Name: 구조 및 기능 연구를위한 지질 막에 Kv 값 채널의 재구성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: 배우세요 지질 이중막에 전압 개통 칼륨 채널을 재구성하여 이온 채널 기능과 구조를 연구하는 방법을. 전기생리학 기록과 전자결정학 분석이 가능합니다.

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장 실험실에서 KvAP에 대한 연구는 록펠러 대학에서 박사 로데릭 맥키의 연구실에서 상당한 도움을 얻을 수있다. 특별 감사는 조언 박사 Kathlynn 브라운과 마이클 McQuire에 가서 우리의 파지 화면 실험에 도움이됩니다. 이 작품은 NIH (Q-XJ에 GM088745와 GM093271) 및 AHA (Q-XJ에 12IRG9400019)에서 교부금에 의해 지원되었다.

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저자는 공개 아무것도 없어.

다른 막에 KvAP 채널의 재구성은 여러 연구 8-10에서 사용되었다. 세제 / 지질 혼합 미셀과 단백질 / 세제 / 지질 혼합 미셀 간 지질의 분포를 보장의 아이디어에 따라, 우리는 매우 다른 지질 만들어진 세포막에 KvAP의 거의 완전한 재구성에 도달 할 수 있습니다. 각각의 합체 KvAP 채널은 완벽하게 그 횡단 영역을 커버 ~ 100 지질 분자가 필요합니다. 필수 요구 사항은 세제가 제거되기 전에 충분한 지질 분자가 단백질 / 지질 / 세제 미셀에 융합 할 수 있도록하는 것입니다. 우리의 표준 조건 (0.5 MG 단백질과 5.0 ㎎ 지질)는 평균이 있다는 것을 ~ 단백질 분자 1,000 지질 분자를 확인합니다. 우리의 부양 실험, 생화학 실험은 재구성이 거의 완료되었음을 확인 하였다. 블랙 지질 세포막에 삽입 채널에서 전기 녹음 재구성 채널의 심사대항 할 파지 - 표시 펩타이드 라이브러리 및 세포막 채널의 2D 결정의 성장은 모든 용도에 막 재구성의 성공적인 응용 프로그램을 보여줍니다. <p ...

