MBP 기반 태깅 전략에 의해 Mgm101 재조합 단백질의 제조

본 절차의 전반적인 목표는 말토스 결합 단백질(maltose binding protein) 또는 MVP 태깅 전략을 사용하여 MGM 1 0 1과 같은 거대 올리고머 DNA 결합 단백질을 준비하는 것입니다. 이를 위해 먼저 e coli에서 발현시키기 위해 PMLC two E 벡터 내 MVP 하단에 MGM 1 0 1 오픈 리딩 프레임을 클로닝합니다. 그 후 AMLO 친화성 크로마토그래피를 통해 e coli로부터 M-V-P-M-G-M 1 0 1 융합 단백질을 정제합니다.

그 다음, 단백질 분해 절단을 통해 MVP로부터 MGM 1 0 1을 방출시키고, 양이온 교환 크로마토그래피로 MVP와 분리합니다. 마지막으로, 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 MGM 1 0 1 링을 균질하게 정제합니다. 최종적으로 약 0.8 milligrams의 수용성 MGM 1 0 1을 얻습니다.

1리터의 박테리아 배양액으로 미토콘드리아의 DNA 복구에 중요한 이 단백질의 생화학적 및 구조적 특성 분석을 수행할 수 있습니다. MGM 1 0 1의 몰탈 결합 단백질 태그 버전을 사용하는 주된 장점은 태그가 없는 버전에 비해 독성이 적고 용해도가 높으며 더 안정적이라는 점입니다. 그 결과, E. coli에서 천연 MGM 1 0 1 단백질을 고발현시킬 수 있습니다.

안녕하세요, 제 이름은 Sarah Vicki입니다. 저는 여기 SUNY Upstate Medical University의 Dr.Jji TEN 연구실에서 수석 연구 지원 전문가로 근무하고 있습니다. 저와 동료인 wan Wong이 이제 MGM 1 0 1의 발현 및 정제 과정을 시연하겠습니다. PCR을 사용하여 성숙한 MGM 1 0 1 코팅 서열을 증폭함으로써 융합 단백질 생성을 시작하십시오.

절단되는 것으로 알려진 MGM 1 0 1의 처음 22개 아미노 말단 잔기는 포함하지 마십시오. 미토콘드리아로 도입된 후, 증폭된 MGM 1 0 1은 발현 벡터 PM MAL C two E의 변형 버전에서 말토스 결합 단백질 또는 MVP를 인코딩하는 MAL E 서열의 하류에 배치됩니다. 이를 통해 정밀 프로테아제(precision protease)의 절단 부위를 포함하는 링커가 있는 M-V-P-M-G-M 1 0 1 융합 단백질이 생성됩니다. 플라스미드는 청백 선별(blue white selection) 없이 e coli 형질전환체를 선택하여 먼저 구축합니다.

결과물인 플라스미드 pPLC2E, MGM101을 E. coli 균주 BL21(DE3) RIL에 도입한 후, ampicillin과 chloramphenicol이 포함된 LB 플레이트에서 배양합니다. 먼저 신선한 보충 LB 배지 10 mL에 E. coli 형질전환체를 접종하여 37 °C에서 200 RPM으로 흔들어주며 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 사전 배양액 10 mL를 보충 LB 배지 2 L에 접종합니다.

세포를 37 °C에서 진탕 배양합니다. OD 600이 0.5에 도달하면, IPTG를 최종 농도 0.3 mM이 되도록 첨가하여 M-B-P-M-G-M 1 0 1 융합 단백질의 발현을 유도하고, 30 °C에서 5시간 동안 진탕 배양합니다. 5시간 후, 배양액을 500 mL 원심분리 병으로 옮긴 후 원심분리를 통해 세포를 회수합니다.

상층액을 제거한 후, 프로테아제 억제제가 포함된 용해 버퍼 30 milliliters를 첨가하고 피펫팅으로 세포 펠렛을 재현탁합니다. 다음으로, 세포 현탁액을 얼음 위에서 20초 동안 초음파 처리합니다. 50% 듀티 사이클의 초음파 처리기를 사용하여, 세포를 얼음 위에서 30초 동안 냉각시킵니다.

그 후 초음파 처리와 냉각 단계를 두 번 더 반복합니다. 현탁액을 얼음 위에 둔 상태에서, 2 mg/mL 농도의 용액 1 mL를 추가합니다.

DNA stock 1을 4 °C에서 2시간 동안 세포 용해물과 함께 흔들어 섞습니다. 2시간이 지난 후, 용해물 36 mL에 5 M 염화나트륨 4 mL를 첨가하여 최종 염 농도를 500 mM로 조정합니다.

그런 다음 세포 파편을 제거하기 위해 4°C에서 10,000 ×g로 30분 동안 원심분리합니다. 상층액을 새 튜브로 옮깁니다. 이 단계에서 20 µL의 분취액을 사용하여 초음파 파쇄의 용해 효율을 모니터링할 수 있습니다.

SDS-PAGE 젤 상에서 확인합니다. 다음으로, 세포 용해물을 아밀로스 컬럼에 통과시킵니다. MVP MGM 1 0 1 융합 단백질을 정제하려면, 먼저 15 mL 원추형 튜브에 50% AMLO 수지의 슬러리 1.5 mL를 첨가하는 것으로 시작합니다.

