Name: 비주얼 결함의 특성을 만성 안구 고혈압의 레이저 유도 마우스 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: 학습하세요 레이저 광응고술을 이용한 마우스 만성 안구 고혈압 유도 모델링 방법을. 각막내압 측정과 옵토모터 검사를 통해 시력 변화를 평가하고 안과 질환 연구에 활용하세요.

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이 문서에 포함 된 작품은 미국의 건강 보조 재단 (XL), 실명을 방지하기 위해 연구에서 윌리엄 &amp; 메리 그레베 특별 장학생 수상 (XL)에서 녹내장 연구 박사 더글러스 H. 존슨 수상에 의해 지원되었다 실명 예방 일리노이 학회 (HC)와 NIH 부여 R01EY019034 (XL).

절차 C57BL/6J 마우스 (잭슨 연구소, 바 하버, 메인)은 노스 웨스턴 대학교의 동물 관리 시설에서 발생합니다. 모든 동물은 노스 웨스턴 대학 기관 애니멀 케어 및 사용위원회와 NIH에서 신경 과학 연구에서 동물의 사용에 대한 지침을 따른다 승인 프로토콜에 따라 사용됩니다. 1. 레이저 광응고술 레이저 광응고술의 절차는 5-7 이전에 발행 된 프로토콜에서 수정됩니다. <ol><li> 케타민 (100 ㎎ / ㎏, 버틀러 Schein의 동물 건강, OH)과 xylazine (아이오와, 셰넌 도어의 10 ㎎ / ㎏, 로이드 주식, IA)의 복강 주사로 40 ~ 60 일 이전 마우스를 마취. </li><li> 1 % 아트로핀 황산염 솔루션의 하나 또는 두 방울 (알콘 연구소, 주식 회사, 포트 워스, 텍사스)와 국소 치료로 실험 동물의 오른쪽 눈의 동공을 팽창. </li><li> 산동 후, 평평하게nterior 챔버 레이저 유도는 6 강화한다. 전방 액을 배출 슬릿 램프 아래 전방 공간 (SL-3E, 탑콘, 오클랜드, NJ)에 예리한 끝 (세계 정밀 계측기 Inc의 새러 소타, 플로리다)와 유리 마이크로 피펫을 삽입합니다. </li><li> 플라스틱 콘 홀더 (브레인 과학 주식 회사, MA)에 마우스를 억제하고 (그림 1A 참조) 만든 플랫폼에 묶여. 고정 장치와 마우스를 잡고 슬릿 램프 뒤에 광원 마우스의 오른쪽 눈을 노출합니다. 슬릿 램프에서 마취 마우스의 오른쪽 눈을 맞 춥니 다. </li><li> 두 손으로 마우스 고정 장치를 잡고있는 동안, 아르곤 레이저 (울티마 2000SE, 일관된, 산타 클라라, CA)를 사용하여 각막 윤부에 레이저 조명을 적용합니다. 수직 섬유주의 둘레 80-100 레이저 반점 (514 nm의, 100 mW의 50 밀리 초 펄스, 200 μm의 지점)에 대해 제공합니다. C57BL / 6 마​​우스는 P에 대한 장벽 역할을 색칠 조리개를 가지고otential 길잃은 에너지 7. </li><li> 주입 국소 0.5 % 목시 플록 사신 (알콘 연구소, 주식 회사, 포트 워스, 텍사스) 레이저 치료 부위와 0.5 %가 Proparacaine이 (바슈롬, 로체스터, NY) 통증을 완화하는 소독하는 안구 표면에.에게 </li><li> 완전히 깨어 때까지 약 1 시간 동안 복구를 위해 가열 패드 (태양열 제품 Inc, 보카 레이 톤, 플로리다)에 동물을 유지합니다. </li><li> 왼쪽 눈은 대조군으로 봉사하는 치료입니다. </li></ol> 2. 안압 측정 <ol><li> 플라스틱 콘 홀더에로드 한 다음 (그림 2A 참조) 플랫폼을 억제하는 튜브에 깨어 마우스를 놓습니다. </li><li> 시간을 5 분 내지는 10 분 마우스 홀더의 위치에 적응하자 할 수 있습니다. 프로브 팁이 떨어져 각막 (14)의 표면 2~3밀리미터 때까지 마우스 눈 리바운드 안압계 (TonoLab, 콜로니얼 의료 공급, 프란 코니아, 뉴햄프셔) 접근. </li><li> 프로브 팁의 중심 표면을 칠 수 있도록 측정 버튼을 눌러부드럽게의 각막. 같은 눈의 안압 여섯 측정 연속 3 세트 취득하고 눈의 안압으로 평균입니다. 치료 컨트롤의 눈은 항상 다음 측정 레이저 치료 눈을위한 기준 수치를 얻기 위해 먼저 측정됩니다. </li></ol> 3. Optomotor 테스트 시력 및 대비 감도는 14,15을 테스트합니다. 개인 마우스의 두 눈 표류 격자의 방향을 반대로하여 개별적으로 검토되며, 시계 방향으로 표류 격자가 왼쪽 눈과 오른쪽 눈 16 반 시계 방향으로 표류 격자의 시각적 기능을 식별하는 데 사용됩니다 즉. 각 테스트는 약 15 분 정도 소요 독립적으로 두 관찰자에 의해 반복됩니다. <ol><li> 마우스를 놓고 마우스가 네 개의 컴퓨터 모니터 (그림 3A-B)으로 둘러싸인 높은 플랫폼에서 자유롭게 이동할 수 있습니다. </li><li> 그들은 수평 사인 표류 표시되는 있도록 모니터를 설정39 CD / 평방 미터의 평균 휘도 시각적 자극으로 격자. 격자의 이동 방향은 교대로한다 연속적 사이에 시계 방향 및 반 시계 방향으로. </li><li> 동물의 움직임을 분석합니다. 시각적 인 자극에 다음 점차적으로 증가 후 표류 격자와 함께 콘서트에서 동물의 움직임을 15 초 내에 &quot;긍정적&quot;으로 간주됩니다. 가장 높은 응답-이끌어내는 시각적 자극은 동물의 시력이 17로 정의됩니다. </li><li> 0.075, 0.16, 및 학위 당 0.3 회 (CPD) : 세 개의 미리 설정된 공간 주파수에서 대비 감도를 검사합니다. 각각의 눈에 대한 대비 임계 값은 미리 고정 주파수에서 시각적 인 반응을 이끌어 낮은 대비로 정의됩니다. 대비 감도는 임계 값 17의 역수이다. </li></ol>

