조는 선물 폼 박사 크리스토퍼 D. 연결했다. 이 작품은 두 개의 국립 과학 재단 보조금 (0842708 및 1026958)와 FS에 AHA 부여 (09GRNT2250529)에 의해 지원되었다.</p

1. 형질 전환 웜 건설 <ol><li> 변환. <ol><li> 사출 패드를 준비합니다. 유리 coverslip에 위에 물에 용해 뜨거운, 2 % 아가로 오스의 드롭 놓습니다. 신속하게 드롭 번째 coverslip을 배치하고 가볍게 누릅니다. 아가로 오스가 떨어져 슬라이드의 coverslips에게 응고, 그리고 80 진공 오븐에서 coverslip에 패드 ° CO / N. 구워 후 </li><li> 피펫을 잡아 당깁니다. 우리는 1/0.5 mm 필라멘트와 OD / ID 붕 규산염 모세 혈관을 당겨 셔터 P-97 풀러를 사용합니다. 피펫은 나중 단계에서 열려 깨진 닫힘 끝으로 위조된다. </li><li> 사출 믹스를 준비합니다. μL / 150 NG의 최종 농도에 관심 DNA (구조 20 NG / μL)와 빈 플라스미드 DNA를 포함하는 주입 혼합물을 확인합니다. 모든 오염 물질을 제거하는 사출 혼합물을 원심 분리기. 오염 물질 변환 효율을 줄일 수 있기 때문에이 단계는 중요합니다. B에 신선한 튜브에 상위 5 μL를 (이물질 및 기타 오염 물질이 바닥에 수집) 전송전자 주입에 사용됩니다. </li><li> 모세관 현상에 의해 주입 혼합을로드합니다. 피펫의 바닥은 사출 믹스에 몰두하고 있습니다. 일반적으로 0.5 μL 100 벌레를 주입하기에 충분합니다. </li><li> 주입 피펫을로드합니다. micromanipulator에의 홀더에 피펫을 삽입하고 아가로 오스 패드에 파편에 유리 슬라이드 또는 양자 택일로 장착 된 커버 슬립의 가장자리에 그 끝을 문질러서이 열려 휴식. 이 너무 큰 팁을 손상 웜으로 중요한 단계입니다 너무 작은 팁은 쉽게 막혀 있습니다. 깨진 팁의 질은 유량에 의해 가장 중요한 형상에 의해 판단 할 수 있습니다. 유량은 분사 압력의 질문에 답변 할로 카본 700 기름 한 방울에 몰두 열린 끝에서 흐르는 거품의 크기에 의해 평가 될 수있다. </li><li> 사출 패드에 웜을 전송합니다. 주입 패드 700 할로 카본 오일 한 방울을 배치하고 기름 (초보자를위한 1 또는 2) 여러 벌레를 전송할 수 있습니다. 때까지 패드에 벌레를 밀어 선택 웜을 사용y는 아가을 준수합니다. 웜은 같은 방향으로 향하게하는 복부 측면과 행 지향적이어야한다. 웜의 머리를 만지지 마십시오. 벌레가 패드에 준수하지 않는 여러 시도 후 경우, 신선한 패드로 교체하거나 아가로 오스의 두께 및 / 또는 농도를 증가시킨다. </li><li> 웜에 피펫을 삽입합니다. 스테이지를 이동하여, 피펫에서 벌레를 배치합니다. 의 세포질 많은 생식 세포 핵에 의해 공유되기 때문에 생식선의 중앙 코어 피펫을 놓습니다. 이것은 많은 자손을 주입 DNA를 제공 할 가능성이 높아집니다. 피펫 웜 (~ 15 ° -25 ° 각도)에 거의 평행하게 놓여 있어야합니다. 피부가 침체 될 때까지 수직으로 웜의 몸 아래로 피펫의 팁을 누르십시오. 그런 다음 부드럽게 끝의 삽입을 유도하는 조작에 누릅니다. 최상의 결과를 모두 생식선을 주입. </li><li> DNA 용액을 주입. 생식선 부풀 때까지 피펫에 압력을 적용합니다. 흐름을 중지하고 피펫 떨어져 벌레를 잡아 당깁니다. 이동 한 후 흐름 바늘을 테스트하고다음 웜과 반복 주입 단계. </li><li> 벌레를 복구 : 웜에 대한 복구 버퍼의 드롭 (~ 10 μL)을 추가하고 벌레가 수영을 시작할 때까지 배양한다. 솔루션은 대부분 M9 때까지 벌레가 수영을 다시 시작하고 여러 번 반복 될 때까지 M9의 동일한 볼륨을 추가 기다립니다. 개별 시드 플레이트에 벌레를 전송할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 통합. <ol><li> 신선한 플레이트로 40 건강하고 먹이, L4 벌레를 배치 </li><li> 40 분 동안 4,000 라드와 γ-선 조사. 신선한, OP50 시드 플레이트 (4 웜 / 플레이트)에 조사 웜 (P0)를 전송합니다. 웜 또는 300 J / 평방 미터 UV를의 선량을 조사 할 수 있습니다. </li><li> 개인 접시에 각 플레이트 10-20 F1 형질 전환을 전송, 해당 P0 원점 번호판을 레이블을 지정합니다. </li><li> 별도의 플레이트에 각 F1 2-4 F2 형질 중 하나. 변환 마커의 100 % 전송을위한 F3 자손을 확인합니다. 일반적으로, 조사 웜 줘야에서 자손의 1-3%난 통합 이벤트가 있습니다. </li><li> 세 개 이상의 독립적 인 형질 전환 라인의 주식을합니다. </li></ol></li></ol> 2. 행동 분석 실험 <ol><li> 나이 동기화. <ol><li> 표준 10cm NGM 플레이트 + OP50 E.에있는 벌레를 성장 임신하는 성인의 많은 인구까지 대장균 (3-5 일)에 도달합니다. </li><li> 1 ML M9 버퍼에서 그들을 정지 50 ML 팔콘 튜브에 벌레를 수집합니다. </li><li> 3 분 450 XG에서 5 ML M9 버퍼와 원심 분리기를 추가합니다. 상층 액을 버린다. 3 배 반복합니다. </li><li> 마지막으로 원심 분리의 끝에서, 상층 액을 제거하고 침전 웜 기본 차아 염소산 용액 (0.5 M NaOH를 갓 혼합 1 % 차아 염소산)의 10 볼륨을 추가합니다. ~ 10 분 동안 RT에서 품어. 