그런 다음 평형을 맞추기 위해, 13 milliliters의 lysis buffer를 첨가하고 2000 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 이 세척 과정을 4회 더 반복한 후, 0.75 milliliters의 lysis buffer에 레진을 재현탁합니다. 평형화된 AMLO 슬러리를 세포 용해물에 첨가하고 4 °C에서 하룻밤 동안 부드럽게 섞어줍니다.

다음 날, 용해물-아밀로스 레진 혼합물을 저온실에 설치된 econo 컬럼 크로마토그래피 컬럼에 로딩합니다. 스톱콕을 열어 결합하지 않은 단백질이 중력 여과를 통해 수집 튜브로 내려가게 합니다. 그 다음, 세척 버퍼 1 300 milliliters를 첨가하여 AMLO 레진을 세척합니다.

용액이 모두 통과되면, 150 milliliters의 세척 버퍼 2(wash buffer two)로 세척 과정을 반복합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 용출 버퍼(Ellucian buffer)를 첨가하고 EIT를 수집한 후, EIT의 일부를 SDS page gel에 로딩하여 M-V-P-M-G-M 1 0 1의 수율과 순도를 결정합니다.

겔 전기영동 후 쿠마시 염색을 수행하면 약 70 kilodaltons의 주요 단일 밴드가 나타나야 합니다. M-V-P-M-G-M 1 0 1 EITs에 50 units의 precision protease를 첨가하고 투석 버퍼가 담긴 투석 튜브에 넣습니다. 4 °C에서 하룻밤 동안 절단 반응이 진행되도록 둡니다.

이전과 동일하게 SDS page 젤을 실행합니다. 절단 효율을 평가할 때, 완전한 절단이 이루어지면 MVP와 MGM 1 0 1에 해당하는 42 및 28 kilodaltons의 두 밴드가 나타나야 합니다. 절단된 MVP MGM 1 0 1을 BioRad biologic DUO flow FPLC 시스템에 연결된 bio scale mini macro prep high S 카트리지에 여러 번 주입하여 로딩합니다.

염화나트륨의 농도를 5 mM, 300 mM, 500 mM, 750 mM, 1000 mM의 단계별 염 농도 구배(step salt gradient)로 적용하여 양이온 교환 크로마토그래피를 시작합니다. 이는 버퍼 A와 버퍼 B를 혼합하여 생성합니다. 유속은 0.5 mL/min으로 설정합니다. 분획 수집기를 사용하여 2 mL씩 분획을 수집하며, 일반적으로 MGM 1 0 1은 500 mM의 염 농도에서 용출됩니다.

MGM 1 0 1 피크의 분획들을 결합하고 SDS page 겔에서 단백질의 순도를 확인합니다. 양이온 교환 크로마토그래피에서 얻은 단백질 분획들을 결합한 후, 4 °C에서 하룻밤 동안 GF 평형 완충액으로 단백질을 투석시키면 MGM 1 0 1 피크는 약 28 kilodaltons의 단일 밴드를 보여야 합니다. 다음으로, 단백질을 Aveva spin 15 R ultra filtration 스핀 컬럼으로 옮기고 4 °C에서 3000 ×g로 원심 분리하여 단백질을 농축합니다.

부피가 약 1 mL로 농축되면, 크로마토그래피 버퍼로 평형화시킨 보정된 Superdex 200 Prep Grade 컬럼에 MGM 1 0 1을 로딩하고, 0.5 mL/min의 유속으로 크로마토그래피 버퍼를 흘려 크기 배제 크로마토그래피를 시작합니다. 거대 올리고머 단백질은 초기 분획에서 용출되는 반면, 작은 단백질은 후기 분획에서 용출됩니다. MGM 1 0 1 링은 약 400 kDa에서 용출됩니다.

분획 수집기를 사용하여 정제된 MGM 1 0 1 피크의 분획들을 수집하고, 단백질의 최종 품질을 확인하기 위해 해당 분획의 일부를 12% SDS-PAGE 젤에 로딩합니다. 다음으로, Aveva를 사용하여 단백질을 농축합니다. 4 °C에서 3000 ×g로 원심분리하여 스핀 다운합니다.

그런 다음 마이크로 원심분리 튜브에 담긴 단백질 분주액을 액체 질소에 2분 동안 담가 급속 동결시킵니다. 샘플을 -80 °C에서 6~12개월 동안 보관하십시오. 단일 가닥 DNA 결합 분석 및 투과 전자 현미경을 이용한 구조 시각화에는 MGM 1 0 1 샘플을 사용하십시오.

전기영동 이동성 변화 분석(electrophoretic mobility shift assay) 결과, 정제된 MGM 1 0 1이 단일 가닥 DNA에 대해 강력한 결합 활성을 가짐이 입증되었습니다. 단일 가닥 DNA 프로브는 올리고머 형태의 MGM 1 0 1에 의해 native 폴리아크릴아마이드 겔의 웰(well) 내에 점점 더 많이 잔류하게 됩니다.

M GM 1 0 1이 400 nanomolar 이상의 농도로 첨가됨에 따라 나타나는 현상입니다. 이 전자현미경 사진들은 M GM 1 0 1의 고차 구조 조직을 보여줍니다. 갓 준비된 M GM 1 0 1은 직경 20 nanometers의 뚜렷한 고리 형태로 존재하며, 이는 음성 염색 투과 전자현미경으로 확인할 수 있습니다.

4 °C에서 수주간 보관하면 MGM 1 0 1은 초분자 나선형 필라멘트를 형성합니다. 이 기술을 숙달하면 1주일 이내에 완료할 수 있습니다.

시청해 주셔서 감사합니다.