Name: 적외선 신경 자극의 메커니즘을 조사하는 전체 세포 패치 클램프 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: 배우세요 전체 세포 패치 클램프를 이용해 적외선 레이저 자극이 청각 신경 세포에 미치는 영향을 연구하는 방법을. 이 기술은 신경 생리학 및 청각 치료 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 연계 프로젝트 부여 LP120100264 아래의 호주 연구위원회에 의해 지원되었다.

1. 나선 신경절 신경 세포의 배양 <ol><li> 오토 클레이브의 작은 원형 (예를 들어 10mm 직경) 유리 coverslips는과 곡선 집게를 소독. 소독 집게를 사용하여 멸균 4-링 35mm 페트리 접시 또는 4 - 웰 플레이트의 각 우물에 살균 coverslips를 전송합니다. 최대 48 시간에 대한 배양기에서 coverslip을과 장소의 표면 (37 ° C)에 폴리-L-오르니 틴 (500 ㎍ / ㎖) 및 마우스 라미닌 (0.01 밀리그램 / ML) 150 μl를 적용합니다. coverslips를이 우물의 바닥에서 멀리 떠하지 않도록 확인하십시오. </li><li> 47.5 ML neurobasal, 0.5 ML N 2 보충, 1 ML B27 보충제, 0.5 ML의 L-글루타민, 0.5 ML 페니실린 - 스트렙토 마이신 : 각 신경의 문화에 대한 50 ML 멸균 Neurobasal 미디어 (NBM)를 준비합니다. 참고 : 보조 식품을 냉동 할 수 -20 ° C에 저장하고 필요한 날에 미디어에 추가됩니다. </li><li> 이전에 20,21 설명 된대로 출생 후 하루 4-7 쥐 새끼에서 나선 신경절 신경 세포를 떼어 놓다, 우리효소 (0.025 % 트립신 0.001 % DNase의 I) 및 기계 기술을 모두 ING. Whitlon 등. 22 비에이라 등. 23을 참조 modiolus 격리 시위 나선 신경절 신경 세포의 문화 나 파커 등. 24 자세한 절차. </li><li> coverslips는 남아있는 모든 poly-L-ornithine/laminin 솔루션을 기음과 NBM과 함께 간단히 씻는다. </li><li> 인큐베이터 (37 ° C, 10 % CO 2)에 coverslips를 제자리에 해리 나선 신경절 신경 세포 현탁액 150 ~ 200 μl를 추가합니다. 참고 : 최대 20의 coverslips는 8 쥐 새끼의 평균 쓰레기에서 준비 할 수 있습니다. </li><li> 네 시간 도금 뉴런 후, 세포 파편을 제거하고 150 ~ 200 ㎕의 예열 신선한 NBM으로 대체 할 솔루션을 대기음. 참고 : 미디어 탈수를 방지하기 위해 매일 보충이 필요할 수 있습니다. </li><li> 전기 생리학 녹음에 필요한 때까지 배양기에 coverslips를 반환합니다. 참고 : 해리 나선형신경절 신경 세포 배양 사시간 분리 후 이후 최대 두 개의 일을위한 전기 생리학 실험에 사용할 수 있습니다. 생체 시간은 결과의 분석에서 고려되어야한다. 모든 24-48 시간을 NBM 보충. </li></ol> 2. 패치 클램프 녹음을위한 준비 <ol><li> 솔루션을 준비 <ol><li> 세포 (마이크로 피펫) 해결책 : 115 mM의 K-글루코 네이트, 7 mM의 KCl을, 10 MM의 HEPES, 0.05 mM의 EGTA, 2 개 mm 나 2 ATP, MgATP 2 밀리미터, 0.5 밀리미터 나 2 GTP (KOH로 pH를 7.3로 조정, 295 조정 자당과 mOsmol 원 / kg). 살균 필터 (0.2 μm의)를 통해 솔루션을 전달하고 기록의 날까지 -20 ° C에 저장할 수 200 μL의 aliquots로 나눕니다. </li><li> 세포 (목욕) 해결책 : 137 mM의 NaCl을 5 mM의 KCl을, 2 MM의 염화칼슘 2, 1 mM의 MgCl 2, 10 MM의 HEPES, 10 mM의 포도당 (수산화 나트륨으로 pH를 7.4로 조정, 자당과 300-310 mOsmol / kg의 조정) . 이 솔루션은 기록의 날에 이루어집니다. </li></ol></li><li> MΩ 2-6의 저항을 녹음 마이크로 피펫을 준비합니다. 