의 4D 좌석 Multimodality 이미징 Citrobacter rodentium 감염

이 절차의 전반적인 목표는 마이크로 CT가 통합된 복합 확산광 이미징 단층 촬영을 사용하여 감염에 대한 4D 동영상을 만들어 DUM 감염 주기가 0임을 모니터링하는 것입니다. 이것은 먼저 생물 발광 박테리아 접종물을 준비함으로써 달성됩니다. 절차의 두 번째 단계는 dunum이 없는 구강 배기로 마우스를 감염시키는 것입니다.

그런 다음 감염된 마우스는 D light micro ct를 사용하여 매일 이미지화되며, 마지막 단계는 3D DLI 마이크로 CT 데이터를 재구성하고 감염 주기의 4D 동영상으로 컴파일하는 것입니다. 궁극적으로, 결과는 감염된 마우스의 4D 다중 모드 이미징을 통해 박테리아 부하 분포 및 국소화의 변화를 보여줄 수 있습니다. 제임스 콜린스 박사.

제 연구실의 박사후 연구원이 오늘 이 절차를 시연할 예정입니다: 감염 전날 늦은 오후에 제로 데움 균주 IC 180의 극저온 바이알을 15ml의 박테리아 극저온 구슬에서 해동하자마자 해동하도록 했습니다. 마이신을 사용하면 220RPM에서 흔들면서 섭씨 37도에서 하룻밤 사이에 성장하도록 배양액을 설정할 수 있습니다. 또한 다음날 아침 중간 오염을 통제하기 위해 15ml의 접종되지 않은 LB를 배양합니다.

UN 접종 대조군이 탁하지 않은 경우 접종된 배양물을 50ml 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 10분 동안 4, 000RPM으로 원심분리하고 PBS 부피로 펠릿을 다시 올리고 원심분리를 반복합니다. 그런 다음 1.5ml의 PBS에 세포를 완전히 재현탁시켜 박테리아 접종물을 만듭니다. ICC 180 배양물이 생물 발광인지 확인하고 박테리아 수를 추정하려면 개방형 필터 생물 발광 이미징을 사용하여 ivus 스펙트럼 CT의 배양물을 이미지화하고 라이브 이미지, 4.3 0.1 wizard에서 자동 설정을 사용합니다.

이 내용은 이전에 게시된 비디오에 자세히 설명되어 있습니다. 생물 발광 설치류에 대한 마우스의 감염을 입증하기 위해 한 마리의 마우스를 감염시키고 한 마리의 마우스를 PBS에 대한 모의 감염에 사용할 것입니다. 감염을 수행하기 전에 XGI 8 마취 시스템을 사용하여 3%의 불소로 마우스를 마취하여 마취가 완전히 유지되는 동안 인도적인 제지를 제공합니다.

박테리아 접종물을 혼합하고 0.2ml 단위의 알려진 수의 박테리아를 구강 배당용 주사기에 주입합니다. 이제 목덜미를 단단히 잡아 감염되는 첫 번째 쥐를 회수하십시오. 텍스트 기사에 설명된 대로 detory 크림을 사용하여 이미징하기 전에 쥐가 고갈되었다는 점에 유의하십시오., 바늘을 입천장 쪽으로 밀어 혀를 지나 식도를 따라 내려간 다음 박테리아 접종물을 위에 주입합니다.

저항이 있는 경우 바늘에 무리한 힘을 가하지 말고 대신 폐에 접종물을 넣고 바늘을 부드럽게 다시 삽입하십시오. 그 후, 쥐가 숨을 쉬거나 걷는 데 문제가 있으면 모의 감염을 위해 안락사시켜야 합니다. 0.2ml의 PBS로 마우스를 가배지하여 구강 배가제가 올바르게 수행되었는지 확인합니다.

개방형 필터 생물 발광 이미징을 사용하여 IVUS 스펙트럼 CT에서 마우스를 이미지화하고 라이브 이미지에서 자동 설정을 사용합니다.4.3 0.1 이미징 마법사 앞에서 설명한 바와 같이 Delight 마이크로 CT는 낮은 방사선 선량 마이크로 CT 스캔과 통합된 기쁨 광학 이미징을 포함합니다. 선량은 각 이미징 세션의 동물을 축적하기 때문에 우리는 합리적으로 가능한 한 선량을 낮게 유지하는 것을 목표로 합니다.