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<li>Cone, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+anesthesia%2C+mouse+strain+and+age+on+intraocular+pressure+and+an+improved+murine+model+of+experimental+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The effects of anesthesia, mouse strain and age on intraocular pressure and an improved murine model of experimental glaucoma.</a> Experimental Eye Research. 99, 27-35 (2012).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-derived+neurotrophic+factor+and+TrkB+modulate+visual+experience-dependent+refinement+of+neuronal+pathways+in+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Brain-derived neurotrophic factor and TrkB modulate visual experience-dependent refinement of neuronal pathways in retina.</a> J. Neurosci. 27, 7256-7267 (2007).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+neonatal+development+of+retinal+ganglion+cell+dendrites+by+neurotrophin-3+overexpression%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Regulation of neonatal development of retinal ganglion cell dendrites by neurotrophin-3 overexpression.</a> The Journal of Comparative Neurology. 514, 449-458 (2009).</li>
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</ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다. 저자는 노스 웨스턴 대학의 풀 타임 직원입니다. 저자는이 문서에 사용 된 시약 및 장비를 생산하는 업체가 제공 한 어떠한 자금을받지 않았다.

우리가 지속적인 안압 위의 보고서는 마우스 눈에서 레이저 조명에 의해 유도 될 수있다. 식염수 주입 모델 18 정맥 소작 모델 광범위한 미세 기술을 필요로 둘 다 11에 비해, 레이저 조명 수행 할 비교적 간단하고 쉽습니다. 보통 우리는 2-3 시간에서 4-6 생쥐 레이저 조명을 수행 할 수 있습니다. 지속적인 안압 상승을 달성하기 위해 중요한 단계 레이저 조명 레이저 매개 변수 앞에 납작 전방이다. 섬유주 영역에 레이저를 대상으로 근처 모양체 혈관 6 부상을 최소화하기 위해 촉진 전방 액을 배출. 레이저의 종류도보고되고있다, 예를 들어, 일부 연구는 각막 등록에 섬유주 및 상공 막 정맥을 대상으로 810 nm의 에너지 펄스 7를 사용하여 532 nm의 5,6과 다른 파장의 다이오드 레이저를 사용하여이온. 각 피해를 극대화하기 위해, 우리는 5-7 이전에보고 된 레이저 모델에 비해 레이저 반점의 수를 증가하고있...

<table><tbody><tr><td colspan="4">시약</td></tr><tr><td>moxifloxacin</td><td>Alcon Labs, Inc.</td><td>NDC 0065-4013-03</td><td>0.5 %, Rx 전용</td></tr><tr><td>Proparacaine Hydrochloride</td><td>Bausch Lomb</td><td>NDC 24208-730-06</td><td>0.5 %, Rx 전용</td></tr><tr><td>안과 용액 USP</td><td>Bausch Lomb</td><td>NDC 24208-730-06.5</td> <td>%, Rx 전용</td></tr><tr><td>케타민</td><td>Butler Schein Animal Health</td><td>NDC 11695-0550-1</td><td>100 mg / kg </td></tr><tr>아이오와 <td>NADA 139-236</td><td>10 mg / kg</td><td></td><td></td></tr><tr><td>의 자일라진 LLOYD Inc.아트로핀 황산염 솔루션</td><td>Alcon Labs, Inc.</td><td>NDC 61314-303-02</td><td>1 %, Rx 전용</td></tr><tr><td colspan="4">장비 </td></tr><tr><td>Slit Lamp, TOPCON </td><td>Visual Systems Inc</td><td>SL-3E</td><td>powered by PS-30A</td></tr><tr><td>OptoMotry 1.8.0 virtual</td><td>CerebralMechanics Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>광역학 테스트 시스템</td><td>CerebralMechanics Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tonometer, TonoLab, 마우스 용</td><td>Colonial Medical Supply</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heating pad</td><td>Sunbeam Products Inc</td><td>722-810</td><td></td></tr><tr><td>Argon laser </td><td>Coherent Inc</td><td>Ultima 2000SE</td><td></td></tr><tr><td>DECAPICONE 플라스틱 콘 홀더 </td><td>Braintree Sci Inc.</td><td>마우스용</td> <td>MDC-200</td></tr></tbody></table>

비주얼 결함의 특성을 만성 안구 고혈압의 레이저 유도 마우스 모델

A Laser-induced Mouse Model of Chronic Ocular Hypertension to Characterize Visual Defects

자주 높은 안압 (IOP)와 관련된 녹내장은 실명의 주요 원인 중 하나입니다. 우리는 인간의 높은 안압 녹내장을 모방하는 안구 고혈압의 마우스 모델을 구축하기 위해 노력했다. 여기에 레이저 조명은 각 폐쇄를 유도 수성 유출 photocoagulate하기 위해 각막 윤부에 적용됩니다. IOP의 변화는 레이저 치료 전후 리바운드 안압계를 사용하여 모니터링 할 수 있습니다. optomotor 행동 테스트는 Visual 용량의 해당 변화를 측정하는 데 사용됩니다. 레이저 조명 후 지속적인 안압 상승을 개발 한 마우스에서 대표적인 결과가 표시됩니다. 시력 저하 및 대비 감도는이 안구 고혈압 쥐에서 관찰된다. 함께, 우리의 연구는 녹내장 쥐에서 신경 세포의 변성 및 기본 분자 메커니즘을 조사하기 위해 중요한 모델 시스템을 소개합니다.