용해 반응은 coverslip에의 용해 반응의 저하를 배치하고 현미경으로 벌레를 검사하여 모니터링 할 수 있습니다. 벌레의 약 80 %가 파손되면 반응을 중지해야합니다. </li><li> 추가 기능에 의해 용해 반응을 정지살균 계란 버퍼의 G는 같은 볼륨. </li><li> 5 분 450 XG에서 원심 분리하여 계란 (그리고 시체)를 수집합니다. </li><li> 살균 계란 버퍼 2 배와 계란을 씻으십시오. </li><li> M9 버퍼와 씨앗들을 표준 NGM 플레이트에있는 계란 O / N를 품어. </li></ol></li><li> 화성 분석. <ol><li> 한천 약 0.5x0.5x0.5 cm의 여러 조각을 준비합니다. 우리는 10 cm 플레이트 한천을 입금하고 우리는 거기에서 한천 덩어리를 잘라. </li><li> 2 시간에 원하는 유인을 (포화에 가까운 포화 농도)를 포함하는 용액에 한천 덩어리를 적시십시오. 일반적인 유인 라이신 (0.5 M), 비오틴 (0.2 M)입니다. </li><li> 시험 장소의 위치와 제어 지점 (그림 1A)로 표시되어있는 10 센티미터 테스트 플레이트 한천 덩어리를 입금. 평형 및 그라데이션 O / N (그림 1B)의 형성을 허용합니다. 한 실험 5 접시를 준비합니다. </li><li> 이전 실험은 20 mM의 NaN의 3 (네스트의 10 μl를 추가각 장소에) hetic. </li><li> 접시의 중앙에 20 나이 동기화 벌레를 놓습니다. 20 ℃에서 인큐베이터에있는 접시를 놓습니다 </li><li> 1 시간 후, 테스트 / 제어 장소에서 동물을 계산하고 다음과 같이 화성 지수 (CI)를 계산 : <img alt="식 1" fo:content-width=".863in" fo:src="/files/ftp_upload/50435/50435eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50435/50435eq1.jpg" /> N, N 테스트 및 N Cnt 필드는., 동물의 총 수, 시험 현장에서 동물의 수와 제어 지점에있는 동물의 수를 표시 함. </li></ol></li></ol> 3. 기본 배아 세포 배양 <ol><li> 나이 동기화에 설명 된대로 벌레를 용해. </li><li> 5 분 450 XG에서 살균 계란 버퍼와 원심 분리기의 동일한 볼륨을 추가하여 용해 반응을 중지합니다. 부드럽게 펠렛 계란을 잃게하지 않도록주의하면서 상층 액을 버린다. 2 배 반복하거나 뜨는 선명해질 때까지. </li><li> 펠렛 달걀 (그리고 시체를 Resuspend) 2 ㎖ 멸균 계란 버퍼와 계란 버퍼에 멸균 60 %의 자당 2 ML를 추가합니다. 계란이 완전히 손으로 또는 텍싱하여 (그들은 원심 분리에 따라 덩어리를 형성하는 경향) 현탁 될 때까지이 솔루션을 섞는다. </li><li> 15 분 450 XG에 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 멸균 튜브에 뜨는를 (계란 포함) 전송합니다. 시체와 용해의 제품으로 다른 포함 된 펠렛을 폐기하십시오. </li><li> 계란 버퍼에 계란을 현탁 5 분 XG 450 원심 분리하여 잔류 자당을 제거합니다. 부드럽게 수집하고 상층 액을 버린다. 배 반복합니다. </li><li> 층류 후드 아래에 달걀 껍질을 소화하기 위해 RT에서 1 U / ㎖ 키티 나제를 포함하는 살균 계란 버퍼에 펠렛 계란을 resuspend을. 30 분 반응 (거꾸로 세포 배양 현미경)를 모니터링하기 시작하면. 키티 나제의 각 배치는 약간 다른 활동이있다. 일반적으로 소화는 1 시간에 완료됩니다. </li><li> 약 70-80%의 달걀 껍질은 키티 나제 CM-15 추가 (L-15 세포 배양 의대에 의해 소화 될 때IUM은 10 % 태아 소 혈청, 50 U / ML 페니실린, 50 ㎍ / ㎖ 스트렙토 마이신)를 포함. 27 게이지 주사기를 사용하여 세포를 떼어 놓다. 그대로 배아를 제거하는 필터 5.0 μm의, 세포와 유생의 대단히 짧은 시간에 세포 현탁액을 필터링합니다. </li><li> 펠릿은 450 원심 분리하여 해리 된 세포 현탁액은 15 분 동안 XG. 상층 액을 제거하고 CM-15 세포 배양 배지에서 펠렛을 resuspend을. </li><li> . 유리 커버 플레이트에 해리 세포는 이전에 물 주에 용해 땅콩 렉틴 (0.1 밀리그램 / ML)로 코팅 미끄러 져 : 세포가 분화하기 위해 기판을 준수해야합니다. </li><li> 세포는 2 주 이상 공기 RT (16-20 ° C)로 유지 될 수 있습니다. </li></ol>

<ol><li>Hardy, J., Allsop, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+deposition+as+the+central+event+in+the+aetiology+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer's disease.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 12 (10), 383-388 (1991).</li>
<li>Kotzbauer, P. T., Trojanowsk, J. Q., Lee, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lewy+body+pathology+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Lewy body pathology in Alzheimer's disease.</a> Journal of Molecular Neuroscience. 17 (2), 225-232 (2001).</li>
