적외선 신경 자극의 메커니즘을 조사하는 전체 세포 패치 클램프

다음 실험의 전반적인 목표는 적외선 레이저 조명이 체외에서 청각 뉴런에 미치는 영향을 연구하기 위한 모델 시스템을 만드는 것입니다. 이는 전기적 특성을 탐구하기 위해 전체 세포 구성에서 배양된 청각 뉴런을 패치 클램핑(patch clamping)으로 달성합니다. 그 후, 뉴런을 레이저 조사에 노출시키면 노출된 세포에서 전기 반응을 유도할 수 있으며, 이는 패치 클램프 설정으로 측정할 수 있습니다.

그런 다음 레이저 유도 전기 응답에 대한 영향을 관찰하기 위해 조명 매개 변수와 환경 변수를 변경할 수 있습니다. 레이저 광에 노출된 청각 뉴런은 향후 분석을 위해 각 레이저 펄스에 반응하여 반복 가능한 전기 활동을 나타냅니다. 이 방법은 나선신경절 뉴런의 적외선 자극의 기저에 있는 메커니즘에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 방법은 나선신경절 세포의 적외선 자극에 대한 통찰력을 구체적으로 제공할 수 있지만, 관련된 물리적 과정을 더 자세히 설명하기 위해 다른 세포 유형이나 지질 이중층과 같은 단순화된 모델로 확장할 수도 있습니다. 이 방법의 시각적 시연은 결과적인 복사 노출이 중요한 매개 변수이기 때문에 광 전달 광섬유의 정확한 위치를 보장하는 데 중요하며, 2 내지 6 메가 옴의 저항을 갖는 마이크로 피펫 기록을 준비했습니다. CO2 레이저 풀러가 있는 빌린 규산염 유리에서 뽑을 수 있습니다.

광섬유 결합 레이저를 준비합니다. 다양한 광섬유가 작동합니다. FCPC 커넥터가 있는 패치 코드 구성에서 광섬유를 반으로 자르면 한쪽 끝에 커넥터가 있고 다른 쪽 끝에 노출된 광섬유가 있는 두 개의 광섬유 링크가 생성됩니다.

이것들은 땋은 머리입니다. 섬유 재킷을 제거하고 에탄올로 청소한 다음 현미경으로 적절한 도구로 절단하여 한쪽 땋은 머리의 곰 끝을 준비합니다. 팁이 섬유 축에 수직이고 평평하게 보이는지 확인하십시오.

필요한 경우 적절한 스루 커넥터를 사용하여 광섬유 피그테일의 다른 쪽 끝을 자극 레이저의 출력에 연결합니다. 이 시점에서 항상 광섬유의 출력 레이저 출력을 측정해야 합니다. 추가 팁 조작 후에도 이 작업을 수행하십시오.

이제 광섬유를 척에 삽입하고 척을 적절한 마이크로 포지셔너에 고정합니다. 다음으로, 광섬유가 커버 슬립으로 만드는 각도를 결정합니다. 배치 사진을 찍고 이미지 J.Now를 사용하여 각도를 계산하고 레이저를 패치 클램프 데이터 수집 시스템과 동기화하는 연결을 고정합니다.

패치 클램프 데이터 수집 시스템의 디지털 출력은 외부 함수 발생기를 통해 레이저에 연결되어야 하며, 데이터 수집 시스템과 독립적으로 레이저 펄스 매개변수를 지정할 수 있어야 하며, 레이저를 트리거하는 데 사용되는 신호는 레이저 펄스의 타이밍과 길이가 전기생리학적 신호와 동시에 기록될 수 있도록 데이터 수집 시스템의 입력에 다시 연결되어야 합니다. 관류 시스템의 유속을 분당 1밀리리터에서 2밀리리터 사이로 설정합니다. 용액의 빠른 가열을 위한 인라인 히터와 흡입으로 사용한 용액을 제거하는 연동 펌프가 있는 중력 공급 시스템이 작동합니다. 잘. 고배율 이멀젼 대물렌즈와 위상차를 사용하여 정립 현미경의 기록 챔버에 배양된 세포가 포함된 커버 슬립을 놓고 나선형 신경절 뉴런을 찾습니다.

전형적인 나선형 신경절 뉴런은 위상이 밝고 원형이며 직경이 약 15미크론이며 두드러진 핵이 있습니다. 적절한 뉴런을 찾으면 더 낮은 배율의 대물렌즈로 전환하고 표적 뉴런을 찾습니다. 그런 다음 마이크로 포지셔너를 사용하여 팁이 수평 및 수직 평면 모두에서 대상 뉴런에 가까워질 때까지 광섬유를 이동합니다.

고배율 대물렌즈로 다시 전환하고 광섬유의 끝을 뉴런 옆의 의도된 위치에 배치합니다. 섬유의 수직 위치를 조정할 때 섬유의 아래쪽 가장자리가 커버 립에 놓이는 것이 중요합니다. 광섬유의 위치에 대한 불확실성을 최소화하기 위해 현미경 이미지의 시각적 단서에서 접촉 지점을 식별할 수 있습니다.

