구조 및 기능 연구를위한 지질 막에 Kv 값 채널의 재구성

이 절차의 전반적인 목적은 막 단백질에 미치는 지질의 영향에 대한 기능적 및 구조적 연구 기법을 상세히 설명하는 것입니다. 이를 위해 먼저 전압 개폐성 칼륨 채널을 발현 및 정제합니다. 두 번째 단계는 이온 채널의 재구성입니다.

다음으로, 이온 통로의 기능 연구를 위해 지질 이중층 내 이온 통로의 전기적 기록을 수행합니다. 마지막 단계는 구조 결정을 위해 막 내 이온 통로를 결정화하는 것입니다. 궁극적으로 생화학적 분석, 전기생리학적 방법 및 전자 결정학 연구를 통해 이온 통로의 전압 센서 이동에 미치는 지질의 영향을 조사합니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 사람들은 단백질 재구성 및 생물학적 기록 과정의 많은 기술적 세부 사항으로 인해 어려움을 겪습니다. 이 영상의 과정이 전체 절차를 수행하고 성공하는 데 도움이 되기를 바랍니다. 전체 절차에 대한 시연은 저희 실험실의 Dr.Hui Jim이 진행하겠습니다.

지질 조제 전, 14 mL 일회용 유리 시험관, 스크류 캡 유리 튜브 및 클로로포름이 충전된 250 µL 유리 시린지를 준비합니다. 그다음 10 mL의 클로로포름을 시험관에 옮깁니다. POPE 및 POPG 리포좀을 조제하려면 클로로포름에 용해된 3.75 mg의 POPE와 1.25 mg의 POPG를 스크류 캡 유리 튜브로 옮깁니다.

눈에 보이는 클로로포름이 없을 때까지 아르곤 가스를 계속 흘려 지질을 건조합니다. 이후 상온 진공 상태에서 지질을 1시간 동안 더 건조합니다. 다음으로, 건조된 지질이 있는 보텍스 튜브에 440 µL의 저염 버퍼 또는 증류수를 첨가합니다.

지질을 수화시키기 위한 튜브입니다. 지질 현탁액은 희고 탁하게 보여야 합니다. 그 후, 소포 용액이 반투명해질 때까지 얼음 냉수욕에서 지질 현탁액을 초음파 처리합니다.

그 다음, 최종 지질 현탁액이 300 millimolar potassium chloride와 10 millimolar DM을 함유하도록 혼합물에 3 molar potassium chloride 50 microliters와 0.5 molar DM 10 microliters를 첨가합니다. 지질-계면활성제 혼합 미셀(lipid detergent mixed micelles)이 형성될 수 있도록 용액을 회전 혼합기(rotator)에서 상온으로 2시간 동안 배양합니다. 배양 후에는 계면활성제로 인해 작은 ELLA 소포들이 융합되어 현탁액이 약간 탁해져야 합니다. 단백질 농도가 2 milligrams per milliliter 이상으로 농축되면, 최종 부피가 1 milliliter가 되도록 명시된 성분들과 지질-계면활성제 혼합물을 첨가합니다.

그 다음, 유리 튜브에 담긴 단백질-지질-계면활성제 혼합물을 회전혼합기(rotator)에서 2시간 동안 더 배양합니다. 계면활성제로 가용화된 DTaP 또는 DOGS와 혼합된 KVAP의 준비 과정은 P-O-P-E-P-O-P-G 소포를 위한 지질 준비 과정과 유사합니다. 하지만 수화된 지질을 작은 단일층 소포(unilamellar vesicles)로 만드는 초음파 처리 과정은 P-O-P-E-P-O-P-G 지질보다 더 오랜 시간이 걸리며, DOGS 소포는 서로 천천히 융합되어 작은 오일 방울을 형성함으로써 dote 또는 DOGS를 완전히 가용화할 수 있습니다.

초음파 처리된 소포를 10 millimolar DM 및 40 millimolar beta og와 혼합합니다. 지질-계면활성제 혼합물을 실온에서 하룻밤 동안 배양하며, 이때 혼합물은 상당히 투명해야 하며 작은 입자나 액적(droplet)이 없어야 합니다. 다음으로, KVAP 단백질을 계면활성제로 가용화된 DTaP 또는 DOGS와 단백질 대 지질 비율이 1:10 이하가 되도록 혼합합니다.

단백질-계면활성제-지질 혼합물을 실온에서 2~3시간 동안 지속적으로 궤도 회전시키며 배양합니다. DM 및 Beta og와 같이 CMC가 상대적으로 높은 계면활성제의 느린 제거를 입증하기 위해, 먼저 혼합물 1 mL당 2L의 투석 완충액을 준비합니다.

그런 다음 적절한 길이의 투석 튜브를 잘라내고, DI water로 세척하여 튜브에 누출이 없는지 확인합니다. 다음으로, 단백질-지질-계면활성제 혼합물을 투석 튜브에 넣습니다. 용액 위쪽의 공간이 최소한으로 남도록 튜브의 양 끝을 클램프로 고정합니다.

적재된 튜브를 투석 완충액이 담긴 교반기 위에 놓아 튜브가 용액 속에서 천천히 회전하도록 합니다. 투석 완충액은 8시간마다 한 번씩 교체합니다. 이제 CMC가 낮은 계면활성제를 제거하기 위해, 먼저 건조된 비드 0.5 g을 달아 폴리스티렌 비드를 준비합니다.