<li>Greenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inclusion+body+myositis%3A+review+of+recent+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Neurology+and+Neuroscience+Reports%22%5BJournal%5D)">Inclusion body myositis: review of recent literature.</a> Current Neurology and Neuroscience Reports. 9 (1), 83-89 (2009).</li>
<li>Revesz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporadic+and+familial+cerebral+amyloid+angiopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathology%22%5BJournal%5D)">Sporadic and familial cerebral amyloid angiopathies.</a> Brain Pathology. 12 (3), 343-357 (2002).</li>
<li>Hartmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+sites+of+intracellular+production+for+Alzheimer%27s+disease+A+beta40%2F42+amyloid+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Distinct sites of intracellular production for Alzheimer's disease A beta40/42 amyloid peptides.</a> Nature Medicine. 3 (9), 1016-1020 (1997).</li>
<li>Ohnishi, S., Takano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+fibrils+from+the+viewpoint+of+protein+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+sciences%3A+CMLS%22%5BJournal%5D)">Amyloid fibrils from the viewpoint of protein folding.</a> Cellular and Molecular Life sciences: CMLS. 61 (5), 511-524 (2004).</li>
<li>C. elegans II. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Cold+Spring+Harbor+Monograph%22">Cold Spring Harbor Monograph</a>. DL, R. iddle, et al. 1, M. 33, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. 1222(1997).</li>
<li>Cotella, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxic+role+of+k%2B+channel+oxidation+in+Mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Toxic role of k+ channel oxidation in Mammalian brain.</a> The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (12), 4133-4144 (2012).</li>
<li>Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+human+beta-amyloid+peptide+in+transgenic+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Expression of human beta-amyloid peptide in transgenic Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9368-9372 (1995).</li>
<li>Cai, S. Q., Sesti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidation+of+a+potassium+channel+causes+progressive+sensory+function+loss+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Oxidation of a potassium channel causes progressive sensory function loss during aging.</a> Nature Neuroscience. 12 (5), 611-617 (2009).</li>
