Name: 구조 및 기능 연구를위한 지질 막에 Kv 값 채널의 재구성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: 배우세요 지질 이중막에 전압 개통 칼륨 채널을 재구성하여 이온 채널 기능과 구조를 연구하는 방법을. 전기생리학 기록과 전자결정학 분석이 가능합니다.

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장 실험실에서 KvAP에 대한 연구는 록펠러 대학에서 박사 로데릭 맥키의 연구실에서 상당한 도움을 얻을 수있다. 특별 감사는 조언 박사 Kathlynn 브라운과 마이클 McQuire에 가서 우리의 파지 화면 실험에 도움이됩니다. 이 작품은 NIH (Q-XJ에 GM088745와 GM093271) 및 AHA (Q-XJ에 12IRG9400019)에서 교부금에 의해 지원되었다.

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저자는 공개 아무것도 없어.

다른 막에 KvAP 채널의 재구성은 여러 연구 8-10에서 사용되었다. 세제 / 지질 혼합 미셀과 단백질 / 세제 / 지질 혼합 미셀 간 지질의 분포를 보장의 아이디어에 따라, 우리는 매우 다른 지질 만들어진 세포막에 KvAP의 거의 완전한 재구성에 도달 할 수 있습니다. 각각의 합체 KvAP 채널은 완벽하게 그 횡단 영역을 커버 ~ 100 지질 분자가 필요합니다. 필수 요구 사항은 세제가 제거되기 전에 충분한 지질 분자가 단백질 / 지질 / 세제 미셀에 융합 할 수 있도록하는 것입니다. 우리의 표준 조건 (0.5 MG 단백질과 5.0 ㎎ 지질)는 평균이 있다는 것을 ~ 단백질 분자 1,000 지질 분자를 확인합니다. 우리의 부양 실험, 생화학 실험은 재구성이 거의 완료되었음을 확인 하였다. 블랙 지질 세포막에 삽입 채널에서 전기 녹음 재구성 채널의 심사대항 할 파지 - 표시 펩타이드 라이브러리 및 세포막 채널의 2D 결정의 성장은 모든 용도에 막 재구성의 성공적인 응용 프로그램을 보여줍니다. <p ...