이러한 우려로 인해 해로운 증상의 첫 징후가 나타나거나 마이크로 CT 영상 기간이 끝날 때 마우스를 호출해야 합니다. 이 연구를 위해 생체 내 박테리아 루시페라아제 이미징을 위해 살아있는 이미지 4.3 0.1에서 자동 노출 기능 매개변수를 최적화합니다. 먼저 편집을 선택하고, 그 다음에는 preferences를 선택하고, 그 다음에는 acquisition을 선택하고, 그 다음에 auto exposure window를 선택합니다.

다음으로, 범위 값과 실험 시간(초)을 선택하고 최대값을 300초로 설정합니다. 마지막으로 최소 대상 수와 발광을 선택하고 이 값을 10, 000 카운트로 설정합니다. 시스템이 초기화되면 마취가 설정되고 X-ray 안전 인터록이 점검됩니다.

마우스 마취를 진행합니다. 산소 유속이 분당 2리터이고 불소가 3%인 XGI 8 마취 시스템을 사용하십시오. 이미징을 위해 마우스를 준비하면 소프트웨어에서 이미징 마법사를 엽니다.

이 도구는 여러 매개변수를 자동으로 최적화하여 선택한 각 방출 필터에 대해 최상의 신호 대 잡음비를 제공합니다. 이미징 마법사에서 메시지가 표시되면 5 65 866 20 나노미터 방출 필터를 포함합니다. 그런 다음 원 마우스 마이크로 CT 스캔이 선택되었는지 확인하고 획득을 클릭하여 이미징을 시작합니다.

마취된 마우스를 케이지로 되돌린 후 스펙트럼 CT에서 단일 마우스 이미징 플랫폼을 제거하고 1%tri 유전자를 사용하여 동물 플랫폼을 소독합니다. 메모. 동물 플랫폼이 심하게 더러워진 경우 폼 패드를 교체할 수 있습니다. 감염 후 최대 8일까지 매일 마우스의 이미징을 계속하여 종방향 이미징 데이터를 생성합니다.

시험 기간이 길수록 누적 방사선 노출로 인한 인공물의 가능성이 높아집니다. 재현 가능한 고품질 3개의 DD light micro CT 재구성을 생성하려면 여러 단계가 필요합니다. 먼저 라이브 이미지 소프트웨어 4.3 0.1을 열고 찾아보기 창에서 찾아보기를 선택합니다.

로드를 클릭하여 delight micro CT 파일이 포함된 폴더를 엽니다. 라이브 이미지 브라우저에서 DLI micro CT 파일을 엽니다. 예를 들어, 감염 후 7일째 되는 날을 참조하십시오.

도구 팔레트에서 surface topography(표면 지형)를 선택한 다음 nude mouse(누드 마우스)를 선택합니다. 임계값을 조정한 다음 Generate surface(표면 생성)를 클릭합니다. 지표면 복원이 성공적으로 수행되면 3D 뷰 창에 지표면 윤곽이 표시됩니다.

3D 보기 창에서 렌더링된 마이크로 CT 스캔을 보려면 표면 윤곽을 숨기거나 표면 불투명도를 줄이십시오. 두 옵션 모두 먼저 3D 광학 도구를 선택하여 액세스할 수 있습니다. 그런 다음 디스플레이 표면 개체를 선택 취소하거나 불투명도 슬라이더 막대를 조정하여 세 가지 DD 조명 재구성에 대한 자세한 해부학적 위치 파악을 제공합니다.

동물 골격을 참조하여 3D 체적 데이터를 변경합니다. 최적의 대비로 스켈레톤을 보려면 3D 다중 모드 도구를 클릭하고 뼈만 명확하게 보일 때까지 히스토그램 슬라이더를 오른쪽으로 조정합니다. 그런 다음 아직 선택하지 않은 경우 로그 히스토그램, 역 색상 지정, 그라디언트 조명 품질 및 노이즈 제거를 클릭합니다.

원하는 경우 이미지를 잘라 도구 팔레트에서 3D 복원에서 원하지 않는 구조를 제거하고 D 라이트 3D 복원을 선택합니다. 5 60 5 86 백 6 20 나노 미터 필터 만 선택했는지 확인하십시오. 그런 다음 시작을 클릭합니다.

이렇게 하면 2D로 이미지화된 마우스의 스펙트럼 필터링된 생물 발광 신호가 있는 데이터 미리보기 창이 열립니다. 이러한 신호는 소프트웨어에 의해 자동으로 임계값이 지정되지만 필요한 경우 메뉴 하단의 탭을 사용하여 수동으로 조정할 수 있습니다. 임계값은 재구성에 데이터로 포함될 최소 데이터 강도를 결정합니다.