<li>Yu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guanylyl+cyclase+expression+in+specific+sensory+neurons%3A+a+new+family+of+chemosensory+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Guanylyl cyclase expression in specific sensory neurons: a new family of chemosensory receptors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 3384-3387 (1997).</li>
<li>Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemosensory+neurons+with+overlapping+functions+direct+chemotaxis+to+multiple+chemicals+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans.</a> Neuron. 7 (5), 729-742 (1991).</li>
<li>Caserta, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Q-VD-OPh%2C+a+broad+spectrum+caspase+inhibitor+with+potent+antiapoptotic+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis+%3A+an+international+journal+on+programmed+cell+death%22%5BJournal%5D)">Q-VD-OPh, a broad spectrum caspase inhibitor with potent antiapoptotic properties.</a> Apoptosis : an international journal on programmed cell death. 8 (4), 345-352 (2003).</li>
<li>Christensen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primary+culture+system+for+functional+analysis+of+C.+elegans+neurons+and+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells.</a> Neuron. 33 (4), 503-514 (2002).</li>
</ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

여기에서 우리는 C를 사용하여 amylopathies의 세포 및 분자 측면을 연구하기 위해, 결합 방법을 설명 엘레 간스. 이 방법의 장점은 다음과 같습니다. 1) 저렴한 비용으로 C.elegans는 상온에서, 박테리아 파종 일반 페트리 접시에 유지됩니다. 2) 강력한 유전학. 형질 전환 동물은 몇 개월 만에 얻은 프로모터 서열의 다양한 특정 뉴런에서 원하는 유전자의 발현을 유도 할 수있다 할 수 있습니다. 3) 단순, 잘 특성화, 신경계. C. 엘레은 매우 간단 신경계 (302 뉴런)를 보유하고있다. 이 단순 세포 혈통, 각 신경 세포의 특정 기능 / 역할과 시냅스 연결을 포함하여 벌레의 신경계의 광범위한 특성을 여유했다. C.의 한계 엘레은 면역 표준 생화학 기술의 응용 프로그램과 노를 격리한다 두꺼운 피부 (표피)을 방해하는 세포의 작은 크기를 포함RONS은 외부 환경을 형성한다. 따라서 약물 접근법 C로 제한...

아밀로이드 베타 (Aβ) β 및 γ의 secretases 1에 의한 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)의 연속 절단 한 후 형성되는 36-43 아미노산 펩티드이다. γ의 secretase에는 Aβ 펩타이드의 C-말단을 처리하고 그 변수 길이 5에 대한 책임이 있습니다. Aβ의 가장 일반적인 형태는 Aβ 40 Aβ 42, 더 일반적으로 같은 AD 5와 같은 병적 상태에 관련되는 후자입니다. 높은 농도의 Aβ 양식 β-시트에있는 아밀로이드 원 섬유는 6을 형성 집계. 섬유 보증금 신경을 둘러싸고있는 치매 plaques의 주요 구성 요소입니다. 플라크와 확산 성, 비 플라크 Aβ 올리고머, 모두 Aβ의 기본 병원성 양식을 구성하는 것으로 생각되고 있습니다. 신경 amylopathies의 실험실 연구는 시간이이 조건이 진행 사실에 의해 복잡합니다. 따라서 importan입니다마우스 - 짧은 수명에 모델을 보완하는 유전자 다루기 쉬운 동물을 개발하는 t. 이러한 모델은 amylopathies - 일반적으로 세포 및 분자 및 그 단순 덕택으로, 문제의 본질을 포착하는 데 도움의 특정 측면을 명료하게 할 수 있습니다. 웜 Caenorhabditis의 엘레 가을이 범주입니다. 그것은 짧은 수명을 가지고 ~ 20의 일 유전자 발현, 단백질 밀매, 신경 연결, 시냅스, 세포 신호, 죽음의 규제 등뿐만 아니라 기본적인 세포 과정에서 포유류 7과 비슷합니다. 웜의 독특한 특징은 강력한 유전 독립적으로 혈관 손상 신경 손상을 연구 할 수있는 혈관 시스템의 부족이 (가) 있습니다. 반면에, 뇌의 부족 C.의 사용을 제한 신경 변성의 여러 측면을 연구하는 엘레 간스. 또한, 병변의 해부학 적 분포의 재생 및 식별이 유기체에서 수행 할 수 없습니다. 다른 제한관리 포인트는 유전자 발현 프로파일과 복잡한 행동과 메모리 기능의 장애 모두에서 차이를 평가하는 어려움이 있습니다. 여기에서 우리는 C를 생성하는 방법을 설명 amylopathies의 elegans의 모델.

