구조 및 기능 연구를위한 지질 막에 Kv 값 채널의 재구성

이 절차의 전반적인 목표는 막 단백질에 대한 지질의 영향에 대한 기능적 및 구조적 연구를 위한 기술에 대한 자세한 설명을 제공하는 것입니다. 이것은 먼저 전압 의존성 칼륨 채널을 발현하고 정제함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 이온 채널 재구성입니다.

다음으로, 이온 채널 기능 연구를 위해 지질 이중층의 이온 채널에서 전기적 기록이 수행됩니다. 마지막 단계는 구조 결정을 위한 멤브레인의 이온 채널 결정화입니다. 궁극적으로 생화학적 분석, 전기생리학적 방법 및 전자 결정학적 연구를 사용하여 이온 채널의 전압 센서 이동에 대한 지질 효과를 조사합니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 사람들은 단백질 재구성 및 생체 기록의 많은 기술적 세부 사항으로 인해 어려움을 겪을 것입니다. 이 영화가 전체 절차를 거치고 성공하는 데 도움이 되기를 바랍니다. 전체 절차의 시연은 제 연구실의 Dr.Hui Jim이 수행합니다.

지질 제제 이전에는 14 밀리리터 일회용 유리 시험관, 나사로 고정된 유리관 및 클로로포름이 함유된 250 마이크로리터 유리 주사기가 있었습니다. 그런 다음 클로로포름 10ml를 시험관에 옮깁니다. POPE와 POPG 리포좀을 준비하기 위해 3.75mg의 POPE와 1.25mg의 POPG를 클로로포름으로 나사로 덮인 유리관에 넣습니다.

눈에 보이는 클로로포름이 남지 않을 때 아르곤 가스의 연속적인 흐름으로 지질을 건조시킵니다. 1시간 동안 실내 진공 상태에서 지질을 더 사용해 보십시오. 다음으로, 440마이크로리터의 저염 완충액 또는 물을 건조된 지질 소용돌이에 추가합니다.

지질에 수분을 공급하는 튜브. 지질 현탁액은 희끄무레하고 뿅뿍 보여야 합니다. 그 후, 소포 용액이 반투명해질 때까지 얼음처럼 차가운 목욕에서 지질 현탁액을 초음파 처리합니다.

그런 다음 50 마이크로 리터의 3 몰 염화 칼륨과 10 마이크로 리터의 0.5 몰 DM을 혼합물에 넣어 최종 지질 현탁액이 300 밀리 몰 염화칼륨 및 10 밀리 몰 DM을 갖도록 실온에서 2 시간 동안 회전체에서 용액을 배양하여 지질 세제 혼합 M 세포를 형성 할 수 있도록합니다. 배양 후, 현탁액은 작은 ELLA 소포의 세제 유도 융합으로 인해 약간 뭉툭해져야합니다. 단백질이 밀리리터당 2밀리그램 이상으로 농축되면 나열된 성분인 지질 세제 혼합물을 첨가하여 1밀리리터의 최종 부피를 만듭니다.

그런 다음 단백질 지질 세제 혼합물을 회전기의 유리관에 2시간 더 배양합니다. 세제 가용화 DTaP 또는 DOGS와 혼합하여 KVAP를 제조하는 것은 P-O-P-E-P-O-P-G 소포에 대한 지질 준비와 유사합니다. 그러나 수화 된 지질을 작은 unli 소포로 초음파 처리하는 것은 P-O-P-E-P-O-P-G 지질보다 시간이 더 오래 걸리며, DOGS 소포는 서로 천천히 융합되어 작은 기름진 방울을 형성하여 도트 또는 DOGS를 완전히 용해시킬 수 있습니다.

초음파 처리 된 소포는 10 밀리 몰 DM 및 40 밀리 몰 베타 og와 혼합됩니다. 지질 세제 혼합물은 실온에서 밤새 배양되며 혼합물은 상당히 투명해야 하며 작은 입자나 물방울이 없어야 합니다. 다음으로, KVAP 단백질을 가용화 DTaP 또는 DOGS와 단백질 대 지질 비율이 1에서 10 사이

단백질 세제 지질 혼합물은 지속적인 궤도 회전으로 2-3시간 동안 실온에서 배양할 수 있습니다. DM 및 Beta og와 같이 상대적으로 CMC가 높은 세제의 느린 제거를 입증합니다. 먼저 1밀리리터 혼합물 각각에 대해 2리터의 투석 완충액을 준비합니다.

그런 다음 적절한 길이의 투석 튜브를 잘라내고 DI 물로 세척하여 튜브에 누출이 없는지 확인하고 확인합니다. 다음으로, 단백질 지질 세제 혼합물을 투석 튜브에 넣습니다. 용액 위에 최소한의 공간이 남도록 튜브의 양쪽 끝을 고정합니다.

투석 완충액의 교반 플레이트에 적재된 튜브를 놓아 튜브가 용액에서 천천히 회전하도록 합니다. 8시간마다 한 번씩 투석 완충액을 교체하십시오. 이제 CMC가 낮은 세제를 제거하기 위해 폴리스티렌 비드를 먼저 0.5g의 건조 비드를 날개로 준비합니다.