전지 교환 재료 및 특정 막 단백질 1의 기능을 통해 환경 정보를 제공합니다. 세포막에있는 막 단백질 펌프, 채널, 수용체, intramembrane 효소, 링커 및 세포막에 걸쳐 구조 후원자로 작동합니다. 막 단백질에 영향을 미치는 돌연변이는 많은 인간의 질병에 관련되어있다. 그들은 중요하고 세포막에 쉽게 접근 할 수 있기 때문에 사실, 많은 막 단백질은 기본 약물 표적이었다. 그것은 세포막의 다양한 막 단백질의 구조와 기능을 이해하고, 그것이 가능한 인간의 질병에 돌연변이 단백질의 해로운 영향을 완화하기 위해 새로운 방법을 고안 할 수 있도록하는 것이 매우 중요합니다. 지질 이중층 2, 3에 통합 된 모든 막 단백질을 둘러싸고 있습니다. 진핵 세포의 세포막, 지질의 여러 가지 유형 microdomains 4, 5로 구성되는 것으로 알려져있다.많은 막 단백질이 microdomains뿐만 아니라 세포막 3, 6의 부피가 큰 유체 상에 분산 할 보였다. microdomains 및 막 단백질의 전달 그들에와 같은 배포판의 생리적 의미의 조직을 기본 메커니즘은 분명 중요하지만 제대로 이해 남아있다. 막 단백질의 지질 효과를 연구 한 주요 기술적 인 어려움은 거의 모든 재구성 단백질 기능 7아르 수 있도록 생화학 적으로 잘 통제 지질 성분의 막으로 막 단백질을 정제 안정적인 재구성이다. 지난 몇 년 동안, 우리는 다시 구성 A.에서 프로토 타입 전압 문이 칼륨 채널을 방법을 개발 구조 및 기능 연구 8-10에 대한 다양한 멤브레인 시스템에 pernix (KvAP). 다른 사람의 데이터와 우리가 함께 지질 가능성이 전압 감지의 구조적 변화 결정 요인임을 보여 주었다전압 - 게이트 이온 채널의 도메인이 채널 11의 일부 구조를 형성 할 수 있습니다. 다음에, 우리는 우리의 방법에 대한 자세한 설명을 제공하고 가능성이 우리의 결과를 성공적으로 재현뿐만 아니라 다른 막 단백질의 연구에 대한 우리의 방법의 확장을 보장합니다 중요한 기술 팁을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>트립톤</td><td>RPI Corp.</td><td>T60060</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>RPI Corp.</td><td>Y20020</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>피셔</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>트리스 베이스</td><td>RPI Corp.</td><td>T60040</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>Fisher</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>n-Dodecyl-&#946;-D-Maltoside</td><td>Affymetrix</td><td>D322S</td><td>Sol-grade</td></tr><tr><td>n-Octyl-&#946;-D-Glucoside </td><td>Affymetrix</td><td>O311</td><td>Ana-grade</td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>RPI Corp.</td><td>A20550-0.05</td><td></td></tr><tr><td>루펩틴</td><td>RPI Corp.</td><td>L22035-0.025</td><td></td></tr><tr><td>펩스타틴 A</td><td>RPI Corp.</td><td>P30100-0.025</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>SIGMA</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Roche</td><td>13407000</td><td></td></tr><tr><td>바이오 비드 SM-2</td><td>바이오 라드</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>RPI Corp.</td><td>H75030</td><td></td></tr><tr><td>POPE</td><td>Avanti 극지 지</td>질 <td>850757C</td><td></td></tr><tr><td>POPG</td><td>Avanti 극지 지질</td><td>840457C</td><td></td></tr><tr><td>DOGS</td><td>Avanti 극지 지질</td><td>870314C</td><td></td></tr><tr><td>DMPC </td><td>Avanti 극지 지질</td><td>850345C</td><td></td></tr><tr><td>비오틴-도프 </td><td>Avanti 극지 지질</td><td>870282C</td><td></td></tr><tr><td>DOTAP</td><td>Avanti 극지 지질</td><td>890890C</td><td></td></tr><tr><td>NeutrAvidin 아가로스 비즈 </td><td>Piercenet</td><td>29200</td><td></td></tr><tr><td>투석 튜빙</td><td>스펙트럼 연구소, Inc</td><td>132-570</td><td></td></tr><tr><td>펜탄</td><td>피셔</td><td>R399-1</td><td></td></tr><tr><td>데칸</td><td>TCI 아메리카</td><td>D0011</td><td></td></tr><tr><td>MTS-PEG5000</td><td>토론토 리서치 시미컬스</td><td>M266501</td><td></td></tr></tbody></table>

구조 및 기능 연구를위한 지질 막에 kv 값 채널의 재구성

Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

축소 된 패션 지질 단백질 상호 작용을 연구하기 위해, 잘 정의 된 지질 성분의 막으로 막 단백질을 통합 할 필요가있다. 우리는 프로토 타입 전압 문 칼륨 (Kv 값) 채널의 지질에 따라 게이트 효과를 공부하고, 다른 멤브레인 시스템으로 재구성 채널에 대한 자세한 절차를 일한. 우리 재구성 절차는 세제에 의한 소포의 융합 단백질 / 세제 지질 / 세제 혼합 미셀과 미셀뿐만 아니라 단백질 / 세제 / 지질과 세제 간의 지질의 평형 분포에 도달의 중요성의 융합을 모두 고려 걸릴 / 지질 혼합 미셀. 우리의 데이터는 지질 소포에있는 채널의 삽입 방향이 상대적으로 무작위 것을 제안하고, 재구성 효율은 감지 단백질 집계가 분획 실험에서 나타나지 않았다 너무 높다. 우리는 재구성을 활용 한다른 지질 채널의 구조적 상태를 결정하는 D 채널은 평면 지질 이중층에 통합 채널의 소수 파지 - 표시 펩타이드 라이브러리의 형태 특정 리간드에 대한 화면의 전기적 활동을 기록하고, 2 차원 결정의 성장을 지원 세포막 채널. 여기에 설명 된 재구성 절차는 특히 진핵 전압 게이트 이온 채널의 지질 효과를 조사, 지질 이중층의 다른 막 단백질 연구에 맞게 수 있습니다.

