꿀벌의 RNAi를 매개로 두 유전자 넉다운과 미각 지각 측정 (

이 비디오 프로토콜은 성체 꿀벌에서 두 개의 유전자를 동시에 녹다운(knock down)시킨 후, 이중 유전자 녹다운이 꿀벌의 미각 인지에 미치는 영향을 측정하기 위해 주둥이 확장 반응(proboscis extension response, PER) 분석을 수행하는 새로운 기술을 보여줍니다. 이는 먼저 vitelline, genin, ultraspherical 및 녹색 형광 단백질(green fluorescence protein)의 세 가지 단백질 유전자를 표적으로 하는 이중 가닥 RNA를 합성함으로써 이루어집니다.

GFP를 인코딩하는 유전자가 꿀벌의 게놈에서 발견되지 않으므로, GFP 이중 가닥 RNA는 음성 대조군으로 사용됩니다. 두 번째 단계는 네 가지 처리 전략을 사용하여 꿀벌에게 이중 가닥 RNA를 주입하는 것입니다. 주입 방법은 GFP 이중 가닥 RNA만 단독 주입하는 경우, VG와 USP 이중 가닥 RNA 혼합물을 단일 주입하는 경우, 첫째 날에 vg 이중 가닥 RNA를 주입하고 둘째 날에 USP 이중 가닥 RNA를 주입하는 경우, 그리고 첫째 날에 USP 이중 가닥 RNA를 주입하고 둘째 날에 VG 이중 가닥 RNA를 주입하는 경우입니다. 주입 후에는 처리군에 해당하는 색상 코드로 표시된 페인트 점을 찍어 벌들을 구분하고 벌통으로 돌려보냈습니다.

6일 후, 처리된 벌에서 VG 및 USP 유전자의 녹다운(knockdown) 여부를 실시간 PCR로 검증하며, VG와 USP의 이중 녹다운이 미각 인지에 미치는 영향은 PER 분석으로 측정합니다. 최종적으로 이중 녹다운된 벌은 VG 및 USP 유전자의 발현이 유의미하게 감소하고 자당에 대한 미각 인지가 유의미하게 증가하는 것으로 나타납니다. 본 간섭 기술은 유전자 기능을 밝히는 데 사용할 수 있는 강력한 도구입니다.

이는 일반적으로 단일 유전자를 표적으로 하는 데 사용됩니다. 하지만 유전자는 복잡한 조절 네트워크의 일부입니다. 생물학적 과정을 더 잘 이해할 수 있는 한 가지 방법은 유전자가 유전자 네트워크와 어떻게 상호작용하는지 학습하는 것입니다.

이를 위해 우리는 여러 유전자를 동시에 조작해야 합니다. 지금까지는 곤충에서 한 번에 하나의 유전자만 억제할 수 있었으나, 여기에서는 처음으로 꿀벌에서 하나의 유전자 대신 두 개의 유전자를 넉다운(knock down)하는 방법을 보여드리고자 합니다. 확률적 구강 연장 반사(Proboscis Extension Response, PER)는 꿀벌의 사회적 행동에 대한 행동 예측 인자인 미각 인지를 측정하는 매우 유용한 기술입니다.

예를 들어, 미각 인지 능력이 높은 둥지 벌들은 행동적으로 빠르게 성숙하며, 생애 초기에 먹이 활동을 시작하고, 화분 수집을 선호합니다. 이 절차를 시작하려면, 무료 소프트웨어인 primer.Three를 사용하여 넉다운(knockdown) 대상 유전자를 표적으로 하는 이중 가닥 RNA 프라이머를 설계하십시오. 본 실험에서 넉다운 표적으로 설정한 두 유전자는 vitelli, genin 또는 VG 및 ultras spherical 또는 USP입니다.

VG 및 USP 설계 외에도, 꿀벌 게놈에 존재하지 않는 녹색 형광 단백질(GFP)을 인코딩하는 대조 유전자를 표적으로 하는 이중 가닥 RNA의 프라이머를 제작하였습니다. 이후, Promega사의 rib max T seven RNA 생산 시스템을 이용한 인비트로(in vitro) 전사법을 통해 VG, USP 및 GFP에 대한 이중 가닥 RNA 합성을 수행하였습니다.