<table><tbody><tr><td colspan="4">1입니다. NGM</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td>3 g</td></tr><tr><td>Bacteriological Agar</td><td>AMRESCO</td><td>J637</td><td>17 g</td></tr><tr><td>Bacto-peptone</td><td>AMRESCO</td><td>J636</td><td>2.5 g</td></tr><tr><td>Distilled Water</td><td></td><td></td><td>975 ml</td></tr><tr>로 가져오세요<td colspan="4"> 고압멸균으로 살균한 다음 다음 항목을 추가하고 잘 섞습니다.</td></tr><tr><td>황산</td> <td>마그네슘Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td>1 ml 1 M 주식</td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td>1 ml 1 M</td></tr><tr><td>주식 콜레스테롤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3045</td><td>5 mg/ml 주식 1 ml(에탄올)</td></tr> <tr><td>인산칼륨 완충액</td><td></td><td></td><td>1M 주식 25 ml</td></tr><tr><td colspan="4">2. 인산칼륨 완충액</강></td></tr><tr><td>인산칼륨 일염기</td>성 <td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>108.3 g</td></tr><tr><td>인산칼륨 이염기성</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786</td><td>35.6 g</td></tr><tr><td>증류수</td><td></td><td></td><td>1 L</td></tr><tr><td colspan="4">고압멸균으로 살균</td></tr><tr>됨<td colspan="4">3. M9 완충액 < / 강></td></tr> <tr><td>인산 칼륨 일 염기성</td><td>시그마 -알드리치</td><td>P5655</td><td>3g</td></tr><tr><td>인산 나트륨 이염기</td><td>성 시그마 -알드리치</td><td>S5136</td><td>6g</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>시그마 알드리치</td><td>S5886</td><td>5g</td></tr><tr><td>황산 마그네슘</td> 시<td>그마-알드리치</td><td>M2643</td><td>1M 스톡 1ml</td></tr><tr><td>증류수</td><td></td><td></td><td>1L로 가져 오기</td></tr><tr><td colspan="4">고압멸</td></tr>균<tr>으로 살균됨<td colspan="4">4. 난자 완충액(pH 7.3, 340mOsm)</강></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td>118mM</td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td>48mM</td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td>2mM</td></tr><tr><td>염화마그네슘</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4880</td><td>2mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310</td><td>25mM</td></tr><tr><td>증류수를</td><td></td><td></td><td>1 L</td></tr><tr>로 가져옵니다<td colspan="4">오토클레이브로 살균됨</td></tr><tr><td colspan="4">5. CM-15</td></tr><tr><td>L-15 배양 배지</td><td>Gibco</td><td>11415</td><td>450 ml</td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>페니실린</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>50 units/ml</td></tr><tr><td>스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>50 g/ml</td></tr><tr><td colspan="4">자당으로 340 mOsm으로 조정한 다음 멸균 필터를 오토클레이브 병에 넣고 4°C에서 보관합니다. C</td></tr><tr><td colspan="4">6입니다. 