와 붕규산 유리 (1.0 mm 외경, 0.58 mm 내경, 75mm 길이), 우리는 CO 2 레이저 풀러 (서터 악기 P-2000)을 사용합니다. </li><li> 레이저를 준비합니다. 이 프로토콜은 OptoTech P / L.에서 같은 1,870 nm의 적외선 신경 자극 등의 섬유 결합 레이저와 함께 사용하기위한 것입니다 우리의 실험에서 빛 전달에 사용되는 광섬유 양단에 수치 0.22의 조리개와 FC​​-PC 커넥터와 220분의 200 μm의 코어 / 클래딩 직경의 실리카 섬유 (AFW 기술 MM1-FC2-200/220-5-C -0.22). 패치 코드는 두 개의 광섬유 떠꺼머리 (즉, 한 쪽 끝에서 커넥터 처리 및 기타에 죽습) 생산 반으로 잘라되었다. 섬유 중핵 직경과 레이저 유도 온도 변화에 개구의 효과는 톰슨 등으로 자세하게 설명되어있다. 25 <ol><li> 베기 표준 기술을 사용하여 빛을 전달 섬유의 끝그리고 그 결과로 끝이 광학 현미경 (즉, 끝이 섬유 축에 수직 및 육안 검사에 평평하게 나타납니다)과 관찰 고품질 있는지 확인합니다. 커넥터 (예 : THORLABS ADAFC2)를 통해 적절한 사용하여 자극 레이저 섬유 커플 링 출력에 빛을 전달 섬유를 연결합니다. </li><li> 적절한 악기 (LM-3 검출기 머리 예를 들어, 일관된 FieldMate)를 사용하여 빛을 전달 섬유의 절단 된 끝에서 출력 레이저 파워를 측정한다. 그것은 레이저 전원에게 빛을 ​​전달 섬유 쪼개거나 중요한 조정 (예를 들어, 하나의 실험실에서 다른 교통 수단) 레이저로 만든 때마다 확인하는 것이 좋습니다. </li><li> 섬유 척 또는 이와 동등한 장치 부착 적절한 micropositioner에 척으로 빛을 전달 섬유를 삽입합니다. 그것은 정확하게 광섬유 coverslip을 함께 만드는 θ 각도를 결정하는 것이 중요하다. 이 ANGLE는 실험 배치의 사진을 촬영 각도를 얻기 위해 이미지 처리 소프트웨어 (예를 들어 ImageJ에)를 사용하여 측정 할 수 있습니다. 특히 현미경 - 각도 θ (또는 가능한 각도 범위)는 기본적으로 실험 배치의 공간적 한계에 의해 제한됩니다. 우리의 실험에서 θ의 전형적인 값 (직립 현미경에 따라) 36 °의 주위에, 그러나 최적의 각도 (거꾸로 현미경을 사용하는 예를 들어) 다른 설정에 대해 상당히 다를 수 있습니다. </li><li> 레이저와 그림 2와 같이 패치 클램프 데이터 수집 시스템 (예 : Digidata 1440A, 분자 장치) 사이의 연결을 확인합니다. 패치 클램프 데이터 수집 시스템에서 디지털 출력이 가능한 데이터 수집 시스템의 독립적 인 레이저 펄스 매개 변수를 지정하고, 외부 함수 발생기를 통해 레이저에 연결해야합니다. 또는이 출력에 직접 연결할 수 있습니다레이저 드라이버 (펄스 길이와 반복 속도는 데이터 수집 소프트웨어에 의해 설정 될 필요). 어느 경우 레이저를 트리거하는 데 사용되는 신호는 레이저 펄스의 타이밍과 길이는 전기 생리학 신호를 동시에 기록 할 수 있도록 데이터 수집 시스템의 입력으로 연결되어야합니다. </li></ol></li></ol> 3. INS의 조사를위한 패치 클램프 녹음 <ol><li> 세포 용액으로 관류 시스템의 적절한 컨테이​​너를 채우고 1-2 ML / 분의 속도로 목욕 관류를 제공하기 위해 유량을 조정합니다. 우리는 솔루션의 신속한 가열 및 흡입에 의해 소비 용액을 제거하기 위해 연동 펌프를 사용하려면 인라인 히터 중력 공급 시스템 (흡인기 병, 핀치 밸브 및 PE 튜브)를 사용합니다. </li><li> 직립 현미경의 기록 챔버 (화장실)에 배양 세포로 coverslip을 배치합니다. 높은 배율 물 침지 목표 (E 사용40X. g.) 및 위상 대비 (예를 들어, 미분 간섭 대비 또는 Dodt 그라데이션 대비), 시각 문화 내에서 나선 신경절 뉴런을 찾습니다. 