표준 절차를 사용하여 이중 가닥 RNA를 정제한 후, 각 이중 가닥 RNA 펠릿을 뉴클레아제 프리 워터(nuclease free water)에 녹입니다. 유전자 억제의 효율성을 보장하기 위해, 이중 가닥 RNA 농도는 약 9~10 µg/µL가 되어야 합니다. 주사를 위해 벌을 준비하려면, 갓 우화한 벌을 4 °C 냉장고에서 1~2분 동안 냉각시킵니다. 벌이 움직이지 않게 되면, 고체 왁스가 채워진 페트리 접시 위에 벌 3~4마리를 병렬로 배치하고 곤충 핀을 복부와 흉부 사이에 교차시켜 고정합니다.

벌을 4 °C 냉장고에 넣어 1~2분 정도 다시 냉각시킵니다. 벌이 완전히 움직이지 않는지 확인하십시오. 벌의 몸은 웅크리거나 뒤틀리지 않고 이완된 상태여야 합니다.

어떠한 움직임도 상처의 크기를 키우고 사망률을 높일 수 있으므로 완전한 고정이 중요합니다. 몸이 굽었거나 뒤틀린 벌은 너무 오래 냉각된 것이며 사망률이 높으므로 사용해서는 안 됩니다. Hamilton 마이크로 시린지에 일회용 30 gauge 바늘을 장착하십시오.

주사기에 3 µL의 이중 가닥 RNA를 채우고, 주사기 내에 기포가 없는지 확인합니다. 단회 투여 전략을 사용하는 경우, 주사기에 두 유전자의 이중 가닥 RNA 혼합물을 채웁니다. 2일 투여 전략을 사용하는 경우, 주사기에 두 이중 가닥 RNA 중 하나를 채웁니다.

바늘을 복부 측면에 삽입합니다. 내부 장기의 손상을 방지하기 위해 주사기 플런저를 천천히 눌러 이중 가닥 RNA가 흡수되도록 합니다. 이중 가닥 RNA는 점도가 매우 높으므로, 주사기에서 완전히 배출하는 데 2~3초가 소요됩니다.

플런저를 완전히 누른 후, 바늘을 상처 부위에 4~5초 동안 그대로 둡니다. 주사 후 3~5초 동안 벌의 상태를 관찰하십시오. 상처 부위에서 혈림프 방울이 새어 나오면 해당 벌은 폐기하고, 서로 다른 처리군에 대응하는 각기 다른 색상으로 벌의 흉부를 표시합니다.

이 단계에서 단일 주입 전략을 사용하는 경우, 꿀이 공급된 용기에서 벌들을 1시간 동안 관찰한 후 군집으로 되돌려 보냅니다. 반면, 2일 주입 전략을 사용하고 첫 번째 이중 가닥 RNA만 주입한 경우에는 꿀이 측면에 공급된 원통형 메쉬 케이지에 벌들을 넣습니다. 벌들을 34 °C, 습도 80%의 인큐베이터에 넣고 다음 날까지 하룻밤 동안 유지합니다.

첫 번째 이중 가닥 RNA와 동일한 절차를 사용하여 두 번째 이중 가닥 RNA를 동일한 벌들에게 주입합니다. 꿀이 제공된 용기 내에서 벌들이 한 시간 동안 실온에서 회복하도록 둔 후, 군집에 투입합니다. 주입 6일 후에 훈연기를 사용하여 벌통을 열지 않고 군집에서 처리된 벌들을 수집합니다.

벌의 미각 인지에 영향을 줄 수 있으며, 본 절차에서 이를 테스트할 예정이므로 훈증(smoke)은 사용하지 않습니다. 부드러운 핀셋을 사용하여 금속 메쉬 원통형 케이지에 벌을 수집하며, PER 분석을 위해 벌을 고정할 때 케이지당 3마리를 초과하지 않도록 합니다.

벌들이 완전히 움직이지 않을 때까지 4 °C에서 냉각합니다. PER 전용으로 설계된 플라스틱 튜브에 각 벌을 수직으로 고정합니다. 테이프를 사용하여 복부는 튜브 안에 유지하고 머리는 튜브 밖으로 나오게 고정합니다.

작은 플라스틱 기둥이 두 줄로 배열된 랙에 튜브를 놓습니다. 한 줄에는 번호가 매겨져 있어 고정된 벌들에게 ID 번호를 부여할 수 있습니다. 벌들이 배양되는 동안, 처리된 벌들이 담긴 랙을 34 °C, 80% 습도의 인큐베이터에 넣고 2시간 동안 유지합니다.