기타 시약</td></tr><tr><td>Halocarbon 700 oil</td><td>Halocarbon Products</td><td>9002-83-9</td><td></td></tr><tr><td>5 &mu; m Acrodisc 주사기 필터</td><td>PALL Co.</td><td>4199</td><td></td></tr><tr><td>키티나제</td><td>시그마-알드리치</td><td>C6137-5UN</td><td></td></tr><tr><td>렉틴(땅콩)</td><td>시그마-알드리치</td><td>L0881-10MG</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>S320</td><td></td></tr><tr><td>라이신</td><td>시그마-알드리치</td><td>L5501</td><td></td></tr><tr><td>비오틴</td><td>시그마-알드리치</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>차아염소산나트륨 용액</td><td>시그마-알드리치</td><td>425044</td><td></td></tr><tr><td>아지드화나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>71289</td><td></td></tr><tr><td>자당</td> 시<td>그마-알드리치</td><td>S0389</td><td></td></tr></tbody></table>

<em&gt; caenorhabditis의 엘레</emamylopathy 연구에 대한&gt; 모델 시스템

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopathy 시간과 조직에서 아밀로이드 베타의 비정상적인 합성과 축적을 (Aβ)에 대해 설명하는 용어입니다. Aβ는 알츠하이머 병 (AD)의 특징과 Lewy 바디 치매, 봉입체 근염의 대뇌 아밀로이드 angiopathy 1-4에서 찾을 수 있습니다. Amylopathies 점차적으로 시간 개발할 수 있습니다. 이러한 이유로 짧은 수명과 간단한 유기체는이 조건의 분자 측면을 명료하게하는 데 도움이 될 수 있습니다. 여기, 우리는 웜 Caenorhabditis의 elegans의를 사용하여 Aβ 매개 신경 변성을 연구하는 실험 프로토콜을 설명합니다. 따라서, 우리는 어른 자웅 동체의 세포 융합 생식선에 DNA 인코딩 인간의 Aβ에게 42 주입하여 유전자 변형 벌레를 구축합니다. 형질 전환 라인은 돌연변이에 의한 통합에 의해 안정화된다. 선충이 알을 수집 및 시드에 의해 동기화 시대입니다. Aβ 42을 표현 뉴런의 기능은 (좋은 기회 행동 분석에서 테스트 화성 분석들). 배아에서 얻은 기본의 연결을 문화는 행동 데이터를 보완하고 항 세포 사멸 화합물의 신경 효과를 테스트하는 데 사용됩니다.

우리의 프로토콜로 우리는 신경 기능 8 인간의 Aβ 42 올리고머의 효과를 연구한다. 조각 인코딩 인간의 Aβ 42 화재 벡터 pPD50.52의 인공 신호 펩타이드 코딩 순서는 끝 스몰 1 제한 효소 사이트를 소개 프라이머를 사용하여 구조 PCL12 9에서 증폭되었다. 조각은 그 독특한 스몰 1 사이트 10 ~ pPD95.75 화재 벡터의 2,481-BP FLP-6 프로모터 서열을 포함하는 구조에 삽입되었다. 프로토콜 1에 설명 된 변환 기술을 사용하여 우리는 ASE 뉴런 (FDX (ses25) 변형) 8 Aβ 42을 표현하는 유전자 변형 벌레를 구축. 긍정적 인 형질을 표시하기 위해 우리는 특히 ASE 오른쪽 (ASER) 신경 세포의 11 GFP 발현을 구동 P GCY-5 :: GFP 기자를 사용했습니다. 건조한 아가가...

우리는 벌레에 amylopathies의 양상을 연구하는 방법을 설명<em&gt; C. 엘레</em&gt;. 우리는 인간의 Aβ 표현 벌레를 구성하는 방법을 보여줍니다<sub&gt; 42</sub&gt; 뉴런에서 어떻게 행동 분석에서의 기능을 테스트합니다. 우리는 더 이상 약물 테스트에 사용할 수있는 기본의 연결을 문화를 획득하는 방법을 보여줍니다.

