에서 프로스타글란딘 추출 및 분석 Caenorhabditis의 엘레

이 절차는 sea elegance 추출물에서 프로스타글란딘 및 기타 에이코사노이드를 식별하고 측정하는 것을 목표로 합니다. 첫째, 대규모 배양에서 벌레를 성장시킵니다. 그런 다음 액체 추출 기술을 사용하여 웜 조직에서 친수성 지질을 추출하고 지질 추출물을 질량 분석기에 연결된 HPLC 컬럼에 주입합니다.

그런 다음 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석법의 데이터를 분석합니다. 궁극적으로 정제된 웜 추출물에 대한 이 lc MSMS 접근법은 새로운 대사 산물을 식별하고 S 시리즈 프로스타글란딘과 같은 알려진 대사 산물을 측정할 수 있습니다. 따라서 효소 면역 분석법과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 매우 민감하고 특이적이라는 것이며, 동시에 포괄적이고 유연하여 이 기술을 시연하는 것은 제 연구실의 대학원생인 Hugh Hong이 지렁이 펠릿 및 NA 22의 보충 공급을 담당할 것입니다.

원심분리에 의한 세균 배양, 상등액을 버리고 박테리아 펠릿을 100ml의 M nine buffer에 현탁시킵니다. 농축된 박테리아 용액을 섭씨 4도에서 보관하십시오. 5개의 초대형 NGM 플레이트에서 지렁이 배양을 시작합니다.

판이 중력으로 가득 찰 때까지 3-4 세대 동안 지렁이를 계속 번식시킵니다. 성인은 필요에 따라 약 1 밀리리터의 농축 박테리아를 웜 플레이트에 굶주림을 방지합니다. 뚜껑을 놓기 전에 완전히 자연 건조하십시오.

다음으로, M nine buffer로 플레이트에서 grab 자웅동체를 씻어냅니다. 50ml 원추형 폴리프로필렌 튜브에서 벌레를 수확합니다. 그런 다음 벌레가 바닥에 가라앉도록 합니다.

박테리아, 난자 및 유충 단계 벌레를 포함하는 상등액을 버리십시오. 이제 Resus, 15ml의 M nine 버퍼에 나머지 벌레를 현탁시키고 부드럽게 혼합합니다. 200마이크로리터의 웜 현탁액을 60개의 시드된 N GM 플레이트 각각에 분배합니다.

모든 플레이트가 파종될 때까지 웜 용액을 잘 혼합하여 거의 동일한 수의 웜을 받을 수 있도록 합니다. 접시에 벌레를 분산시킵니다. 2-4세대 동안 지렁이를 성장시키며, 12-24시간 동안 플레이트당 1ml의 농축 박테리아를 보충합니다.

접시에 GR 성충이 가득 차면 한 번에 한 균주씩 벌레를 수확합니다. M nine 버퍼로 플레이트에서 벌레를 씻어내고 6개의 50ml 폴리프로필렌 튜브로 옮깁니다. 튜브에 M nine 버퍼를 채워 벌레를 씻습니다.

그랩 성인이 바닥에 가라앉으면 약 35ml의 상층액을 제거합니다. 그런 다음 벌레를 하나 또는 두 개의 튜브로 당깁니다. M nine 세척을 세 번 반복하거나 큰 구멍의 파스티 피펫으로 상등액이 투명해질 때까지 반복합니다.

가능한 한 많은 웜을 15mm 폴리프로필렌 원뿔형 튜브에 옮깁니다. 1000 RCF에서 5분 동안 원심분리기를 하고 상층액을 버립니다. 다른 균주에 대해 수확, 세척 및 통합 단계를 반복합니다.

수확된 지렁이 균주의 재고는 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 빨갛고 뜨거운 면도날을 사용하는 폴리프로필렌 원뿔형 튜브의 무게에 주목하십시오. 수확된 벌레가 들어 있는 얼어붙은 폴리프로필렌 튜브를 6밀리리터 표시 근처에서 자릅니다.

무균 상태에서. 약 6g의 냉동 지렁이 펠릿을 생각 샘플로 옮깁니다. 1나노그램의 내부 표준물질과 12ml의 얼음 저온 아세톤 식염수를 추가합니다.

BHT 믹스를 사용하면 1.5 밀리리터의 웜 슬러리를 각 튜브에 12 개의 5 밀리리터 독립형 플라스틱 튜브에 잘 분배합니다. 0.7 밀리리터의 심각한 안정화 지르코늄 산화물 비드를 첨가하십시오. 필요한 경우 웜 현탁액을 균질화합니다.