그림 1a와 같이 전형적인 나선 신경절 신경 세포는 저명한 핵을 가진 직경 위상 밝고, 둥근 약 15 μm의 수 있습니다. </li><li> 신경 세포가 위치되면, 낮은 배율 목표 (예를 들어, 10X)로 전환 시야 내의 표적 신경 세포를 찾습니다. </li><li> 다음 절차를 (또는 이에 상응하는)를 사용하여 위치에 빛을 전달 광섬유로 이동 : <ol><li> 끝이 수평 및 수직 평면 모두에서 대상 뉴런에 가까운 때까지 출력 섬유를 이동하는 micropositioner를 사용합니다. 섬유 끝의 수직 위치는 목표를 위아래로 이동 (포커스를 스캐닝)하여 확인할 수 있습니다. </li><li> 높은 배율의 목표로 전환하고 t 옆에 의도 한 위치에 광섬유의 끝 위치그는 신경 세포 (그림 2 그림 참조). 섬유의 수직 위치를 조정하면, 섬유의 아래쪽 가장자리는 섬유의 위치에 불확실성을 최소화하기 위해 coverslip을 (즉, 그냥 터치)에 휴식하는 것이 중요합니다. 수평면에서 최적의 정렬은 섬유가 coverslip에와 섬유 R의 반경 만드는 θ 각도에 따라 달라집니다. 대상 신경 세포의 중심이 섬유 축 방향으로 놓 이도록 섬유를 배치하기 위해, 섬유의 상부 가장자리와 대상 셀 사이의 수평 거리가 있어야한다 Δ 대상 = R (cosec θ - 2 죄 θ) 음의 값을 나타냅니다 곳 광섬유 돌출 셀. 섬유를 정렬 할 때, 섬유의 위쪽 가장자리와 신경 세포의 중심 사이의 Δ 대상의 거리가 약 육안 검사에 의해 달성 될 수있다. 그러나 Δ 대상은하도록 설계단지 일반적인 지침 역할을합니다. 섬유의 상부 가장자리와 신경 세포의 중심 사이의 실제 거리 Δ는 Δ 대상 (그림 1에서와 같이)에서 잴 다릅니다 같은 섬유를 배치하여 중앙에서 모두 반경 변위 (즉, 효과에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다 대상 신경 세포에 비해 빔의 빔)과 축 변위 (섬유 축 방향 즉,). 전형적인 멀티 모드 섬유를위한 빔 프로파일을 잘 모자 분포 26, 로컬 흡수 에너지 (온도)의 감소에 의해 근사하기 때문에 즉 - 예를 들어, Δ 설정 ≈ 0은 셀의 주변에있는 지역의 온도가 증가 할 것으로 예상된다 빔의 중심에서 변위로 인해 가까운 셀 섬유의 단면을 움직이는 흡수 에너지의 증가에 비해 최소화됩니다. 주의가 정확하게 그리고 반복적으로 PO와 같은 섬유의 위치를​​ 이동해야하지만시각적 단서, 대상 뉴런 (예 : Δ)에 비해 섬유 위치의 정확한 측정을 사용하여 ssible은 소정 거리 멀리 위치를보다 더 중요하다. 프로토콜의 단계 3.8.2에 설명 된대로 Δ는 이미지 분석 (± 3 ㎛의 예상 최대 불확실성)를 정의 할 수 있습니다. 일부 실험 5,8에 흰색 빛 소스는 원하는 세포를 표적으로하기 위하여 섬유를 결합되었다. 이 방법은 대상 지역에서 산란되는 빛의 강도가이 얕은 각도 (θ)에서 상대적으로 낮은 때, 직립 현미경 설정에서 효과 것으로 나타났다. </li><li> 섬유가 위치에 오면, 마이크로 피펫의 간단한 위치를 사용하려면 알려진만큼 그것을 밖으로 이동합니다. 섬유는 후 신경 녹음이 달성 원래 위치로 반환 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 세포 내 용액을 마이크로 피펫을 기입하고 안전하게 머리에 장소에 적합앰프의 다케 (예 : Multiclamp 700B, 분자 장치). 미세 전극 홀더의 측면에 부착 된 튜브를 사용하여 마이크로 피펫의 막힘을 방지하기 위해 긍정적 인 압력의 작은 금액을 적용합니다. </li><li> micromanipulator에 사용, 단지 목표 뉴런 위의 위치에 micropipette를 이동합니다. </li><li> 전체 세포 레코딩을위한 프로토콜 : <ol><li> 증폭기의 전압 클램프 모드에서 10 밀리, +10 MV 구형파 펄스 (예를 들어, 인감 시험)을 적용하고 0 nA의에 기준 신호의 마이크로 피펫 잠재력 (피펫 오프셋)를 조정합니다. 도장 검사는 미세 전극의 저항이 원하는 범위 (- MΩ 6 예 2) 내에 있는지 여부를 결정하는 데 사용되어야한다. </li><li> 저항을 모니터링하면서, 조심스럽게 대상 신경 세포의 표면에 마이크로 피펫의 위치를​​ 미세 조작기의 미세 조정을 사용합니다. 