절차에서 설명한대로, 레이저 조명은 폐쇄 각 (그림 1)을 유도, 수성 유출 photocoagulate하는 각막 윤부 지역에서 섬유주위한 것입니다. 대부분의 레이저로 눈 앞의 연구 결과 6 일치 유의 물리적 손상, 색소 분리 또는 감염을 전시하지 않습니다. 쥐의 작은 그룹 (모든 레이저로 동물의 5 % 미만)은 수축 눈 공, 심한 백내장, 중요한 색소 분리, 또는 출혈 등 심각한 손상의 물리적 흔적을 전시 할 때, 우리는 즉시 그들에게 안락사. 레이저로 눈의 약 30 %는 사소한 각막 흉터를 개발, 대부분는 1-2 주 레이저 치료 후 내 회복. 우리는 이상의 백 쥐에서 거의 모든 레이저 치료 눈 높은 안압을 발견했다. 실험 동물의 IOP는 리바운드 안압계 (그림 2)를 사용하여 모니터링합니다. 그림 2B는 I의 변화의 한 예를 보여줍니다레이저 치료 전후 OP. 15....

만성 안구 고혈압 쥐의 눈 섬유주 레이저 광응고술을 사용하여 유도된다. 안압 (IOP)는 레이저 치료 후 몇 개월 동안 상승합니다. 시력 실험 동물의 대비 감도의 감소는 optomotor 테스트를 사용하여 모니터링 할 수 있습니다.

Glaucoma, frequently associated with elevated intraocular pressure (IOP), is one of the leading causes of blindness. We sought to establish a mouse model ...