<em&gt; Caenorhabditis의 엘레</emAmylopathy 연구에 대한&gt; 모델 시스템

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

본 절차의 전반적인 목표는 아밀로이드 베타 독성이 신경세포의 기능과 생존에 미치는 영향을 평가하는 것입니다. 이를 위해 먼저 SE 감각 신경세포에서 GFP 리포터와 함께 아밀로이드 베타 펩타이드를 발현하는 형질전환 C elegance 벌레를 제작합니다. 그 다음, 화학주성 분석을 통해 SE 신경세포에서 아밀로이드 베타를 발현했을 때 나타나는 행동적 결과를 평가합니다.세 번째 단계는 SE 뉴런의 일차 배양물을 얻은 다음, Q-V-D-O-P-H와 같은 약리학적 제제로 배양된 뉴런을 처리하여 아밀로이드 베타의 독성 효과를 억제하는 것입니다. 최종적으로, 행동 및 약리학적 분석을 통해 아밀로이드 베타 독성이 SE 뉴런의 기능과 생존에 미치는 영향을 확인할 수 있습니다. 이 방법은 특정 세포 및 분자 메커니즘을 규명하는 것과 같이 신경퇴행에 관한 핵심적인 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.아밀로이드 베타 올리고머의 잠재적인 신경독성 효과. 실험 절차 시연은 본 연구실의 박사후 연구원인 Dr.Zing Dwan이 진행합니다. 변형을 위해 2% agarose injection pad가 필요합니다. 물에 녹인 뜨거운 agarose 한 방울을 유리 커버슬립 위에 떨어뜨리고, 그 위에 빠르게 두 번째 커버슬립을 덮은 뒤 가볍게 두드립니다.주입 혼합물을 만들 때, 반드시 원심분리 후 부유물과 기타 오염 물질이 없는 상층 5 µL를 새로운 튜브로 옮겨 주입 하중으로 사용하십시오. 주입 혼합물과 공벡터(empty plasmid)를 모세관 현상을 이용해 주입 피펫으로 흡입합니다. 보통 0.5 µL면 100마리의 벌레에게 주입하기에 충분합니다. 주입 피펫의 개구부를 넓히려면 Halo carbon 700 oil이 도포된 유리 슬라이드 위의 커버슬립 가장자리에 팁 끝을 문지르십시오. 개구부의 품질이 매우 중요합니다.이는 팁의 모양으로 판단하며, 가장 중요한 것은 주입 압력에 반응하여 피펫 팁에서 형성되는 기포의 크기와 흐름으로 평가하는 유량입니다. 이제 주입 패드 위에 700 hallow carbon oil 한 방울을 떨어뜨리고 여러 마리의 벌레를 패드로 옮깁니다. 벌레 픽을 사용하여 벌레들이 아가로스에 부착될 때까지 패드 쪽으로 밀어 넣습니다.벌레들은 복측이 정렬되도록 행을 맞추어 배치해야 합니다. 머리 부분을 건드리지 않도록 주의하십시오. 여러 번 시도한 후에도 벌레가 패드에 부착되지 않는 경우, 새 패드를 사용하거나 패드의 아가로스 두께 또는 농도를 높이십시오.이제 피펫을 벌레에 삽입하십시오. 먼저, 스테이지를 이동시켜 벌레가 피펫 아래에 오도록 위치시킵니다. 그 다음, 피펫을 생식샘의 중앙핵 옆에 위치시킵니다.세포질이 많은 생식 세포 핵에 의해 공유되기 때문에, 이는 주입된 DNA가 후대로 전달될 가능성을 높여줍니다. 피펫은 벌레와 거의 평행하게 놓여야 합니다. 셋째, 피부가 눌릴 때까지 팁을 몸체 쪽으로 수직으로 이동시킵니다.마지막으로, 매니퓰레이터를 가볍게 두드려 팁을 삽입합니다. 이제 DNA 용액을 주입합니다. 생식낭이 부풀어 오를 때까지 피펫에 압력을 가합니다.그런 다음 흐름을 멈추고 피펫에서 벌레를 떼어냅니다. 바늘의 흐름을 테스트한 후, 다음 벌레로 넘어가기 전에 다른 생식샘에 주입합니다. 주입 후, 벌레에 회복 완충액 약 10 µL를 첨가하고 벌레들이 헤엄치기 시작할 때까지 기다립니다.웜이 헤엄치기 시작하면, 동일한 부피의 M nine 완충액을 추가합니다. 웜이 다시 헤엄치기 시작하면, 용액의 대부분이 M nine이 될 때까지 계속 추가합니다. 이제 각 웜을 시팅 플레이트로 옮깁니다.50 mL falcon 튜브에 1 mL의 M9 버퍼를 넣고 GR 웜을 수집합니다. 그다음 M9 버퍼를 사용하여, 세척 후 M9 용액이 투명해질 때까지 원심분리와 용액 교체를 반복하여 웜을 세척합니다. 이어서, 웜에 10배 부피의 염기성 차아염소산염 용액을 첨가합니다.펠렛화된 벌레들을 실온에서 약 5분의 4가 분해될 때까지 배양하며, 이는 보통 10분 정도 소요됩니다. 소량을 덜어 현미경으로 관찰하여 반응 상태를 확인하십시오. 동일한 부피의 멸균 egg buffer를 첨가하여 반응을 중단시킵니다.그 후 450 G에서 5분 동안 원심분리하여 알과 사체를 수집합니다. 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 동일한 부피의 egg buffer를 다시 넣고 450 G에서 5분 동안 튜브를 다시 원심분리합니다.