마이크로 피펫은 신경 세포와 접촉 할 때, 저항 (~ 0.5-1 MΩ)에 의해 증가 할 것이다. 나는mmediately 저항 증가에 이어, 긍정적 인 유체 압력을 제거하고 작은 부정 압력을 적용합니다. 일단 저항 10를 통과했다 - 20 MΩ, 지주 레벨 (-60 MV 정도 등)에 대한 잠재적 멤브레인을 고정합니다. </li><li> 그것은 1 GΩ을 초과 할 때까지 전극의 저항은 효과적인 밀봉 ( &#39;gigaseal&#39;라고)가 세포막과 마이크로 피펫 사이에 형성되었음을 의미, 계속 증가한다. 이 시점에서, 마이크로 피펫에서 모든 유체 압력을 제거합니다. </li><li> gigaseal가 형성되면, 짧은 전류 펄스 (25-100 마이크로 초, +1 V)를 사용하거나 파열 세포막에 부정적인 유체 압력의 짧은 펄스 및 전체 셀 구성을 얻을 수 있습니다. </li><li> 막 커패시턴스, 직렬 저항과 씰 테스트 펄스와 현재에 장착 지수 곡선에서 결정되는 입력 저항을 기록합니다. 다음 switc, 앰프 CpFast 및 CpSlow 컨트롤을 조정하여 용량 과도을 최소화H는 전체 셀 모드로 증폭기, 평면 현재까지 커패시턴스와 저항을 보정은 물개 시험 중에 관찰된다. 평면 테스트 씰 응답을 유지하기 위해 용량과 저항 컨트롤을 조정, 직렬 저항 보상 (70 % 예측 ~ 70 % 보정)를 적용. </li><li> 앰프 전류 클램프 모드로 전환합니다. 휴식 막 잠재력 (전류 주입의 부재)을 기록해 두십시오. 원하는 수준 (예 : -60 MV)에서 막 잠재력을 안정 잡고 전류를 설정합니다. 피펫 용량을 중화하고 전압 강하를 균형 다리의 밸런스를 조정합니다. </li><li> (; 300 밀리 초 지속 시간 +10 펜실바니아 단계 10-200 PA) 현재의 탈분극과 자극에 의​​해 신경 세포의 발화 특성을 확인합니다. </li></ol></li><li><ol><li> 신경 옆에 위치에 광섬유를 다시 이동합니다. CCD 카메라에 연결된 이미징 소프트웨어를 사용하여 대상 신경과 관련하여 섬유의 위치의 이미지를 캡처N, 광 섬유 (그림 1 참조)의 상단 가장자리에 다음 초기 신경 세포의 평면에 초점을합니다. </li><li> 결과 이미지의 후속 분석 (예를 들어, 그림의 1B 및 1C)에 의해 정확하게 Δ를 (대상 신경 세포의 중심에 광섬유 상대의 위쪽 가장자리의 위치)을 결정 할 수 있습니다. 일단 Δ가 알려져 같은 섬유 단면에서 대상 신경 세포 (섬유 축) Z와 빔 δ의 R의 중심에서 신경 세포의 반경 방향 변위까지의 거리 등의 매개 변수는 간단한 삼각 관계를 사용하여 계산 될 수있다 : Z = R 죄 2θ + Δ COS θ δ R = ((R COS 2θ - Δ 죄 θ) 2 + ΔY 2) 1 / 2, ΔY는 섬유 축 이상에서와 같이 신경 세포의 중심 사이의 거리입니다 (예 : SE전자 그림 1). 이러한 위치 매개 변수의 정확한 지식이 자극 공정 25의 가능한 차이를 해결해야 할 수 있으므로 분석은 셀에서 셀에 계정 위치 변화를 고려한다. </li></ol></li></ol> 4. INS 실험 <ol><li> 현재 클램프 또는 전압 클램프 구성 중 하나에있는 전기 생리학 데이터를 기록하는 동안, 원하는 매개 변수 (예 : 전력, 펄스 길이, 반복 속도 등)에 자극 레이저를 실행합니다. 우리의 레이저, 광 파워는 레이저 드라이버로 직접 입력을 통해 제어되며 각 기록하기 전에 수동으로 지정됩니다. 펄스 길이와 반복 속도는 외부 신호 발생기 또는 데이터 수집 소프트웨어 (같은 단계 2.3.4에 설명) 중 하나에 의해 제어 할 수 있습니다. 데이터가 패치 클램프 채널과 레이저 트리거 채널 모두에서 기록되어 있는지 확인합니다. </li></ol> 다양한 길이의 레이저 펄스약 500 마이크로 초에서 15 밀리와 펄스 당 ~ 0.25-5 엠제이의 에너지에서 일반적으로 측정 전기 반응을 얻을 수 있습니다. 그것은이 매개 변수의 영향을 최소화 할 수 있기 때문에 1 또는 50Hz이어야 레이저 펄스의 반복 속도를 설정하면, 초기 실험에 유용 할 수 있습니다. 기록 된 신호의 변화를 보여주는 전형적인 결과는 다음 절에 제시되어있다.