본 절차의 전반적인 목표는 마우스 크기에서 섬유주(trabecular meshwork)의 레이저 광응고술을 통해 만성적 안압 상승을 유도하는 것입니다. 마우스를 마취시킨 후, 대상 안구의 동공을 확장시키고 전방(anterior chamber)을 평평하게 만듭니다. 두 번째 단계는 섬유주 원주를 따라 표면에 수직으로 레이저 빔을 조사하여 안압 상승을 유도하는 것입니다.다음으로, 토노미터를 사용하여 마우스의 안압을 시간에 따라 추적합니다. 마지막 단계는 시력의 변화를 보여주기 위해 자동화 테스트를 수행하는 것입니다. 궁극적으로, 고혈압으로 인해 발생한 시각적 결함을 시간에 따라 모니터링할 수 있습니다.승인된 I-A-C-U-C 프로토콜을 확보한 후, 케타민과 자일라진을 복강 내 주사하여 40~60일 된 C 57 black six 마우스를 마취시킵니다. 다음으로 왼쪽 대조군 눈에 안연고를 조심스럽게 도포하고, 1% atropine sulfate 용액 한두 방울을 국소 처리하여 오른쪽 눈의 동공을 확장시킵니다. 동공이 완전히 확장되면, 날카로운 유리 마이크로 피펫을 눈의 전방에 삽입하여 전방 내의 액체를 배출시킵니다.이렇게 하면 전방이 평평해지고 레이저 유도가 강화됩니다. 그런 다음 마우스를 세극등 아래에 배치하고, 플라스틱 원뿔형 홀더에 마우스를 고정한 뒤 자체 제작한 플랫폼 위에 고정합니다. 다음으로, 파장을 514 nanometers, 출력을 100 milliwatts, 펄스 길이를 50 milliseconds, 스팟 크기를 200 micrometers로 설정하여 Argonne 레이저 광원을 준비합니다.레이저 준비가 완료되면, 보정기로 마우스를 고정하고 슬릿 램프 뒤에 있는 광원에 마우스의 오른쪽 눈을 노출시켜 레이저를 정렬합니다. 그런 다음 각막 주변부에 레이저 조사를 실시하며, 아르곤 레이저를 사용하여 섬유주 원주를 따라 수직으로 80~100개의 레이저 스폿을 조사합니다. 검은색 마우스 6마리(57번 참고)를 확인하십시오.잠재적인 산란 에너지를 차단하는 장벽 역할을 하는 색소성 홍채를 가진 개체를 준비합니다. 시술 후, 레이저 처리 부위를 소독하기 위해 안구 표면에 0.5%moxifloxacin을 점안하고, 통증 완화를 위해 0.5%propane을 점안합니다. 동물이 완전히 깰 때까지 약 한 시간 동안 가열 패드 위에 두어 회복시킵니다.깨어 있는 마우스를 튜브에 넣은 다음 플라스틱 원추형 홀더에 장착하십시오. 이어서 플랫폼 위에 마우스를 고정합니다. 마우스를 과하게 고정하면 안압 측정값이 인위적으로 높게 나타날 수 있으므로 주의하십시오.마우스가 홀더 위치에 적응할 수 있도록 5분에서 10분 정도 기다립니다. 그다음, 프로브 팁이 각막 표면에서 2~3mm 거리까지 가까워질 때까지 리바운드 크로노미터를 제어안 쪽으로 천천히 접근시킵니다. 다음에 측정할 레이저 처리안의 기준값을 얻기 위해, 항상 처리하지 않은 대조안을 먼저 측정합니다.