그런 다음 50 밀리리터 코닝 튜브에 넣고 20 밀리리터의 메탄올을 첨가하여 용액을 초음파 처리 한 다음 5 분 동안 갇힌 거품을 제거하고 5 분 동안 5, 000 RP에서 비드에 소비하고 메탄올을 완전히 디캔팅하고 에탄올과 밀리 Q 물로 세척을 반복합니다. 그런 다음 세척 된 비드를 섭씨 4 도의 20 % 에탄올에 보관하고 사용하기 전에 세제가없는 완충액으로 변경하십시오. 처리할 단백질 지질 세제 혼합물에서 세제의 양을 추정하고 세제를 제거하는 데 필요한 비드의 양을 계산합니다.

과도한 물 없이 젖은 구슬의 무게를 측정하고 단백질 혼합물에 직접 첨가하고 구슬이 완전히 효과를 발휘할 때까지 최소 15-20분 동안 기다립니다. 용액 1 밀리리터에서 8.7 밀리그램의 DDM을 제거하기 위해, 바이오 비드, SM 2와 같은 폴리스티렌 비드의 총 87 밀리그램을 5 등분으로 나눕니다. 단백질 지질 세제 혼합물을 실온에서 20-30분 동안 각 분획과 일정한 말단 회전으로 혼합합니다.

구슬을 스핀 다운한 다음 상등액을 구슬의 다음 분획으로 옮기고 끝까지 반복합니다. 이 단계에서는 유리 시험관과 호박색 바이알을 테프론 표면 나사 캡과 클로로포름이 함유된 유리 주사기 세트로 세척하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 아르곤 가스 흐름 아래에서 호박색 바이알을 건조시킵니다.

다음으로 클로로포름 함량 0.75mg의 POPE와 POPG 0.25mg을 엠버 바이알로 옮기고 클로로포름을 아르곤 가스로 증발시킵니다. 그 후, 바이알에 0.2ml의 펜탄을 첨가하여 건조된 지질을 용해시키고 완전히 건조시켜 잔류 클로로포름을 제거합니다. 다음으로, 바이알에 50마이크로리터의 데칸을 첨가하여 건조된 지질을 용해시킵니다.

이제 이중층 컵의 원통형 표면에 있는 둥근 구멍을 구멍에 지질 용액이 들어가지 않도록 지질로 칠합니다. 10년이 완전히 증발할 때까지 1-2분 동안 기다렸다가 지질의 KVAP 채널에서 층별 전기 기록을 수행합니다. 컵을 기록 챔버에 삽입하고 소금 다리를 넣고 전극을 기록 컵의 양쪽에 연결합니다.

전극 구멍에 낭종 용액을 추가하고 챔버의 외부 및 내부 컵에 CYS 및 트랜스 용액을 추가합니다. 그런 다음 컵의 양쪽 사이의 전위 오프셋을 2밀리볼트 미만으로 조정한 다음 캡의 구멍 전체에 지질을 칠합니다. 멤브레인이 얇아지고 비교적 안정될 때까지 기다립니다.

멤브레인이 안정되자마자. P 2 피펫 팁의 미세한 끝을 구멍 바로 위에 배치하여 소포를 포함하는 0.5-1 마이크로 리터의 채널을 쏘십시오. 소포는 구멍을 가로질러 컵 바닥으로 떨어집니다.

이중층에서 KVAP 채널을 테스트합니다. 80 밀리볼트의 짧은 펄스는 빠른 비활성화와 긴 간격의 활성화로 인한 느린 회복으로 인해 마이너스 80 밀리볼트의 유지 전위에서 전달되며, PEPG 멤브레인의 채널에 대해 약 120초가 두 펄스 사이에 주어집니다. 전류의 크기가 좋아 보이면 저농도 쪽에 이온 염을 추가하여 멤브레인 양쪽에 있는 용액의 이온 농도 균형을 맞춥니다.

다음은 결정 최적화의 중간인 음으로 염색된 2D 결정의 이미지입니다. 결정은 6%의 암모늄 모네이트, pH 6.4 및 때때로 서로 쌓인 설탕으로 인해 0.5%의 트리오스로 염색되었습니다. 여기서 검은색 사각형 상자는 회절 반점이 있는 회절 패턴을 발생시키는 영역을 지정합니다.

약 20 옹스트롬으로 가면 앞에서 보여준 것과 유사한 샘플에서 2D 결정의 cryo EM 이미지가 있습니다. 표본을 3% TLO와 혼합하고 직접 플런징으로 동결하고 50, 000 데크에서 cryo EM으로 이미지화했습니다. 결정 패킹에 국부적인 결함이 있었음이 분명합니다.

다음은 더욱 최적화된 결정의 또 다른 cryo-EM 이미지입니다. 견본은 0.75%tannin 및 10%tree 여hellos에서 끼워넣어지고, 심상은 50, 000 x에 가지고 갔다. 촘촘한 패킹의 직선은 이러한 유형의 결정에서 채널이 잘 정렬되어 있음을 암시하는 반면, 두 개의 검은색 화살표는 정사각형 벡터를 표시합니다.

이 동영상을 보고 나서 지질과 단백질을 올바르게 다루는 방법에 대해 잘 이해하게 되기를 바라며, 이 동영상이 막에서 작용하는 지질 단백질을 보다 효율적으로 연구하는 데 도움이 되기를 바랍니다.