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이 문서에 설명 된 프로토콜을 사용하면 추출 문화 나선 신경절 신경 세포 및 전체 세포 패치 클램프 실험을 수행하여 레이저 유발 전기적 활동을 조사 할 수 있습니다. 체외에서 사용할 경우, 패치 클램프 기술은 생체 내에서 달성 할 수없는 실험 매개 변수의 제어 수준을 제공합니다. 같은 파장, 펄스 에너지, 펄스 길이, 펄스 모양과 펄스 반복 시퀀스로 레이저 자극 매개 변수는 재생 환경에서 공부하실 수 있습니다. 또한, 신경이 유지되는 환경 (예 : 용액의 온도, 화학 요소)은 가능한 막 특성을 연구하고, 따라서 적외선 신경 자극을 기본 메커니즘을 만드는 체계적으로 변화 될 수있다. 전기 및 광 자극 양식 사이의 상호 작용은 제어 된 방식으로 조사 할 수 있습니다. 이러한 기초 연구는 층을 도입하여 더욱 고급 수 있습니다uorescent 프로브는 이온 농도 또는 열 충격 단백질의 발현과 같은 추가 매개 변수를 모니터링 할 수 있습니다. 이러한 다양한 매개 변수의 명확한 이해는 현상...

신경 생리학 및 의학 생체 공학의 분야는 신경 조직에 전기 반응의 제어 자극 할 수 있도록 기술에 크게 의존하고 있습니다. 전기 자극은 신경 자극의 황금 표준 남아있는 동안 신경 반응 및 조직 1 주변에 현재의 확산으로 인해 자극 특이성의 부족을 녹음 할 때, 그것은 이러한 자극 유물의 존재와 같은 단점의 숫자에서 겪고있다. 지난 수십 년간 광학 매개 자극 기술 2의 개발을 보았다. 이러한 기술 중 일부는 특정 분자의 추가 (예 갇힌 분자) 3 연구 설정 밖에서 쉽게 적용 할 수있다 어느 것도 유전자 조작의 일부 형태 (예를 들어 optogenetics 4)를 통해, 표적 조직의 수정이 필요합니다. 특히 관심을 따라서 적외선 신경 자극 (INS), whereb는Y 신경 조직은 펄스 적외선 레이저 빛에 의해 흥분됩니다. INS는 신경 조직 2의 매우 구체적인, 비 접촉 자극을 가능하게하여 전기 자극의 많은 단점을 극복 할 수있는 잠재력이있다. INS가 성공적으로 생체 내에서 다양한 설정에서 설명하고있는 동안 그러나, 여기의 정확한 메커니즘은 불확실 남아있다. 최근 일부 서적은 5-7 INS 뒤에 메커니즘을 폭로으로 진행 상황을 보여 주었다. 물에 의해 레이저 빛의 흡수에 의한 급속한 난방은 중요한 역할을 나타납니다. 그러나이 넘어 합의가 아직 도달 할 수있다. 샤피로 등. 7 빠른 가열 세포막과 이후의 탈분극의 정전 용량의 변화를 선도 세포막에 인접한 하전 입자의 분포에 교란을 일으키는 원인이 그것에 매우 일반적인 메커니즘을 제안한다. 또한, 알버트 등은 5.는 LASE를 주장R 유도 가열은 이온이 세포막을 통과 할 수 있도록 온도에 민감한 이온 채널 (일시적인 수용체 잠재적 인 vanilloid 채널)의 특정 클래스를 활성화합니다. 이 단계에서 그것을 식별 할 수 아직 추가 요소가 있는지 여부를 실제로 이러한 메커니즘을 결합하는 방법 불분명하거나. 출판물의 작은 수 (참조 5,7-9) 체외에서 INS를 조사했지만,이 분야에서 출판 작업의 대부분은 (예를 들어, 참조 1,6,10-18) 생체 내에서 실시되었습니다. 청각 신경의 적외선 자극 인공 와우 10,14-18의 잠재적 인 응용 프로그램 때문에 특별한 관심의 영역이다. 생체 내 실험에서 다양한 설정의 기술, 생체 연구에 의해 여유 컨트롤의 증가 수준 기계화에 대한 자세한 이해로 이어질 것으로 예상된다의 효과를 확인하기 위해 중요하지만INS에 대한 책임 anism. 이 보고서는이 또한 청각 시스템에서 기존 데이터의 큰 바디에 연결하는 동안 기본 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수있는 패치 클램프 수사 배양 나선 신경절 신경 세포의 준비에 대해 설명합니다. 패치 클램프 기술은 단일 세포의 전기적 활동을 기록하는 수단을 제공하고 각각의 기본 전류 (19)의 기여를 공부하고, 전기 생리학 현상의 연구를위한 훌륭한 도구입니다. 이 기술은 같은 양식 나선 신경절과 같은 기본 뉴런의 체외 준비에 안정적으로 적용하면 깊이 신경 활동을 통제하고 조작하는 메커니즘을에서 공부 할 수있는 기회를 제공합니다. 패치 클램프를 통해 나선형 신경절 신경 세포의 전기적 특성에 레이저 자극의 효과를 조사이 작품 개요 방법에 지정된 프로토콜녹음. 접근 방식은 표준 현미경 구성을 수정할 필요없이 안전 운전뿐만 아니라보다 쉽고 반복적 인 정렬을 허용, 오히려 자유 공간 레이저보다 섬유 결합 레이저를 기반으로합니다. 이러한 프로토콜의 기초에, 그것은 더 명확 INS 뒤에 기계 또는 기계 장치를 결정하기 위해 실험의 넓은 범위를 수행 할 수 있어야한다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">세포 배양 재료 및 장비 </td></tr><tr><td>유리 커버슬립</td><td>Lomb Scientific</td><td>CSC 10 1 GP</td><td></td></tr><tr><td>4-링 세포 배양 접시 </td><td>VWR International</td><td>82050-542</td><td></td></tr><tr><td>폴리-L-오르니틴 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>곡선 겸자</td><td>WPI</td><td>14101</td><td>Dumont #5 핀셋(45°C; 각도 팁)</td></tr><tr><td>CO2 인큐베이터</td><td>ThermoScientific</td><td>Heracell 150i</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">표 1. 세포 배양 재료 및 장비.</td></tr><tr><td colspan="4">Neurobasal media</td></tr><tr><td>Neurobasal A</td><td>Gibco</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>N-2 supplement</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27 무혈청 보충제</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-148</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Invitrogen</td><td>25030-149</td><td></td></tr><tr><td>Intracellular solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Potassium D-gluconate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Na2ATP</td><td>시그마-알드리치</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>MgATP</td><td>시그마-알드리치</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>NaGTP</td><td>시그마-알드리치</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>수산화칼</td>륨 <td>LabServ</td><td>BSPPL738.500</td><td></td></tr><tr><td>자당</td><td>시그마-알드리치</td><td>S8501</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><강> 세포 외 용액 < / 강> </td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>310166</td><td></td></tr><tr><td>염화 칼륨</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>시그마 알드리치</td><td>383147</td><td></td></tr><tr><td>염화 마그네슘</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>D- 글루코스</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>LabServ</td><td>BSPSL740.500</td><td></td></tr><tr><td>자당</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8501</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">표 2. 세포 배양 및 패치 클램프를 위한 솔루션. a) Neurobasal media. b) 세포 내 용액. c) 세포외 용액.</td></tr><tr><td>정립 현미경</td><td>Zeiss</td><td>AxioExaminerD1</td><td>Dodt contrast </td></tr><tr><td>Water immersion objective</td><td>Zeiss</td><td>W Plan-APOCHROMAT 40x/0.75</td><td></td></tr><tr><td>플랫폼 및 X-Y 스테이지 </td><td>ThorLabs</td><td>Burleigh Gibraltar</td><td></td></tr><tr><td>녹음 챔버</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26G</td><td></td></tr><tr><td>진동 차단 테이블</td><td>TMC</td><td>Micro-g 63-532</td><td></td></tr><tr><td>CCD 카메라</td><td>진단 기기</td><td>RT1200</td><td></td></tr><tr><td>카메라 소프트웨어</td><td>진단 기기</td><td>SPOT 기본</td><td></td></tr><tr><td>인라인 솔루션 히터</td><td>Warner</td><td>SH-27B</td><td></td></tr><tr><td>온도 컨트롤러</td><td>Warner</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>패치 클램프 증폭기</td><td>분자 장치</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>패치 클램프 데이터 수집 시스템</td><td>분자 장치</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>MPC-325</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette glass</td><td>Sutter Instruments</td><td>GBF100-58-15</td><td>붕규산 유리(필라멘트 포함</td></tr>) <tr><td>Micropipette Puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P2000</td><td></td></tr><tr><td>레코딩 소프트웨어</td><td>AxoGraph</td><td></td><td>Lab pack 및 전기 생리학 도구</td></tr><tr><td>흡인기 병</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS12201L</td><td>1 L Pyrex 흡인기 병, 튜빙 용 배출구 포함</td></tr><tr><td>PE 튜빙</td><td>Harvard</td><td>PolyE # 340</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex 연동 펌프</td><td>Cole-Parmer</td><td>HV-07554-85</td><td></td></tr><tr><td colspan = "4">Table 3.Patch clamp equipment.</td></tr><tr><td>1,870 nm 레이저 다이오드</td><td>Optotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200/220 &뮤; m 직경 다중 모드 광섬유 패치 코드(FC/PC)</td><td>AFW Technologies</td><td>MM1-FC2-200/220-5-C-0.22</td><td>광 전달 광섬유, 실리카 코어 및 클래딩, 0.22NA</td></tr><tr><td>커넥터를 통한 광섬유(FC/PC)</td><td>Thorlabs</td><td>ADAFC2</td><td></td></tr><tr><td>광섬유 절단기</td><td>EREM</td><td>FO1</td><td></td></tr><tr><td>광섬유 스트리핑 도구(0.25 - 0.6mm) </td><td>Siemens</td><td></td><td>광섬유 재킷 제거용</td></tr><tr><td>광섬유 스트리핑 도구 (0.6 - 1.0 mm)</td> <td>지멘스</td><td></td><td>패치 코드의 외부 코팅 제거 용</td></tr><tr><td>신호 발생기</td><td></td><td></td><td>필요한 펄스 모양을 출력 할 수 있고 외부에서 트리거 될 수있는 모든 신호 발생기</td></tr><tr><td>광섬유 포지셔너</td><td></td><td></td><td>맞춤형 포지셔너. 헝겊 조각 죔쇠 실험에 사용된 표준 micropositioner로 대용품할 수 있었습니다:</td></tr><tr><td>광섬유 물림쇠</td>, <td>Newport</td>, <td>FPH-DJ</td><td></td></tr>, <tr><td>레이저 힘 미터 및 발견자 머리</td>, <td>LM-3 (발견자 머리)를 가진 Coherent FieldMate (힘 미터<</td><td></td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Table 4. 레이저 장비.</td></tr></tbody></table>