리바운드 크로노미터(rebound chronometer)를 제자리에 위치시킨 후, 측정 버튼을 눌러 프로브 팁이 각막의 중심 표면을 가볍게 치도록 합니다. 동일한 눈의 안압을 6회씩 3회 연속으로 측정합니다. 이후 각 안구 검사에 대해 이 측정값들의 평균을 구하고, 모터 테스트를 사용하여 시력과 대비 감도를 측정합니다.이는 우선 마우스를 4대의 컴퓨터 모니터로 둘러싸인 높은 플랫폼 위에 올려두고 자유롭게 움직이게 함으로써 수행됩니다. 검안 장치의 모니터가 39 canula per meter squared의 평균 휘도를 가진 수평으로 표류하는 사인파 격자를 시각 자극으로 표시하도록 설정하십시오. 격자의 이동 방향은 시계 방향과 반시계 방향으로 연속적으로 교차되어야 합니다.테스트 중에 마우스 상단에 배치된 카메라를 사용하여 마우스의 움직임을 기록하십시오. 시계 방향으로 이동하는 격자를 사용하여 왼쪽 눈의 시각 기능을 확인하고, 반시계 방향으로 이동하는 격자를 사용하여 오른쪽 눈의 시각 기능을 확인하십시오.각 테스트는 약 15분 정도 소요되며, 두 명의 관찰자가 독립적으로 반복 수행합니다. 표류 등급과 일치하는 움직임을 양성 움직임으로 간주하여 측정합니다. 시작 후 15초 이내에 반응이 나타나지 않는 경우, 시각적 자극을 증가시켜 반응을 유도하는 가장 높은 시각적 자극 수치를 동물의 시력으로 정의합니다. 다음으로, 미리 선정된 세 가지 공간 주파수에서 각 동물의 대비 민감도를 검사하며, 고정된 주파수에서 시각적 반응을 유도하는 가장 낮은 대비 수치를 각 눈의 대비 임계값으로 정의합니다.레이저 치료를 받은 거의 모든 안구에서 안압이 상승하는 경향을 보였습니다. 하지만 안구 함몰, 심한 백내장, 상당한 색소 침착, 박리 또는 출혈과 같은 심각한 손상의 신체적 징후를 보인 마우스는 5% 미만이었습니다. 안압 변화의 한 예가 여기에 제시되어 있습니다.레이저 처리 1주일 후. 처리된 눈의 안압은 처리되지 않은 눈보다 거의 두 배 높았으며 약 16주 동안 상승된 상태를 유지했습니다. 이후 상승된 압력은 거의 정상 수치로 돌아왔습니다.약 20주경에 처치된 안구에서 시력 저하가 발생하였습니다. 이는 처치 이후에 나타났습니다. 이러한 현상은 최소 6개월 동안 지속되었으며, 안압 상승 기간보다 더 오래 지속되었습니다.마찬가지로, 안압이 상승한 처리군의 안구에서 더 낮은 대비 감도가 관찰되었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

녹내장은 세계에서 실명의 주요 원인 중 하나입니다. 고가 intraocular 압력은 큰 위험 요소입니다. 레이저 photocoagulation 유도 안구 고혈압은 물론 기존 동물 모델 중 하나입니다. 이 동영상은 쥐에서 아르곤 레이저 photocoagulation에 의해 안구 고혈압을 유발하는 방법을 보여줍니다.