생화학 적 동질성에 KvAP 채널을 정화 실험의 일반적 흐름은 그림 1A에 설명되어 있습니다. 단백질의 발현 및 정제하는 동안 일반 샘플은 그림 1B의 SDS-PAGE 젤에 보여진다. IMAC 정화 후, 단백질은 상대적으로 순수하다. KvAP 채널의 수율은 약 1.0 ㎎ / 리터 문화입니다. 세제 지질 소포의 가용화는 지질 대 세제의 각 쌍 위해 일해야합니다. DM으로 POPE / 교황의 작은 unilamellar 소포의 가용화는 그림 2a에 제시되어, 소포 부양의 결과는 일반적으로 매우 간단합니다. 그라디언트에서 분수의 SDS-PAGE 분석의 전형적인 결과는 그림 2B에서 보여준 있습니다. 자당 밀도 구배에 채널이 포함 POPE / POPG 소포는 보통 10 % 계층 사이의 인터페이스에 집중되어있다D 35 % 계층. KvAP 함유 DOTAP 또는 DOGS...

지질 세포막에 프로토 타입 전압 문이 칼륨 채널의 완전한 재구성에 대한 절차를 설명합니다. 재구성 채널은 생화학 적 분석, 전기 녹음, 리간​​드 스크리닝 및 전자 결정학 연구에 적합합니다. 이러한 방법은 다른 막 단백질의 구조 및 기능 연구에 일반적으로 응용 프로그램이있을 수 있습니다.

구조 및 기능 연구를위한 지질 막에 Kv 값 채널의 재구성

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...