전지 교환 재료 및 특정 막 단백질 1의 기능을 통해 환경 정보를 제공합니다. 세포막에있는 막 단백질 펌프, 채널, 수용체, intramembrane 효소, 링커 및 세포막에 걸쳐 구조 후원자로 작동합니다. 막 단백질에 영향을 미치는 돌연변이는 많은 인간의 질병에 관련되어있다. 그들은 중요하고 세포막에 쉽게 접근 할 수 있기 때문에 사실, 많은 막 단백질은 기본 약물 표적이었다. 그것은 세포막의 다양한 막 단백질의 구조와 기능을 이해하고, 그것이 가능한 인간의 질병에 돌연변이 단백질의 해로운 영향을 완화하기 위해 새로운 방법을 고안 할 수 있도록하는 것이 매우 중요합니다. 지질 이중층 2, 3에 통합 된 모든 막 단백질을 둘러싸고 있습니다. 진핵 세포의 세포막, 지질의 여러 가지 유형 microdomains 4, 5로 구성되는 것으로 알려져있다.많은 막 단백질이 microdomains뿐만 아니라 세포막 3, 6의 부피가 큰 유체 상에 분산 할 보였다. microdomains 및 막 단백질의 전달 그들에와 같은 배포판의 생리적 의미의 조직을 기본 메커니즘은 분명 중요하지만 제대로 이해 남아있다. 막 단백질의 지질 효과를 연구 한 주요 기술적 인 어려움은 거의 모든 재구성 단백질 기능 7아르 수 있도록 생화학 적으로 잘 통제 지질 성분의 막으로 막 단백질을 정제 안정적인 재구성이다. 지난 몇 년 동안, 우리는 다시 구성 A.에서 프로토 타입 전압 문이 칼륨 채널을 방법을 개발 구조 및 기능 연구 8-10에 대한 다양한 멤브레인 시스템에 pernix (KvAP). 다른 사람의 데이터와 우리가 함께 지질 가능성이 전압 감지의 구조적 변화 결정 요인임을 보여 주었다전압 - 게이트 이온 채널의 도메인이 채널 11의 일부 구조를 형성 할 수 있습니다. 다음에, 우리는 우리의 방법에 대한 자세한 설명을 제공하고 가능성이 우리의 결과를 성공적으로 재현뿐만 아니라 다른 막 단백질의 연구에 대한 우리의 방법의 확장을 보장합니다 중요한 기술 팁을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>트립톤</td><td>RPI Corp.</td><td>T60060</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>RPI Corp.</td><td>Y20020</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>피셔</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>트리스 베이스</td><td>RPI Corp.</td><td>T60040</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>Fisher</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>n-Dodecyl-&#946;-D-Maltoside</td><td>Affymetrix</td><td>D322S</td><td>Sol-grade</td></tr><tr><td>n-Octyl-&#946;-D-Glucoside </td><td>Affymetrix</td><td>O311</td><td>Ana-grade</td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>RPI Corp.</td><td>A20550-0.05</td><td></td></tr><tr><td>루펩틴</td><td>RPI Corp.</td><td>L22035-0.025</td><td></td></tr><tr><td>펩스타틴 A</td><td>RPI Corp.</td><td>P30100-0.025</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>SIGMA</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Roche</td><td>13407000</td><td></td></tr><tr><td>바이오 비드 SM-2</td><td>바이오 라드</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>RPI Corp.</td><td>H75030</td><td></td></tr><tr><td>POPE</td><td>Avanti 극지 지</td>질 <td>850757C</td><td></td></tr><tr><td>POPG</td><td>Avanti 극지 지질</td><td>840457C</td><td></td></tr><tr><td>DOGS</td><td>Avanti 극지 지질</td><td>870314C</td><td></td></tr><tr><td>DMPC </td><td>Avanti 극지 지질</td><td>850345C</td><td></td></tr><tr><td>비오틴-도프 </td><td>Avanti 극지 지질</td><td>870282C</td><td></td></tr><tr><td>DOTAP</td><td>Avanti 극지 지질</td><td>890890C</td><td></td></tr><tr><td>NeutrAvidin 아가로스 비즈 </td><td>Piercenet</td><td>29200</td><td></td></tr><tr><td>투석 튜빙</td><td>스펙트럼 연구소, Inc</td><td>132-570</td><td></td></tr><tr><td>펜탄</td><td>피셔</td><td>R399-1</td><td></td></tr><tr><td>데칸</td><td>TCI 아메리카</td><td>D0011</td><td></td></tr><tr><td>MTS-PEG5000</td><td>토론토 리서치 시미컬스</td><td>M266501</td><td></td></tr></tbody></table>

구조 및 기능 연구를위한 지질 막에 kv 값 채널의 재구성

Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

축소 된 패션 지질 단백질 상호 작용을 연구하기 위해, 잘 정의 된 지질 성분의 막으로 막 단백질을 통합 할 필요가있다. 우리는 프로토 타입 전압 문 칼륨 (Kv 값) 채널의 지질에 따라 게이트 효과를 공부하고, 다른 멤브레인 시스템으로 재구성 채널에 대한 자세한 절차를 일한. 우리 재구성 절차는 세제에 의한 소포의 융합 단백질 / 세제 지질 / 세제 혼합 미셀과 미셀뿐만 아니라 단백질 / 세제 / 지질과 세제 간의 지질의 평형 분포에 도달의 중요성의 융합을 모두 고려 걸릴 / 지질 혼합 미셀. 우리의 데이터는 지질 소포에있는 채널의 삽입 방향이 상대적으로 무작위 것을 제안하고, 재구성 효율은 감지 단백질 집계가 분획 실험에서 나타나지 않았다 너무 높다. 우리는 재구성을 활용 한다른 지질 채널의 구조적 상태를 결정하는 D 채널은 평면 지질 이중층에 통합 채널의 소수 파지 - 표시 펩타이드 라이브러리의 형태 특정 리간드에 대한 화면의 전기적 활동을 기록하고, 2 차원 결정의 성장을 지원 세포막 채널. 여기에 설명 된 재구성 절차는 특히 진핵 전압 게이트 이온 채널의 지질 효과를 조사, 지질 이중층의 다른 막 단백질 연구에 맞게 수 있습니다.

생화학 적 동질성에 KvAP 채널을 정화 실험의 일반적 흐름은 그림 1A에 설명되어 있습니다. 단백질의 발현 및 정제하는 동안 일반 샘플은 그림 1B의 SDS-PAGE 젤에 보여진다. IMAC 정화 후, 단백질은 상대적으로 순수하다. KvAP 채널의 수율은 약 1.0 ㎎ / 리터 문화입니다. 세제 지질 소포의 가용화는 지질 대 세제의 각 쌍 위해 일해야합니다. DM으로 POPE / 교황의 작은 unilamellar 소포의 가용화는 그림 2a에 제시되어, 소포 부양의 결과는 일반적으로 매우 간단합니다. 그라디언트에서 분수의 SDS-PAGE 분석의 전형적인 결과는 그림 2B에서 보여준 있습니다. 자당 밀도 구배에 채널이 포함 POPE / POPG 소포는 보통 10 % 계층 사이의 인터페이스에 집중되어있다D 35 % 계층. KvAP 함유 DOTAP 또는 DOGS...