적외선 신경 자극의 메커니즘을 조사하는 전체 세포 패치 클램프

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

그것은 펄스, 적외선 레이저 빛이 표적 조직의 추가 수정에 관계없이, 신경 조직에 전기 반응을 유도하는 데 사용할 수 있습니다 최근 몇 년 동안 입증되었습니다. 적외선 신경 자극은 청각 신경의 신경 자극에 표시된 특정 관심, 생체 내 말초 감각 신경 조직의 다양한보고되었다. INS는 이러한 설정에서 작업 표시하고있는 동안 그러나, 적외선 빛은 신경 자극의 원인이되는 메커니즘 (또는 메커니즘)은 현재 잘 이해되지 않습니다. 여기에 제시 프로토콜은 배양 기본 청각 신경에있는 적외선 신경 자극의 조사를 용이하게하기 위해 설계된 전체 세포 패치 클램프 방법을 설명합니다. 철저하게 통제 된 조건 하에서 체외에서 적외선 레이저 조명에 이들 세포의 반응을 특성화함으로써, 기본적인 physica에의 향상된 이해를 얻을 수있을 수 있습니다L, 생화학 적 과정은 적외선 신경 자극을 기본.

나선 신경절 신경 세포는 전압 클램프 전류 클램프 녹음 구성 모두에서 반복 파형과 레이저 조명에 응답합니다. 그림 3A는 2.5 밀리, 0.8 mJ의 레이저 펄스 (6 일부터 평균 응답에 대한 응답으로 세포막을 통해 현재의 흐름의 전형적인 변화를 보여줍니다 -70 MV, -60 MV -50 MV에서 개최 막 잠재력을 가진 1 초 간격)으로 반복 레이저 펄스. NET 안쪽으로 전류가 지속적으로 조명 중지 한 후 초기 값으로 반환 레이저 펄스에 대한 응답으로 유발된다. 레이저 유도 전류의 모양은 INS를 기본 프로세스의 완전한 이해를 얻기 위해 개최 가능성의 범위에서 실험을 수행하는 것이 중요 할 수 있음을 나타내는 막 잠재력이 변경 될 때 다양하게 볼 수 있습니다. 이러한 실험은 현재 프로토콜의 사소한 수정을 실시하고 충전 전압과 전통 기술 (QV) 분석을 사용하여 분석 할 수 있습니다 (SE체외에서 INS에서 얻은 QV 곡선의 예)에 대한 전자 참고 7. </p...

적외선 신경 자극은 청각 시스템과 관련된 포함 신경 유형의 범위 내에서 전기 자극에 대한 대안으로 제시되었다. 이 프로토콜은 기본 청각 신경의 문화 적외선 신경 자극의 메커니즘을 연구 패치 클램프 방법을 설명합니다.

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

다음 실험의 전반적인 목표는 적외선 레이저 조사가 인비트로(in vitro) 상태의 청각 신경세포에 미치는 영향을 연구하기 위한 모델 시스템을 구축하는 것입니다. 이를 위해 배양된 청각 신경세포를 홀셀(whole cell) 구성의 패치 클램프로 고정하여 전기적 특성을 탐구합니다. 이후, 신경세포에 레이저 조사를 가하면 노출된 세포에서 전기적 반응이 유도되며, 이를 패치 클램프 장치로 측정할 수 있습니다.그 후 조명 파라미터와 환경 변수를 변경하여 레이저 유도 전기 반응에 미치는 영향을 관찰할 수 있습니다. 레이저 광선에 노출된 청각 신경세포는 이후 분석을 위해 각 레이저 펄스에 반응하여 반복 가능한 전기적 활성을 나타낼 것입니다. 이 방법은 나선신경절 신경세포의 적외선 자극 기저 메커니즘에 관한 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 방법은 특히 나선신경절 세포의 적외선 자극에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 관련 물리적 과정을 더욱 명확히 하기 위해 다른 세포 유형이나 지질 이중층과 같은 단순화된 모델로 확장 적용될 수도 있습니다. 결과적으로 발생하는 복사 조도가 매우 중요한 파라미터이므로, 광전달 광섬유의 정확한 위치 선정을 보장하기 위해 이 방법의 시각적 시연이 중요합니다. 2~6 MΩ 저항을 가진 기록용 마이크로 피펫을 준비하십시오. 이는 CO2 레이저 풀러를 사용하여 붕규산 유리로부터 제작할 수 있습니다.광섬유 결합 레이저를 준비합니다. 다양한 종류의 광섬유를 사용할 수 있습니다. FCPC 커넥터가 있는 패치 코드 구성의 광섬유를 반으로 절단하면, 한쪽 끝에는 커넥터가 있고 다른 쪽 끝에는 광섬유가 노출된 두 개의 광섬유 링크가 생성됩니다.이것들은 피그테일입니다. 피그테일 하나의 베어 팁(bare tip)에서 파이버 재킷을 제거하고, 에탄올로 세척한 후 현미경 하에서 적절한 도구로 절단하여 준비하십시오. 팁이 파이버 축에 수직이며 평평하게 보이는지 확인하십시오.필요한 경우 적절한 커넥터를 사용하여 파이버 피그테일의 반대쪽 끝을 자극 레이저의 출력단에 연결하십시오. 이때 반드시 파이버에서 출력되는 레이저 전력을 측정해야 합니다. 이후 팁 조작을 추가로 수행한 후에도 동일하게 측정하십시오.이제 광섬유를 척(chuck)에 삽입하고, 척을 적절한 마이크로 포지셔너에 고정하십시오. 다음으로, 광섬유와 커버슬립이 이루는 각도를 측정하십시오. 해당 배치 상태를 촬영한 후 Image J를 사용하

whole-cell-patch-clamp-for-investigating-mechanisms-infrared-neural

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 프로토콜은 제브라피시 배아에서 Mauthner 뉴런 및 기타 망상 척수 세포의 전기적 특성을 연구하는 방법인 전체 세포 패치 클램프 전기생리학이라는 기술을 설명합니다.