이 절차의 전반적인 목적은 막 단백질에 미치는 지질의 영향에 대한 기능적 및 구조적 연구 기법을 상세히 설명하는 것입니다. 이를 위해 먼저 전압 개폐성 칼륨 채널을 발현 및 정제합니다. 두 번째 단계는 이온 채널의 재구성입니다.다음으로, 이온 통로의 기능 연구를 위해 지질 이중층 내 이온 통로의 전기적 기록을 수행합니다. 마지막 단계는 구조 결정을 위해 막 내 이온 통로를 결정화하는 것입니다. 궁극적으로 생화학적 분석, 전기생리학적 방법 및 전자 결정학 연구를 통해 이온 통로의 전압 센서 이동에 미치는 지질의 영향을 조사합니다.일반적으로 이 방법을 처음 접하는 사람들은 단백질 재구성 및 생물학적 기록 과정의 많은 기술적 세부 사항으로 인해 어려움을 겪습니다. 이 영상의 과정이 전체 절차를 수행하고 성공하는 데 도움이 되기를 바랍니다. 전체 절차에 대한 시연은 저희 실험실의 Dr.Hui Jim이 진행하겠습니다.지질 조제 전, 14 mL 일회용 유리 시험관, 스크류 캡 유리 튜브 및 클로로포름이 충전된 250 µL 유리 시린지를 준비합니다. 그다음 10 mL의 클로로포름을 시험관에 옮깁니다. POPE 및 POPG 리포좀을 조제하려면 클로로포름에 용해된 3.75 mg의 POPE와 1.25 mg의 POPG를 스크류 캡 유리 튜브로 옮깁니다.눈에 보이는 클로로포름이 없을 때까지 아르곤 가스를 계속 흘려 지질을 건조합니다. 이후 상온 진공 상태에서 지질을 1시간 동안 더 건조합니다. 다음으로, 건조된 지질이 있는 보텍스 튜브에 440 µL의 저염 버퍼 또는 증류수를 첨가합니다.지질을 수화시키기 위한 튜브입니다. 지질 현탁액은 희고 탁하게 보여야 합니다. 그 후, 소포 용액이 반투명해질 때까지 얼음 냉수욕에서 지질 현탁액을 초음파 처리합니다.그 다음, 최종 지질 현탁액이 300 millimolar potassium chloride와 10 millimolar DM을 함유하도록 혼합물에 3 molar potassium chloride 50 microliters와 0.5 molar DM 10 microliters를 첨가합니다. 지질-계면활성제 혼합 미셀(lipid detergent mixed micelles)이 형성될 수 있도록 용액을 회전 혼합기(rotator)에서 상온으로 2시간 동안 배양합니다. 배양 후에는 계면활성제로 인해 작은 ELLA 소포들이 융합되어 현탁액이 약간 탁해져야 합니다. 단백질 농도가 2 milligrams per milliliter 이상으로 농축되면, 최종 부피가 1 milliliter가 되도록 명시된 성분들과 지질-계면활성제 혼합물을 첨가합니다.그 다음, 유리 튜브에 담긴 단백질-지질-계면활성제 혼합물을 회전혼합기(rotator)에서 2시간 동안 더 배양합니다. 계면활성제로 가용화된 DTaP 또는 DOGS와 혼합된 KVAP의 준비 과정은 P-O-P-E-P-O-P-G 소포를 위한 지질 준비 과정과 유사합니다. 하지만 수화된 지질을 작은 단일층 소포(unilamellar vesicles)로 만드는 초음파 처리 과정은 P-O-P-E-P-O-P-G 지질보다 더 오랜 시간이 걸리며, DOGS 소포는 서로 천천히 융합되어 작은 오일 방울을 형성함으로써 dote 또는 DOGS를 완전히 가용화할 수 있습니다.초음파 처리된 소포를 10 millimolar DM 및 40 millimolar beta og와 혼합합니다. 지질-계면활성제 혼합물을 실온에서 하룻밤 동안 배양하며, 이때 혼합물은 상당히 투명해야 하며 작은 입자나 액적(droplet)이 없어야 합니다. 다음으로, KVAP 단백질을 계면활성제로 가용화된 DTaP 또는 DOGS와 단백질 대 지질 비율이 1:10 이하가 되도록 혼합합니다.단백질-계면활성제-지질 혼합물을 실온에서 2~3시간 동안 지속적으로 궤도 회전시키며 배양합니다. DM 및 Beta og와 같이 CMC가 상대적으로 높은 계면활성제의 느린 제거를 입증하기 위해, 먼저 혼합물 1 mL당 2L의 투석 완충액을 준비합니다.그런 다음 적절한 길이의 투석 튜브를 잘라내고, DI water로 세척하여 튜브에 누출이 없는지 확인합니다. 다음으로, 단백질-지질-계면활성제 혼합물을 투석 튜브에 넣습니다. 용액 위쪽의 공간이 최소한으로 남도록 튜브의 양 끝을 클램프로 고정합니다.적재된 튜브를 투석 완충액이 담긴 교반기 위에 놓아 튜브가 용액 속에서 천천히 회전하도록 합니다. 투석 완충액은 8시간마다 한 번씩 교체합니다. 이제 CMC가 낮은 계면활성제를 제거하기 위해, 먼저 건조된 비드 0.5 g을 달아 폴리스티렌 비드를 준비합니다.그 다음, 이들을 50 mL Corning 튜브에 넣고 20 mL의 메탄올을 추가한 뒤 수조에서 용액을 초음파 처리합니다. 