완충액이 투명해질 때까지 이 과정을 반복합니다. 이제 알들을 M9 완충액에 넣고 하룻밤 동안 배양한 후, 다음 날 표준 NGM 플레이트에 접종합니다. 한 변의 길이가 약 0.5 cm인 한천 큐브를 여러 개 준비합니다.원하는 유인제가 포함된 용액에 한천 덩어리를 2시간 동안 담가둡니다. 테스트 지점과 대조군 지점이 표시된 10cm 테스트 플레이트에 한천 덩어리를 배치합니다. 실험당 이러한 플레이트를 5개 준비합니다.플레이트를 20 °C에서 하룻밤 동안 보관하여 화학적 구배가 형성되도록 합니다. 실험 전에 플레이트의 각 지점에 20 mM sodium azide 10 µL를 첨가합니다. 이는 마취제 역할을 합니다.연령이 일치하는 벌레 20마리를 플레이트 중앙에 배치하여 실험을 시작하고, 플레이트를 20 °C 인큐베이터에 1시간 동안 둡니다. 1시간 후, 대조군 지점 대비 테스트 지점에 있는 개체 수를 세고 CI 지수를 계산합니다. 앞서 설명한 대로 gr 벌레를 용해하고 알과 사체를 세척한 후, 이를 2 mL의 멸균 알 버퍼에 다시 현탁하고 멸균된 60% sucrose 알 버퍼 2 mL를 추가합니다.그런 다음 튜브를 손으로 섞거나 볼텍스(vortex)하여 알이 완전히 재현탁될 때까지 섞어줍니다. 재현탁된 알을 450 ×g에서 15분 동안 원심분리합니다. 그 후 알이 포함된 상층액을 조심스럽게 수집하고 잔류 수크로스를 제거하기 위해 펠렛(pellet)은 버립니다. 알을 알 버퍼(egg buffer)에 재현탁하고 450 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다.상층액을 조심스럽게 수집하여 제거한 다음, 후드 내에서 세척 과정을 3회 반복합니다. 1 unit/mL의 chitinase가 포함된 멸균 egg buffer를 사용하여 침전된 알을 재부유시킵니다. 실온에서 30분 동안 알을 소화시킨 후, 도립 세포 배양 현미경으로 반응을 관찰하기 시작합니다.난각의 70~80%가 소화되었을 때, 5 mL의 완전 L 15 배양액 또는 CM 15를 첨가합니다. 세포를 분리하기 위해, 27 gauge 바늘을 통해 세포를 몇 차례 통과시켜 세포가 뭉치지 않도록 해리합니다. 이제 이 용액을 5 µm 필터가 장착된 주사기로 통과시킵니다.분리된 세포 현탁액을 450 G에서 15분 동안 원심분리하여 펠릿을 형성합니다. 그 다음 상층액을 제거하고 펠릿이 된 세포를 CM 15에 재현탁합니다. 세포가 완전히 분리되었는지 확인하기 위해 현미경으로 현탁액을 관찰합니다.마지막으로, 분리된 세포를 이전에 코팅된 유리 커버슬립 위에 플레이팅합니다. 피넛 렉틴을 사용하면 세포를 상온의 일반 공기 상태에서 2주 이상 유지할 수 있습니다. 설명된 형질전환 기술을 사용하여, 화학주성 분석(chemotaxis assay)을 통해 biotin과 같은 수용성 유인 물질을 감지하는 a SE 뉴런에서 인간 a Beta 42를 발현하는 형질전환 웜을 제작하였습니다.7일 된 형질전환 벌레를 대상으로 테스트를 진행하였습니다. 대조군은 비오틴을 찾는 데 어려움이 없었습니다. 반면, beta 42를 발현하는 벌레는 소수만이 유인제 지점을 찾을 수 있었습니다.3~4일 차에 biotin의 화학주성 지수는 0.68이었으며, 대조군 및 실험군 웜의 지수는 각각 0.12였습니다. 또한 지수에서 작지만 감지 가능한 수준의 감소가 있었습니다. 생후 9일 차에도 여전히 GFP를 발현하고 있는 4일 차의 배양된 A SER 뉴런입니다.하지만 GFP 형광이 사라졌으며, 이 가설을 검증하기 위해 세포 사멸(apoptosis)이 의심되었습니다. 기술된 대로 일차 A SER 뉴런을 준비하고 광범위 caspase 억제제를 첨가하였습니다. 예상대로, 이러한 처리는 형광 소실을 중단시켜 인간 A beta 42의 발현이 A SER 뉴런에서 세포 사멸을 유발한다는 것을 확인해주었습니다.이 영상을 시청한 후에는 정교한 형질전환 웜을 제작하는 방법, 행동 분석 실험을 통해 이를 연구하는 방법, 그리고 Ambrose로부터 1차 배양물을 얻는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

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에서 항 정신병 약물의 작용 메커니즘을 공부하는 방법<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

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