지질 세포막에 프로토 타입 전압 문이 칼륨 채널의 완전한 재구성에 대한 절차를 설명합니다. 재구성 채널은 생화학 적 분석, 전기 녹음, 리간​​드 스크리닝 및 전자 결정학 연구에 적합합니다. 이러한 방법은 다른 막 단백질의 구조 및 기능 연구에 일반적으로 응용 프로그램이있을 수 있습니다.

구조 및 기능 연구를위한 지질 막에 Kv 값 채널의 재구성

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...

이 절차의 전반적인 목적은 막 단백질에 미치는 지질의 영향에 대한 기능적 및 구조적 연구 기법을 상세히 설명하는 것입니다. 이를 위해 먼저 전압 개폐성 칼륨 채널을 발현 및 정제합니다. 두 번째 단계는 이온 채널의 재구성입니다.다음으로, 이온 통로의 기능 연구를 위해 지질 이중층 내 이온 통로의 전기적 기록을 수행합니다. 마지막 단계는 구조 결정을 위해 막 내 이온 통로를 결정화하는 것입니다. 궁극적으로 생화학적 분석, 전기생리학적 방법 및 전자 결정학 연구를 통해 이온 통로의 전압 센서 이동에 미치는 지질의 영향을 조사합니다.일반적으로 이 방법을 처음 접하는 사람들은 단백질 재구성 및 생물학적 기록 과정의 많은 기술적 세부 사항으로 인해 어려움을 겪습니다. 이 영상의 과정이 전체 절차를 수행하고 성공하는 데 도움이 되기를 바랍니다. 전체 절차에 대한 시연은 저희 실험실의 Dr.Hui Jim이 진행하겠습니다.지질 조제 전, 14 mL 일회용 유리 시험관, 스크류 캡 유리 튜브 및 클로로포름이 충전된 250 µL 유리 시린지를 준비합니다. 그다음 10 mL의 클로로포름을 시험관에 옮깁니다. POPE 및 POPG 리포좀을 조제하려면 클로로포름에 용해된 3.75 mg의 POPE와 1.25 mg의 POPG를 스크류 캡 유리 튜브로 옮깁니다.눈에 보이는 클로로포름이 없을 때까지 아르곤 가스를 계속 흘려 지질을 건조합니다. 이후 상온 진공 상태에서 지질을 1시간 동안 더 건조합니다. 다음으로, 건조된 지질이 있는 보텍스 튜브에 440 µL의 저염 버퍼 또는 증류수를 첨가합니다.지질을 수화시키기 위한 튜브입니다. 지질 현탁액은 희고 탁하게 보여야 합니다. 그 후, 소포 용액이 반투명해질 때까지 얼음 냉수욕에서 지질 현탁액을 초음파 처리합니다.그 다음, 최종 지질 현탁액이 300 millimolar potassium chloride와 10 millimolar DM을 함유하도록 혼합물에 3 molar potassium chloride 50 microliters와 0.5 molar DM 10 microliters를 첨가합니다. 지질-계면활성제 혼합 미셀(lipid detergent mixed micelles)이 형성될 수 있도록 용액을 회전 혼합기(rotator)에서 상온으로 2시간 동안 배양합니다. 배양 후에는 계면활성제로 인해 작은 ELLA 소포들이 융합되어 현탁액이 약간 탁해져야 합니다. 단백질 농도가 2 milligram

reconstitution-kv-channel-into-lipid-membranes-for-structural

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

패치 클램프 전기 생리학과 결합 될 때 정의 된 구성의 거대한 리포좀으로 기능 막 단백질을 재구성하는 강력한 방법입니다. 그러나 기존의 거대한 리포좀 생산 단백질의 안정성과 호환되지 않을 수 있습니다. 우리는 순수 지질이나 이온 채널을 포함하는 작은 리포좀의 거대한 리포좀 생산을위한 프로토콜을 설명합니다.