Whole-Cell Patch Clamp 전기생리학: 뉴런의 전기적 특성을 연구하는 방법

이 비디오는 형질주입된 쥐 해마 뇌 절편에서 시냅스 상호 작용 및 신경 반응을 연구하는 프로토콜을 보여줍니다. 여기에는 활동 전위를 트리거하기 위해 장거리 감각 뉴런을 조명하고 전체 세포 패치 클램프 기술을 사용하여 기록된 뉴런에서 결과로 발생하는 흥분성 시냅스 후 전위를 기록하는 것이 포함됩니다.

Photostimulation and Whole-Cell Patch Clamp Recordings of Neurons in Mouse Hippocampal Slices

이 비디오는 내이 감각 뉴런 세포체의 이온 전류를 측정하기 위한 패치 클램프 기술을 보여줍니다. 이 백서에서는 암포테리신 B가 함유된 내부 용액으로 채워진 광택 있는 패치 클램프 피펫의 준비 및 사용에 대해 자세히 설명하며, 이 피펫은 멤브레인을 천공하여 세포 내 상태를 보존하면서 이온 이동을 허용합니다. 전압 펄스는 이온 채널 활동을 트리거하고 기록하기 위해 적용되어 이온 채널 활동과 그 특성에 대한 통찰력을 제공합니다.

내이 감각 뉴런 세포체의 천공된 패치 클램프 기록

이 비디오는 패치 클램프 기술을 사용하여 유변기저와 막 전위를 측정하고 증분 전류 주입에 대한 뉴런의 반응을 분석하여 등쪽 신경절의 감각 뉴런 흥분성을 검사하는 방법을 보여줍니다.

온전한 쥐 등쪽 뿌리 신경절에 대한 전체 세포 패치 클램프 기록

여기에 설명하는 세포 부착 된 패치 클램프 기술로 하나의 이온 채널에서 현재 기록의 장기 복역을 얻기위한 절차입니다. 이 방법은 실시간으로 관찰을 허용, 생물학적 신호를 기초 개폐 채널 입체 형태의 패턴. 이 데이터는 그대로 생체막의 채널 특성에 대해 알려 드리겠습니다.

1 채널의 세포 부착 된 패치 클램프 녹음

대뇌 피질의 네트워크는 억제의 interneurons의 작지만 다양한 설정에 의해 제어된다. 의 interneurons의 기능 조사 그러므로 표적으로 기록하고 엄격한 확인이 필요합니다. 세포 내 라벨, 사후 형태 학적 및 면역 조직 화학적 분석 신경 세포의 단일 또는 시냅스 결합 쌍에서 전체 셀 녹음을 포함하는 통합 접근 방식은 여기에 설명한다.

Morphologically- 및 Neurochemically 확인 된 해마의 interneurons에서 전체 세포 패치 클램프 녹음

이 프로토콜은 전체 셀 패치 클램프 녹음을 수행하기위한 기본 절차 단계를 설명합니다. 이 기술은 신경 세포의 전기적 동작의 연구를 허용하고, 뇌 조각에서 수행하는 경우, 여전히 상대적으로 잘 보존 된 뇌 회로에 통합되어 신경 세포에서 다양한 신경 기능의 평가를 할 수 있습니다.

뇌 조각에서 전체 셀 패치 클램프 녹음

이 프로토콜은 평면 장착 준비에서 망막 신경 세포에 전체 셀 패치 클램프 녹음을 수행하는 방법을 보여줍니다.

Deafferentated 마우스 망막의 플랫 마운트 준비에 별 모양 무 축삭 세포의 패치 클램프 녹음

조각 패치 클램프 기술 기본 속성 및 흥분 성의 또는 억제 시 냅 스의가 소성 학습 유도 된 변화를 분석 하기 위한 효과적인 방법입니다.

조각 패치 클램프 기술 학습 유도 소성을 분석 하기 위한

이 프로토콜은 표준 시험관 전기 생리학 장비를 위해 최근에 개발 된 시스템을 사용하여 자동 이미지 유도 패치 클램프 실험을 수행하는 방법을 설명합니다.

뇌 조각에서 뉴런 연구를위한 자동 이미지 유도 패치 클램프의 적용

배우세요 전체 세포 패치 클램프를 이용해 적외선 레이저 자극이 청각 신경 세포에 미치는 영향을 연구하는 방법을. 이 기술은 신경 생리학 및 청각 치료 연구에 활용됩니다.

적외선 신경 자극의 메커니즘을 조사하는 전체 세포 패치 클램프

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