9인치 목초지 피펫을 사용하여 10% 미만의 온전한 벌레를 얻으려면 1분 더 이 과정을 반복합니다. 비드가 아닌 균질산염을 4개의 10ml 원추형 유리관으로 조심스럽게 옮깁니다. 3개의 튜브에서 나온 구슬을 결합하고 BHT가 함유된 1ml의 아세톤 식염수로 세척합니다.

튜브를 포함하는 나머지 비드에 대해 이 세척을 반복합니다. 세척 용액을 얼음 위의 유리관에 옮깁니다. 다음으로, 균질액을 1000Gs에서 10분 동안 원심분리합니다.

섭씨 4도에서 각 튜브의 상등액을 깨끗한 10ml 유리 원추형 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 화학 후드에서 30초 동안 최대 속도로 각 튜브 소용돌이에 동일한 부피의 헥산을 추가합니다. 섭씨 4도에서 1000G에서 10분 동안 원심 주입 후.

2밀리몰 포름산에서 헥산과 중성하를 띤 지질을 포함하는 상부 단계를 버리고 하부 수성상을 산성화합니다. pH 스트립을 사용한 테스트에서 pH 3.5를 측정합니다. 이제 30초 동안 최대 속도로 각 튜브 소용돌이에 동일한 부피의 클로로포름을 추가합니다.

섭씨 4도에서 10분당 약 1000GS의 속도로 샘플을 원심분리합니다. 유리 피펫 팁을 하부 클로로포름 상에 삽입하고 튜브를 기울여 단단한 계면을 피하십시오. 4개의 튜브에서 추출한 추출물을 15ml 원뿔형 유리관 하나로 끌어당깁니다.

유리관의 공기를 질소 가스로 퍼지하고 영하 20도에서 24시간에서 2주 동안 배양합니다. 추출물을 해동한 후 남아 있는 유백색 수성 최상층이 있는 경우 폐기합니다. 새로운 과거 피펫 사용.

클로로포름을 화학 후드에 있는 라벨링된 테프론이 늘어선 절반 DRM 유리 바이알로 옮깁니다. 부드러운 질소 가스 흐름에서 유기 용매를 증발시키고 최대 2주 동안 섭씨 영하 20도에서 샘플을 보관합니다. 먼저, 메탄올 중 개별 참조 프로스타글란딘의 원액을 준비합니다.

이제 80% 메탄올에서 연속 희석하여 표준 곡선을 생성합니다. 다음으로, 분석을 위해 건조된 바다 우아함 지질 추출물을 80% 메탄올 200마이크로리터에 용해시킵니다. 20-50마이크로리터의 시료를 역상 컬럼에 주입하고 음이온 모드 ESI 인터페이스를 사용하여 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 그래디언트 분석을 수행합니다.

컬럼 유출물을 질량분석기에 도입합니다. 충돌 가스를 10전자 볼트로 설정합니다. 충돌 에너지는 마이너스 35 전자 볼트입니다.

섭씨 600도의 온도. -90의 디클러터링 전위와 -11의 세포 출구 전위는 분석 소프트웨어를 사용하여 추출된 샘플에 존재하는 다양한 종류의 프로스타글란딘을 분석하기 위한 표준 곡선을 생성합니다. 데이터를 처리하여 웜 추출물에 존재하는 프로스타글란딘을 식별합니다.

야생형과 뚱뚱한 3 돌연변이 벌레 추출물에 대한 조사 스캔은 315에서 360 원자 질량 단위의 질량 범위 내에서 이온의 전 세계 수준을 보여줍니다. 야생형 웜과 비교했을 때, 뚱뚱한 3 돌연변이는 F 3 클래스 프로스타글란딘에 의해 예시된 것처럼 대부분의 20 탄소 pfas가 부족합니다. 마스터 전하 비율 3 51이 회색으로 강조 표시된 경우 MRM 분석을 통해 다양한 종류의 프로스타글란딘을 식별할 수 있습니다.

예를 들어, F1 클래스 프로스타글란딘은 야생형 추출물뿐만 아니라 머무름 시간이 더 큰 여러 다른 소수성 화합물에 존재하며, 질량 전이가 다양하면 F, 2 및 F 3 클래스 프로스타글란딘에 대한 추가 분석을 할 수 있으며, 이는 웜 추출물이 각 클래스의 여러 프로스타글란딘 이성질체를 포함하고 있음을 나타냅니다. 바다 우아함 프로스타글란딘과 표준 프로스타글란딘의 충돌 유도 분해를 비교하여 제품 이온에 매핑하는 데 사용할 수 있습니다. 예상되는 분열 부위. 지질 산화를 방지하기 위해.

적절한 예방 조치를 취하는 것을 잊지 마십시오. 예를 들어, 표시된 용액에 항산화제 VHT를 첨가하고 질소 가스로 추출물을 퍼지합니다.