Caenorhabditis의 엘레 모델 시스템

이 절차의 전반적인 목표는 아밀로이드 베타 독성이 신경 기능 및 생존에 미치는 영향을 평가하는 것입니다. 이것은 먼저 SE 감각 뉴런에서 GFP 리포터와 함께 아밀로이드 베타 펩타이드를 발현하는 형질전환 C 엘레강스 웜을 구축함으로써 달성됩니다. 다음으로, SE 뉴런에서 아밀로이드 베타를 발현하는 행동적 결과는 화학주성 분석법(chemotaxis assay)에 의해 평가됩니다.

세 번째 단계는 SE 뉴런의 1차 배양을 얻은 다음 배양된 뉴런을 Q-V-D-O-P-H와 같은 약리제로 처리하여 아밀로이드 베타의 독성 효과를 억제하는 것입니다. 궁극적으로, 결과는 행동 및 약리학적 분석을 통해 아밀로이드 베타 독성이 SE 뉴런 기능과 생존에 미치는 영향을 보여줄 수 있습니다. 이 방법은 특정 세포 및 분자 메커니즘을 밝히는 것과 같은 신경 퇴행에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

아밀로이드 베타 올리고머의 근본적인 신경독성 효과. 절차를 시연하는 것은 제 연구실의 박사후 연구원인 Zing Dwan 박사가 될 것입니다.변형을 위해서는 2%agros 주사 패드가 필요합니다. 유리 커버 슬립에 물에 녹인 뜨거운 아로스 한 방울을 놓고 두 번째 커버 슬립을 방울에 빠르게 놓고 가볍게 두드립니다.

주입 혼합물을 만들 때, 파편 및 기타 오염 물질이 없는 상위 5마이크로리터를 중심을 잡고 새 튜브로 옮겨 주입 부하, 주입 혼합물 및 빈 플라스미드를 모세관 작용에 의해 주입 피펫으로 넣어야 합니다.반 마이크로리터는 일반적으로 주입 피펫의 개구부를 넓히기 위해 100개의 웜을 주입하기에 충분하며, 유리 슬라이드에 장착된 커버 슬립의 가장자리에 팁을 문지릅니다. 헤일로 카본 700 오일. 개구부의 품질은 매우 중요합니다.

이는 팁 모양에 의해 판단되며, 가장 중요한 것은 유량에 의해 판단되며, 유량에 의해 평가되며, 주입 압력에 따라 피펫 팁에서 형성되는 기포의 크기에 의해 평가됩니다. 이제 주입 패드에 700개의 핼로우 카본 오일 한 방울을 떨어뜨리고 여러 개의 웜을 패드로 옮깁니다. 웜 픽을 사용하여 웜이 아로스에 달라붙을 때까지 패드 위로 밀어 넣습니다.

벌레는 복부 측면이 정렬된 상태로 일렬로 향해야 합니다. 머리를 만지지 마십시오. 여러 번 시도한 후에도 벌레가 패드에 달라붙지 않으면 새 패드를 사용하거나 패드의 아그로스 두께 또는 농도를 높이십시오.

이제 피펫을 웜에 삽입합니다. 먼저 스테이지를 이동하여 웜을 피펫 아래에 두 번째로 배치합니다. 생식선의 중앙 코어 옆에 피펫을 놓습니다.

세포질은 많은 생식 세포 핵에 의해 공유되기 때문에 주입된 DNA가 자손에게 전달될 가능성을 높입니다. 피펫은 웜과 거의 평행하게 놓여야 합니다. 셋째, 피부가 눌릴 때까지 팁을 몸쪽으로 수직으로 움직입니다.

마지막으로 매니퓰레이터를 부드럽게 두드려 팁 삽입을 유도합니다. 이제 DNA 용액을 주입하십시오. 생식선이 부풀어 오를 때까지 피펫에 압력을 가하십시오.

그런 다음 흐름을 멈추고 피펫에서 벌레를 빼냅니다. 바늘의 흐름을 테스트한 다음 다음 웜으로 이동하기 전에 다른 생식선을 주입합니다. 주사 후 약 10마이크로리터의 회복 완충액을 벌레에 추가하고 벌레가 수영을 시작할 때까지 기다립니다.

수영이 끝나면 동일한 부피의 M nine 버퍼를 추가합니다. 지렁이가 수영을 재개하면 용액이 대부분 M 9가 될 때까지 M 9를 계속 추가합니다. 이제 각 웜을 장착된 플레이트로 옮깁니다.

50ml 팔콘 튜브에 1ml의 M nine 버퍼에 GR 웜을 수집합니다. 그런 다음 M nine 버퍼를 사용하여 세척 후 M nine이 투명해질 때까지 반복적인 원심분리와 용액 교체로 벌레를 세척합니다. 다음으로, 이가 있는 10부피의 염기성 차아염소산염 용액을 첨가합니다.

펠릿 모양의 벌레는 약 5분의 4가 부서질 때까지 실온에서 벌레를 배양하며 일반적으로 10분이 걸립니다. 분취액을 현미경으로 관찰하여 반응을 모니터링합니다. 동일한 부피의 멸균 난자 완충액을 추가하여 반응을 중지합니다.