SD 쥐에서 레이저 유도 만성 안구 고혈압 모델

출처: Lani-Louzada, R., et al., 설치류의 외과적 유도 녹내장에 대한 변지 혈관신경총의 전원형 소작. J. Vis. Exp. (2022)이 비디오는 쥐 모델에서 상승된 안압(IOP)의 유도 및 모니터링을 보여줍니다. 이 과정에는 변부 혈관을 소작하는 것이 포함되며, 그 결과 혈관 폐색과 안압 상승이 발생합니다. 그런 다음 쥐가 회복되도록 하고 IOP는 비교를 위해 실험 눈과 대조 눈 모두에서 정기적으로 모니터링됩니다.

 쥐 모델에서 상승된 안압 유도

여기에서는 신생혈관 연령 관련 황반변성(AMD)의 혈관 특징을 재현하는 실험 모델인 마우스 레이저 유도 맥락막 신생혈관화(CNV) 프로토콜을 제시합니다. 일단 마스터하면 다양한 실험 측정을 테스트하기 위한 모델 시스템으로 CNV를 안정적이고 효과적으로 유도할 수 있습니다.

레이저에 의한 맥락막 신생 혈관에 대한 마우스 모델

여기서는 관찰 녹내장, 망막 신경절 세포의 손실을 초래 쥐 눈 안압을 유도 프로토콜을 제시한다. 자기 마이크로 비드는 전방에 주입과 방수의 유출을 차단하는 자석을 이용하여 홍채 각막 각도에 매료된다.

자기 마이크로 비드 폐색 모델 마우스의 녹내장 안구 고혈압 종속 유도합니다

여기, 선물이 쥐에서 안 neovascularization 레이저 유도의 형태학 변화의 후속에서 경도 vivo에서 화상의 유용성.

Vivo에서 복합 이미징 및 마우스 레이저 유도 안 Neovascularization 모델의 분석

만성 안구 고혈압 쥐와 쥐, 일치 녹 내장 망막 신경 절 세포의 기능 및 구조 저하로 이어지는 circumlimbal 봉합을 적용 하 여 유도 된다.

쥐와 쥐에 Circumlimbal 봉합에 의해 유도 된 녹 내장의 모델

여기에서는 망막 변성, 녹내장, 당뇨병 성 망막증 및 근시 모델에서 생체 내 망막 및 안구 구조를 시각화하기 위해 스펙트럼 도메인 광학 간섭 단층 촬영 (SD-OCT)을 사용하는 방법을 설명합니다.

광학 간섭 단층 촬영을 사용한 설치류 모델에서 안구 질환의 생체 내 구조 평가

여기에서는 장미 벵골을 사용한 망막 정맥 폐색에 최적화된 프로토콜과 유전자 변형 균주에서 재현성을 극대화하기 위한 권장 사항과 함께 레이저 유도 망막 영상 현미경 시스템에 대해 설명합니다.

가변성을 제한하기 위한 망막 정맥 폐색 마우스 모델의 최적화

여기에서는 마우스에서 망막병증의 진단 및 정량적 측정을 용이하게 하기 위해 광학 간섭 단층 촬영을 사용하는 생체 내 이미징 기술에 대해 설명합니다.

망막병증의 마우스 모델에 대한 광학 간섭 단층 촬영의 적용

이 프로토콜의 목표는 아급성 안구 고혈압을 유발하는 변연 혈관 신경총의 360° 열 소작을 기반으로 하는 녹내장 신경 퇴행의 새로운 모델을 특성화하는 것입니다.

설치류의 외과적으로 유도된 녹내장에 대한 Limbal Vascular Plexus의 전체 원형 소작

학습하세요 레이저 광응고술을 이용한 마우스 만성 안구 고혈압 유도 모델링 방법을. 각막내압 측정과 옵토모터 검사를 통해 시력 변화를 평가하고 안과 질환 연구에 활용하세요.

비주얼 결함의 특성을 만성 안구 고혈압의 레이저 유도 마우스 모델

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