이미징 및 패치 클램프 전기 생리학에 대한 거대한 리포좀 준비

전기 주조, 젤 이용한 붓기 - 거대한 단일 층 소포 (GUVs)에 횡단 단백질, KvAP의 재구성은 두 탈수 수분 보충 방법에 대한 설명된다. 두 방법 모두에서, 상기 단백질을 포함하는 작은 소포 단층이어서 형광 현미경 및 패치 클램프 전기 생리학에 의해 연구 할 수 GUVs을 형성하기 위하여 함께 융합된다.

횡단 단백질의 재구성, 현미경 및 패치 클램프 연구 거대한 단일 층 소포에 전압 게이트 이온 채널, KvAP,

여기서 설명하는 낭포 성 섬유증에 결함이 클로라이드 채널에 대한 활성을 유지 정제 야생형 및 돌연변이 CFTR 단백질의 기능적 재구성을위한 신속하고 효율적인 절차이다. CFTR 의해 매개 재구성 테오에서 요오드화 유출 채널 활성의 연구 및 작은 분자의 효과를 허용한다.

정제 된 야생형과 돌연변이 체 CFTR 단백질의 기능의 재구성 및 채널 활동 측정

이 문서에는 분 광 분석에 대 한 세제 solubilized TRPV1의 생 화 확 적인 수량을 얻기 위해 특정 방법을 설명 합니다. 결합 된 프로토콜 막 제어 환경에서 포유류 이온 채널에 대 한 구조 및 기능 연구를 촉진 하기 위하여 적응 시킬 수 있다 생 화 확 및 생물 도구를 제공 합니다.

정화 및 분 광 분석에 대 한 TRPV1의 재구성

이 프로토콜 cryo 전자 현미경 검사 법, 효율적으로 최소한의 노력 및 독성, 단백질 추출, 정화, 포유류 세포에 있는 유전자를 표현 하는 데 사용 되는 잠재 시스템을 포함 하 여 이온 채널 구조를 결정 하는 데 사용 하는 기법을 설명 합니다. 그리고 품질 검사, 샘플 그리드 준비 및 심사, 뿐만 아니라 데이터 수집 및 처리.

식 및 단일 입자 Cryo 전자 현미경 검사 법에 의하여 구조 결심에 대 한 인간의 지질 민감한 양이온 채널 TRPC3의 정화

이 원고에서는 F-actin 세포 골격을 거대한 unilamellar 지질 소포 (리포솜이라고도 함)로 캡슐화하는 실험 기술과 리포솜 막의 내부 전단지에 피질 생모방 F- 액틴 층을 형성하는 방법을 보여줍니다.

체외 거대한 Unilamellar 소포 내부의 Actin Cytoskeleton 재구성

무세포 재구성은 세포 골격 어셈블리를 이해하는 핵심 도구였으며, 지난 십 년 동안의 연구는 최소한의 시스템에서 셉틴 역학을 연구하는 접근법을 확립했습니다. 여기에 제시된 것은 서로 다른 막 맥락에서 셉틴 어셈블리를 관찰하는 세 가지 보완적인 방법입니다 : 평면 이중층, 구형 지지대 및 막대 지지대.

생체 물리학 적 특성과 기능을 연구하기 위해 멤브레인에서 Septin 어셈블리의 재구성

본는 lipidic mesophases 수동으로 막 단백질의 결정화 실험을 설정 캐퍼리 막 구조 및 기능 생물학 그룹의 구현 절차를 설명합니다.

Lipidic Mesophases를 사용하여 구조 결정을위한 막 단백질 Crystallizing

주문한 막 단백질 배열의 형성을위한 2 차원 (2D) 결정화 실험을 평가하는 것은 전자 crystallography에 매우 중요하고 어려운 작업입니다. 90kDa - 여기에 대한 심사와 15의 범위에서 주로 작은 막 단백질의 2D 결정을 식별하는 우리의 접근 방식을 설명합니다.

전자 Crystallography에 의해 구조 생물학 연구에 대한 작은 막 단백질의 2 차원 결정화 평가판을 평가

우리는 이온 채널의 기능에 대한 단일 지점에서 돌연변이의 효과를 연구하는 방법을 보여줍니다 것입니다.

이온 채널의 돌연변이 유발과 기능 분석 Heterologously 포유 동물 세포에 표현

배우세요 지질 이중막에 전압 개통 칼륨 채널을 재구성하여 이온 채널 기능과 구조를 연구하는 방법을. 전기생리학 기록과 전자결정학 분석이 가능합니다.

구조 및 기능 연구를위한 지질 막에 Kv 값 채널의 재구성

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