그 다음, 이들을 50 mL Corning 튜브에 넣고 20 mL의 메탄올을 추가한 뒤 수조에서 용액을 초음파 처리합니다. 갇힌 기포를 제거하기 위해 5분 동안 초음파 처리하고, 5,000 rpm에서 5분 동안 비드를 원심분리합니다. 그 후, 메탄올을 완전히 따라내고 에탄올과 milli Q수로 세척 과정을 반복합니다. 세척된 비드는 4°C에서 20% 에탄올에 보관하며, 사용 전 계면활성제가 없는 버퍼로 교체합니다. 처리할 단백질-지질-계면활성제 혼합물 내의 계면활성제 양을 추정하고, 계면활성제를 제거하는 데 필요한 비드의 양을 계산합니다.

과잉 수분이 없는 젖은 비즈를 정량하여 단백질 혼합물에 직접 첨가하고, 비즈가 충분히 작용할 수 있도록 최소 15~20분 동안 기다립니다. 용액 1mL당 8.7mg의 DDM을 제거하기 위해, Bio-Beads SM-2와 같은 폴리스티렌 비즈 총 87mg을 다섯 개의 동일한 분량으로 나눕니다. 단백질-지질-계면활성제 혼합물을 각 분량의 비즈와 섞고, 실온에서 지속적으로 end-over-end 회전을 시키며 20~30분 동안 혼합합니다.

비즈를 원심 분리한 후, 상층액을 다음 비즈 분획으로 옮기고 마지막까지 이 과정을 반복합니다. 이 단계에서는 먼저 유리 시험관과 테플론 표면의 스크류 캡이 달린 갈색 바이알, 그리고 유리 시린지 세트를 클로로포름으로 세척하십시오. 그런 다음 아르곤 가스 흐름 하에서 갈색 바이알을 건조합니다.

다음으로, POPE 0.75 milligrams와 POPG 0.25 milligrams가 포함된 클로로포름 용액을 앰버 바이알에 옮기고 아르곤 가스로 클로로포름을 증발시킵니다. 그 후, 건조된 지질을 용해하기 위해 바이알에 펜탄 0.2 milliliters를 첨가하고, 잔류 클로로포름을 제거하기 위해 완전히 건조합니다. 다음으로, 건조된 지질을 용해하기 위해 바이알에 데칸 50 microliters를 첨가합니다.

이제 지질 용액이 구멍 내부로 들어가지 않도록 주의하면서, 이중층 컵의 원통형 표면에 있는 둥근 구멍을 지질로 도포하십시오. 지질 이중층 내 KVAP 채널의 전기적 기록을 수행하기 위해 데칸테이트가 완전히 증발할 때까지 1~2분 동안 기다립니다. 컵을 기록 챔버에 삽입하고, 염교를 설치한 후 전극을 기록 컵의 양쪽에 연결하십시오.

전극 구멍에 cyst 용액을 추가하고, 챔버의 외부 및 내부 컵에 CYS 및 trans 용액을 추가합니다. 그런 다음 컵 양쪽의 전위 오프셋을 2 mV 미만으로 조정하고, 캡의 구멍을 가로질러 지질을 도포합니다. 막이 얇아지고 상대적으로 안정될 때까지 기다립니다.

막이 안정화되면, P2 피펫 팁의 가느다란 끝부분을 구멍 바로 위에 위치시켜 소포가 포함된 채널의 0.5에서 1 µL를 분사합니다. 소포는 구멍을 통해 컵 바닥으로 떨어집니다.

지질 이중층 내의 KVAP 채널을 테스트하기 위해, 빠른 불활성화와 활성화 후의 느린 회복 특성으로 인해 -80 mV의 유지 전위에서 80 mV의 짧은 펄스를 가합니다. PEPG 막에 있는 채널의 경우 두 펄스 사이에 약 120초의 긴 간격을 둡니다. 전류의 크기가 적절하게 나타나면, 저농도 측에 이온 염을 추가로 첨가하여 막 양측 용액의 이온 농도 균형을 맞춥니다.

다음은 결정 최적화 과정 중간 단계에서 음성 염색된 2D 결정의 이미지입니다. 당 성분으로 인해 결정들이 서로 뭉치는 경우가 있어, pH 6.4의 6% ammonium moate와 0.5% triose로 염색하였습니다. 여기의 검은색 사각형 상자는 회절 반점이 있는 회절 패턴을 생성하는 영역을 나타냅니다.

약 20 angstrom 해상도에서, 이전에 보여드린 것과 유사한 샘플로부터 얻은 2D 결정의 cryo EM 이미지입니다. 시료를 3% TLOs와 혼합한 후 직접 급속 동결(direct plunging)시켜 50,000배 배율의 cryo EM으로 촬영하였습니다. 결정 패킹에 국소적인 결함이 있었음을 명확히 알 수 있습니다.

추가로 최적화된 결정의 또 다른 cryo-EM 이미지입니다. 시료는 0.75% tannin과 10% tree hellos에 매립되었으며, 이미지는 50,000 x 배율로 촬영되었습니다. 조밀한 패킹에서 나타나는 직선들은 이러한 유형의 결정에서 채널들이 잘 정렬되어 있음을 시사하며, 두 개의 검은색 화살표는 정사각형 벡터를 표시합니다.

이 영상을 시청하신 후, 지질과 단백질을 적절하게 다루는 방법에 대해 충분히 이해하시길 바라며, 본 영상이 막 내 지질-단백질 상호작용을 더욱 효율적으로 연구하시는 데 도움이 되기를 바랍니다.