그런 다음 450G에서 5분 동안 원심분리하여 난자와 사체를 수집합니다. 상층액을 부드럽게 제거합니다. 동일한 부피의 난자 완충액을 다시 추가하고 튜브를 450G에서 5분 동안 다시 원심분리합니다.

버퍼가 지워질 때까지 절차를 반복합니다. 이제 M nine buffer에서 밤새 난자를 부화시키고 다음 날 표준 NGM 플레이트에 씨를 뿌립니다. 한 변이 약 50cm 정도의 한천 큐브 여러 개를 준비합니다.

한천 덩어리를 원하는 유인제가 함유된 용액에 2시간 동안 담그십시오. 테스트 지점과 대조 지점의 위치가 표시된 10cm 테스트 플레이트에 한천 덩어리를 넣습니다. 실험당 5개의 플레이트를 준비합니다.

플레이트가 화학적 구배를 형성하도록 하려면 다음날 섭씨 20도에서 밤새 그대로 두십시오. 실험에 앞서, 플레이트의 각 지점에 10마이크로리터의 20밀리몰 아지드화나트륨을 첨가합니다. 이것은 마취제 역할을 합니다.

플레이트 중앙에 20마리의 나이가 동기화된 벌레를 배치한 다음 플레이트를 섭씨 20도의 인큐베이터에 한 시간 동안 배치하여 실험을 시작합니다. 한 시간 후 대조군에서 실험에 참여한 동물의 수를 세고 CI 지수를 계산합니다. gr 웜을 용해시키고 앞에서 설명한 대로 계란과 사체를 세척한 후 2ml의 멸균 난자 완충액에 다시 현탁시키고 계란 완충액에 2ml의 멸균 60% 자당을 추가합니다.

그런 다음 난자가 완전히 재현 될 때까지 손으로 또는 와류로 튜브를 혼합합니다. 재현탁된 난자를 450배 G로 15분 동안 원심분리한다. 그런 다음 난자로 채워진 상등액을 조심스럽게 채취하고 입천장을 버리고 잔류 자당을 제거하고 난자를 난자 완충액에 재현탁시킨 다음 450G에서 5분 동안 원심분리합니다.

상층액을 부드럽게 모아 버린 다음 후드에서 세척 과정을 세 번 반복합니다. 키티나아제 1밀리리터당 1단위를 함유한 멸균 난자 완충액을 사용하여 펠릿화된 난자를 재현탁합니다. 난자를 실온에서 30분 동안 소화시킨 다음 도립 세포 배양 현미경으로 반응을 모니터링하기 시작합니다.

달걀 껍질의 70-80%가 소화되면 5ml의 완전한 L 15 배양 배지 또는 CM 15를 첨가합니다. 세포를 분리하려면 27 게이지 바늘을 통해 세포를 몇 번 통과시켜 세포가 덩어리를 형성하지 않도록 세포를 해리합니다. 이제 5미크론 필터가 있는 주사기를 통해 용액을 통과시킵니다.

해리된 세포 현탁액을 450G에서 15분 동안 원심분리하여 펠렛화합니다. 그런 다음 상층액을 제거하고 펠릿화된 세포를 CM 15에 재현탁합니다. 세포가 해리되었는지 확인하려면 현미경으로 현탁액을 확인하십시오.

마지막으로, 해리된 세포를 이전에 코팅된 유리 커버 슬립에 도금합니다. 땅콩 렉틴을 사용하면 세포를 2주 이상 정상 공기와 함께 실온에서 유지할 수 있습니다. 설명된 형질전환 기술을 사용하여, 화학주성 분석을 사용하여 비오틴과 같은 수용성 유인 물질을 검출하는 뉴런인 SE 뉴런에서 인간 베타 42를 발현하도록 형질전환 웜을 구축했습니다.

생후 7일 된 형질전환 기생충을 테스트했습니다. 대조군은 비오틴을 찾는 데 문제가 없었습니다. 대조적으로, 베타 42를 발현하는 소수의 벌레만이 유인 지점을 찾을 수 있었다.

비오틴에 대한 화학주성 지수는 3-4일 시점에 각각 대조군과 실험용 기생충의 0.12에 비해 0.68이었다. 또한 지수에서 작지만 감지할 수 있는 하락이 있었습니다. 4일째에 배양된 SER 뉴런이 9일째 되어도 GFP를 발현합니다.

그러나 GFP 형광은 사라졌고 이 이론을 시험하기 위해 세포사멸이 의심되었습니다. 1차 A SER 뉴런은 기술된 대로 준비되고 광범위한 카스파제 억제제로 보충되었습니다. 예상대로 이 치료법은 형광 손실을 멈추어 인간 A 베타 42의 발현이 A SER 뉴런에서 세포사멸을 유발한다는 것을 확인했습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 우아한 형질전환 벌레를 구성하는 방법, 행동 에세이에서 연구하는 방법, Ambrose에서 기본 배양을 얻는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.