다음으로 도구 팔레트에서 D light micro CT 3D reconstruction을 선택하고 광학 속성을 확인합니다. properties 탭을 클릭하면 조직 속성을 마우스 조직으로, 소스 스펙트럼을 bacteria로 설정해야 합니다. 이제 reconstruct를 클릭하여 D light reconstruction을 수행합니다.

빨간색 원으로 표시된 D 광 신호의 실제 위치는 골반 거들 내에 있습니다. 이것은 영화 중에 이미지가 회전할 때 더 쉽게 해석할 수 있습니다. DLI 마이크로 CT 3D 동영상을 생성하려면 도구 메뉴로 이동하여 3D 애니메이션 프리셋 애니메이션, 시계 반대 방향 축, 총 재생 시간을 선택합니다.

이 값을 10초 또는 초당 25프레임으로 설정합니다. 3D 애니메이션에 대한 설정이 올바르면 녹화를 누르고 DLI micro CT 3D 재구성을 VI 파일로 저장합니다. 비교할 수 있도록 동일한 설정을 사용하여 이러한 재구성을 만드는 것이 중요합니다.

초당 프레임 수와 총 지속 시간을 동일하게 사용하여 비디오를 만드는 것도 중요합니다. 그렇지 않으면 40 비디오의 타이밍이 균일하지 않습니다. 컴퓨터에서 Windows Live 무비 메이커를 열고 새 파일을 만듭니다.

DLI 마이크로 CT 재구성을 감염 후 첫날부터 시간순으로 삽입합니다. 도구 탭을 사용하여 비디오를 선택하고 홈을 선택한 다음 캡션 추가를 선택하여 모든 비디오의 시작 부분에 캡션을 추가합니다. 캡션의 텍스트는 도구 모음에서 서식을 지정할 수 있으며 캡션의 위치도 조정할 수 있습니다.

이제 홈을 클릭한 다음 제목을 클릭하여 제목 페이지를 추가합니다. 도구 모음을 사용하여 상자에 제목을 입력하여 텍스트 서식을 지정합니다. 그런 다음 프로젝트를 MMP 파일로 저장합니다.

이것은 영화를 수정하려는 경우 필수적입니다. 마지막으로 무비 메이커 메뉴에서 영화를 WMV 파일로 저장하고 영화 저장을 선택한 다음 좋은 기술에 필수적인 네 가지 컴퓨터 옵션 컨트롤을 선택합니다. 생쥐를 감염시키기 전에, 사용된 박테리아 접종물은 생물 발광으로 확인되었습니다.

생물 발광이 있는 구강 배가 설치류를 관찰한 후, 흰색 화살촉으로 표시된 동물의 위장에서 신호가 관찰될 수 있고 폐에는 없는지 확인했습니다. 동일한 마우스가 개별 감염의 후속 예에 표시됩니다. 무의치는 감염이 입증된 동안 장 내강에 국한된 세포 외 병원체입니다.

따라서 대변에서 배출되며, 분석된 바에 따르면 감염이 매일 최고조에 달하는 2일째부터 6일 또는 7일째까지 집락화가 증가한다는 것을 보여주었습니다. D light micro CT는 골격을 해부학적 참조로 사용하여 이 마우스 내 생물 발광 박테리아의 공간 분포를 평가하는 데 사용되었습니다. 감염 후 3일째에는 결장에서 파란색 화살표로 표시된 작은 생물 발광 병소가 관찰되었습니다.

이러한 병소는 감염 후 5일째까지 생물 발광 강도의 완만한 증가를 보였으며 감염 후 7일째에는 공간 분포의 변화가 거의 없었으며, 생물 발광의 현저한 증가와 생물 발광 병소가 결장 전체에 퍼졌습니다. 감염 후 1일차부터 8일차까지 3번의 DD 광 마이크로 CT 재구성은 혈청 감염의 확산을 보여줍니다. 세균 감염은 위장관 근위부 내에서 뚜렷한 병소로 시작됩니다.

3일째가 되면 감염이 결장으로 퍼집니다. 그 후 며칠 동안 감염 확산의 초점은 규모와 수가 더욱 커졌습니다. 감염은 7일째에 최고조에 달합니다.

그런 다음 8일째에 군체는 근위부 및 원위 결장에서 두 개의 별개의 박테리아 병소로 감소했습니다. 이 기술을 통해 연구자들은 박테리아 집락 및 감염 메커니즘을 실시간으로 연구하고 중재 전략의 효과를 조사할 수 있습니다.