광섬유가 제자리에 놓이면 마이크로 피펫의 위치에 영향을 미치지 않도록 세로축을 따라 알려진 양만큼 섬유를 밖으로 이동합니다. 마이크로 피펫은 세포 내 용액으로 채워져야 하며 앰프의 헤드 스테이지에 단단히 장착되어야 합니다. 마이크로 전극 홀더 측면에 부착된 튜브를 사용하여 마이크로 피펫이 막히는 것을 방지하기 위해 소량의 양압을 가합니다.

마이크로미터 매니퓰레이터를 사용하여 마이크로 피펫을 표적 뉴런 바로 위의 위치로 이동하고 기가 옴 밀봉을 진행합니다. 멤브레인 커패시턴스 직렬 저항 및 입력 저항을 전류에 맞는 지수 곡선에서 결정된 대로 기록하십시오. 씰 테스트 펄스 동안.

증폭기에서 CP 고속 및 CP 슬로우 컨트롤을 조정하여 과도 커패시턴스를 최소화합니다. 그런 다음 증폭기를 전체 셀 모드로 전환하고 SEAL 테스트 중에 평평한 전류가 관찰될 때까지 커패시턴스 및 저항 보상을 수정합니다. 다음으로, 약 70% 보정, 70% 예측으로 직렬 저항 보상을 적용하고 커패시턴스 및 저항 보상 제어를 조정하여 플랫 테스트 씰 응답을 유지합니다.

그런 다음 앰프를 현재 cl로 전환amp 모드. 전류 주입이 없는 경우 휴지 멤브레인 전위를 기록하십시오. 이제 원하는 수준에서 멤브레인 전위를 안정화하기 위해 유지 전류를 설정합니다.

피펫 커패시턴스를 중화하고 전압 강하의 균형을 맞추기 위해 브리지 밸런스를 조정합니다. 탈분극 전류로 자극하여 뉴런의 발화 특성을 확인합니다. 이 시점에서 CCD 카메라와 결합된 이미징 소프트웨어를 사용하여 광섬유를 뉴런 옆의 위치로 다시 이동하고 처음에는 뉴런의 평면에 초점을 맞춘 이미지를 캡처한 다음 광섬유의 상단 가장자리에 초점을 맞춥니다.

이미지를 분석하여 델타 값을 결정하는데, 델타 값은 타겟 뉴런의 중심을 기준으로 광섬유의 위쪽 가장자리 위치를 기준으로 합니다. 광섬유의 위치를 정확하게 아는 것이 매우 중요합니다. 이는 대상 세포에 전달되는 단위, 면적 또는 복사 노출당 에너지가 적외선 신경 자극에 중요한 매개변수이기 때문이며, 이는 세포에 대한 광섬유의 위치에 의해 상당한 영향을 받을 수 있습니다.

이 레이저는 광학 출력이며 레이저에 대한 직접 입력을 통해 컴퓨터에 의해 제어되며 각 기록 전에 수동으로 지정할 수 있습니다. 펄스 길이 및 반복률은 앞에서 설명한 대로 함수 발생기를 통해 제어할 수 있으며, 패치 클램프 채널과 레이저 트리거 채널 모두에서 데이터가 0.25에서 5로 1/2에서 15밀리초 레이저 펄스로 기록되도록 합니다. 밀리줄은 일반적으로 측정 가능한 전기 반응을 생성합니다. 처음에.

바람직하지 않은 효과를 최소화하기 위해 레이저 펄스의 반복률을 1 헤르츠 이하로 설정하는 것이 유용할 수 있습니다. 모든 레이저 매개변수가 설정되면. 데이터 수집을 진행합니다.

나선형 신경절 뉴런은 전압 클램프와 전류 클램프 모두에서 반복 가능한 파형으로 레이저 조명에 반응합니다: 2.5 밀리초, 0.8 밀리줄 레이저 펄스에 반응하는 기록 구성. 일반적인 셀은 다양한 유지 전위에서 순 내부 전류를 생성합니다. 현재 클램프 기록은 이러한 레이저 펄스가 진행되는 동안 꾸준한 멤브레인 탈분극이 나타나고 펄스 후 휴지 멤브레인 전위를 향해 대략 기하급수적으로 감소하는 것을 보여줍니다.

어떤 경우에는 레이저 펄스를 따라 작은 추가 멤브레인 탈분극이 있을 수도 있습니다. 과도한 에너지로 조명을 비추거나 큰 온도 상승에 노출되면 세포의 전기적 특성이 저하되거나 순간적인 세포 사멸을 통해 세포 손상이 관찰될 수 있습니다. 이 절차를 따르면 용액 온도 또는 화학적 요인과 같은 다양한 환경 매개변수를 변경하여 레이저 유도 전기 활성에 대한 이러한 요인의 영향을 테스트할 수 있습니다.

레이저로 작업하는 것은 위험할 수 있으므로 표준 안전 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오. 여기에는 레이저 보안경, 경고 표지판 사용, 빔이 반사율이 높은 표면과 의도하지 않게 교차하지 않도록 하는 것이 포함됩니다.