갇힌 기포를 제거하기 위해 5분 동안 초음파 처리하고, 5,000 rpm에서 5분 동안 비드를 원심분리합니다. 그 후, 메탄올을 완전히 따라내고 에탄올과 milli Q수로 세척 과정을 반복합니다. 세척된 비드는 4°C에서 20% 에탄올에 보관하며, 사용 전 계면활성제가 없는 버퍼로 교체합니다. 처리할 단백질-지질-계면활성제 혼합물 내의 계면활성제 양을 추정하고, 계면활성제를 제거하는 데 필요한 비드의 양을 계산합니다.과잉 수분이 없는 젖은 비즈를 정량하여 단백질 혼합물에 직접 첨가하고, 비즈가 충분히 작용할 수 있도록 최소 15~20분 동안 기다립니다. 용액 1mL당 8.7mg의 DDM을 제거하기 위해, Bio-Beads SM-2와 같은 폴리스티렌 비즈 총 87mg을 다섯 개의 동일한 분량으로 나눕니다. 단백질-지질-계면활성제 혼합물을 각 분량의 비즈와 섞고, 실온에서 지속적으로 end-over-end 회전을 시키며 20~30분 동안 혼합합니다.비즈를 원심 분리한 후, 상층액을 다음 비즈 분획으로 옮기고 마지막까지 이 과정을 반복합니다. 이 단계에서는 먼저 유리 시험관과 테플론 표면의 스크류 캡이 달린 갈색 바이알, 그리고 유리 시린지 세트를 클로로포름으로 세척하십시오. 그런 다음 아르곤 가스 흐름 하에서 갈색 바이알을 건조합니다.다음으로, POPE 0.75 milligrams와 POPG 0.25 milligrams가 포함된 클로로포름 용액을 앰버 바이알에 옮기고 아르곤 가스로 클로로포름을 증발시킵니다. 그 후, 건조된 지질을 용해하기 위해 바이알에 펜탄 0.2 milliliters를 첨가하고, 잔류 클로로포름을 제거하기 위해 완전히 건조합니다. 다음으로, 건조된 지질을 용해하기 위해 바이알에 데칸 50 microliters를 첨가합니다.이제 지질 용액이 구멍 내부로 들어가지 않도록 주의하면서, 이중층 컵의 원통형 표면에 있는 둥근 구멍을 지질로 도포하십시오. 지질 이중층 내 KVAP 채널의 전기적 기록을 수행하기 위해 데칸테이트가 완전히 증발할 때까지 1~2분 동안 기다립니다. 컵을 기록 챔버에 삽입하고, 염교를 설치한 후 전극을 기록 컵의 양쪽에 연결하십시오.전극 구멍에 cyst 용액을 추가하고, 챔버의 외부 및 내부 컵에 CYS 및 trans 용액을 추가합니다. 그런 다음 컵 양쪽의 전위 오프셋을 2 mV 미만으로 조정하고, 캡의 구멍을 가로질러 지질을 도포합니다. 막이 얇아지고 상대적으로 안정될 때까지 기다립니다.막이 안정화되면, P2 피펫 팁의 가느다란 끝부분을 구멍 바로 위에 위치시켜 소포가 포함된 채널의 0.5에서 1 µL를 분사합니다. 소포는 구멍을 통해 컵 바닥으로 떨어집니다.지질 이중층 내의 KVAP 채널을 테스트하기 위해, 빠른 불활성화와 활성화 후의 느린 회복 특성으로 인해 -80 mV의 유지 전위에서 80 mV의 짧은 펄스를 가합니다. PEPG 막에 있는 채널의 경우 두 펄스 사이에 약 120초의 긴 간격을 둡니다. 전류의 크기가 적절하게 나타나면, 저농도 측에 이온 염을 추가로 첨가하여 막 양측 용액의 이온 농도 균형을 맞춥니다.다음은 결정 최적화 과정 중간 단계에서 음성 염색된 2D 결정의 이미지입니다. 당 성분으로 인해 결정들이 서로 뭉치는 경우가 있어, pH 6.4의 6% ammonium moate와 0.5% triose로 염색하였습니다. 여기의 검은색 사각형 상자는 회절 반점이 있는 회절 패턴을 생성하는 영역을 나타냅니다.약 20 angstrom 해상도에서, 이전에 보여드린 것과 유사한 샘플로부터 얻은 2D 결정의 cryo EM 이미지입니다. 시료를 3% TLOs와 혼합한 후 직접 급속 동결(direct plunging)시켜 50,000배 배율의 cryo EM으로 촬영하였습니다. 결정 패킹에 국소적인 결함이 있었음을 명확히 알 수 있습니다.추가로 최적화된 결정의 또 다른 cryo-EM 이미지입니다. 시료는 0.75% tannin과 10% tree hellos에 매립되었으며, 이미지는 50,000 x 배율로 촬영되었습니다. 조밀한 패킹에서 나타나는 직선들은 이러한 유형의 결정에서 채널들이 잘 정렬되어 있음을 시사하며, 두 개의 검은색 화살표는 정사각형 벡터를 표시합니다.이 영상을 시청하신 후, 지질과 단백질을 적절하게 다루는 방법에 대해 충분히 이해하시길 바라며, 본 영상이 막 내 지질-단백질 상호작용을 더욱 효율적으로 연구하시는 데 도움이 되기를 바랍니다.

reconstitution-kv-channel-into-lipid-membranes-for-structural

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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