일련의 sucrose 수용액을 준비합니다. PER 분석을 위해 15~20 gauge 바늘이 장착된 주사기에 해당 용액들을 채웁니다.

벌들은 그룹 단위로 테스트합니다. 먼저 각 벌의 안테나에 0% 용액(물) 한 방울을 접촉시킨 후, 이어서 0.1%, 0.3%, 1%, 3%, 10% 및 30% 자당 용액으로 테스트합니다. 각 수용액 투여 사이에는 최소 2분의 간격을 둡니다.

한 가지 농도의 sucrose를 사용하여 꿀벌 20마리를 테스트하는 데는 보통 약 2분이 소요됩니다. 따라서 각 그룹에는 항상 20마리 이상의 꿀벌이 있어야 합니다. 꿀벌이 proboscis를 완전히 뻗으면 양성 반응으로 계산합니다. 실시간.

PCR 분석 결과, 단일 주입 및 2일 주입 전략 모두 꿀벌의 Fiji 및 USP 전사체 수준을 유의미하게 감소시킨 것으로 확인되었습니다. 이 그래프들은 이중 가닥 RNA를 주입한 6일 후의 결과이며, RQ는 표적 유전자 전사체의 상대 정량 수준을 나타내고 막대 위의 서로 다른 문자는 처리군 간의 유의미한 차이를 나타냅니다. 사후 분석 결과, 이중 가닥 RNA 혼합물을 이용한 단일 주입 및 VG를 먼저 주입하고 USP를 나중에 주입한 2일 주입 방식에서의 USP 전사체 억제 정도가 USP를 먼저 주입하고 VG를 나중에 주입한 2일 주입 방식보다 유의미하게 낮았습니다.

이는 VG가 VG 및 juvenile hormone 조절 루프의 주요 조절자일 수 있음을 나타냅니다. 처리된 벌의 GUA 반응 점수 또는 GRS는 여기에 표시된 것과 같이 proboscis extension response 또는 PER 분석 결과로부터 계산되었습니다. VG와 USP 이중 가닥 RNA 혼합물을 주입한 벌의 GRS는 GFP 대조군 벌의 GRS보다 유의하게 높았으며, 이는 이중 knockdown 벌이 sucrose에 더 민감했음을 나타냅니다.

막대 위의 서로 다른 문자는 처리군 간의 유의미한 차이를 나타냅니다. 여기에는 VG 및 USP 유전자를 동시에 억제함으로써 밝혀진 vitellogenin ultras, spherical 및 juvenile hormone 사이의 가능한 조절 네트워크가 제시되어 있습니다. USP 단독 넉다운은 juvenile hormone에 아무런 변화를 유도하지 않는 반면, VG와 USP의 이중 넉다운은 VG 단독 넉다운보다 juvenile hormone을 더 크게 증가시킵니다.

이는 vitelli가 juvenile hormone 생성을 억제할 뿐만 아니라, USP knockdown에 따른 juvenile hormone의 피드백 반응 또한 억제함을 시사합니다. 이중 knockdown의 경우, juvenile hormone 생성의 급격한 증가는 VG knockdown으로 인한 VI genin의 억제 감소와 USP knockdown으로 인한 juvenile hormone 신호 전달 감소에 대한 보상 반응의 결과로 나타납니다. 이 조절 네트워크에 대한 더 상세한 논의는 동봉된 프로토콜 텍스트에서 확인할 수 있습니다.

이중 유전자 넉다운 접근법을 통해, 우리는 단일 유전자만을 억제했을 때는 발견할 수 없었을 vital genic, ultras, spherical 및 juvenile hormone 사이의 상세한 관계를 밝혀냈습니다. 이제 연구자들은 이 기술을 사용하여 조절 네트워크 내 유전자 간의 상호관계를 탐구할 수 있습니다. PR은 꿀벌의 미각 지각을 측정하는 데 사용되는 표준 방법입니다. 하지만 이 방법은 취급 방식에 매우 민감하므로, 동물의 환경과 취급 과정 전반에 걸쳐 일관성을 유지하는 데 각별한 주의를 기울여야 합니다.

또한, 실험을 여러 날에 걸쳐 수행하는 경우, 간략한 타임라인을 작성하고 날씨와 환경이 변하지 않는지 주의 깊게 살피는 것이 좋습니다.