Name: 나이브 CD4의 아데노 바이러스 형질은 Treg의 분화를 연구하는 세포를 T (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 33 s
Description: 배우세요 아데노바이러스 형질도입을 이용하여 순수 CD4 T 세포에서 유전자를 과발현시키고 Treg 분화를 유도하는 방법을. 이 기술은 면역내성 연구에 필수적인 초기 분자 메커니즘을 분석하는 데 활용됩니다.

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저자는 고정 프로토콜의 제공에 pCAGAdDU 벡터와 올리버 고르 카 구축을위한 Lirui 뒤 감사드립니다.

1. 입력 벡터에 관심 유전자의 클로닝 <ol><li> 입력 벡터로 관심의 유전자를 복제합니다. 국소 이성화 효소 결합 벡터 (예 : pENTR / D-TOPO) 또는 제한 효소 중재 복제이 절차를 사용할 수 있습니다에 무딘 엔드 내고 다음 유전자의 PCR 증폭. </li></ol> 2. pCAGAdDu 대상 벡터에 관심있는 유전자를 전송 <ol><li> LR 재조합 (예 : 게이트웨이 LR Clonase II 효소 믹스)하여 대상 벡터에 입력 벡터의 관심의 유전자를 전송합니다. 이 아데노 바이러스 발현 벡터 (그림 1)을 생성합니다. </li><li> , PACI 제한 다이제스트에서 아데노 바이러스 발현 벡터의 10 μg을 선형화 DNA를 침전하고 100 μL 당 μg의 농도로 물에 resuspend을. 선형화 V의 복제 및 encapsidation에 필요한 바이러스 거꾸로 반복 (ITR)를 줘라바이러스 입자에 iral DNA. </li></ol> 3. 기본 바이러스 해물의 생성 <ol><li> 시드 1 개 6 잘 플레이트 잘 하나 2 ㎖ 세포 배양액 10 5 HEK293A 세포 (DMEM 10 % FBS, 5 % PenStrep)와 6의 세포를 배양 - 37 14 시간 10 % ° C CO 2 배양기 그들을 준수 할 수 있도록합니다. 세포는 자랄 때 약 50 %이어야한다. </li><li> Lipofection : 전송 염화나트륨 50 μM, 소용돌이 짧게 94 μL로 jetPEI 시약 6 μL. 소용돌이로 교반하면서 100 ㎕의 선형화 된 아데노 바이러스 벡터의 혼합 용액을 추가하고 15이 형질 혼합 배양 - 실온에서 30 분. </li></ol> 아데노 바이러스 감염에 대한 적절한 바이오 안전성 조건에서 다음의 모든 단계를 수행합니다! <ol start="3"><li> HEK293A 세포 함유도에 적가 솔루션을 분배하고 37 세포를 품어 ° C와 10 % CO 2. 형광 마커를 사용하는 경우, transfe를 평가시각적 12 후 ction의 효율 - 거꾸로 형광 현미경을 사용하여 36 시간. 신선한 매체의 0.5 ML 3 일마다 추가합니다. </li><li> 분리하기 시작 확대와 둥근 세포 영역입니다 변성 효과 (CPE)에 대한 빛 또는 형광 현미경을 가진 3 일 - 매 2를 확인합니다. 이 효율적으로 바이러스 생성을 나타내는 것입니다. CPE의 넓은 영역 (그림 3)의 발생에 따라, 그것은 24 소요됩니다 - 72 시간 모든 세포가 감염되기 전에. </li><li> 모든 세포는 CPE의 흔적을 보여 주지만, 세포의 전반적인 박리가 발생하기 전에, 상층와 부드러운 피펫 및 전송 세포 (SN, 3-5 ml)에 의해 세포를 분리 할 때 15 ML의 폴리스티렌 튜브. </li><li> 15 드라이 아이스의 SN에 세포를 동결 - 20 분 파열 세포에 ° C 이후 37 신속하게 해동. 이 동결 및 해동 사이클 (F / TC)를 두 번 더 반복합니다. 일 안에 사용을 위해 얼음에 기본 바이러스 해물을 유지 또는 -80 ° C 장기 저장을 위해 동결. 추가 F/ TC 30에 의해 바이러스 역가를 줄일 수 있습니다 - 50 %. </li></ol> 4. 바이러스 증폭 <ol><li> 씨와 14 센티미터 조직 배양 접시에 90 %의 합류로 HEK293A 세포를 성장. </li><li> 기본 바이러스 해물 (1.5-2.5 ML)의 절반 세포를 감염 적어도 36 시간 동안 세포를 품어. 거의 모든 세포는 형광 현미경에 의해 결정 될 수있는 다음 감염해야한다. 이미 (더 집중 즉) 증폭 된 바이러스 주식의 재 증폭, 50의 감염의 다중성 (MOI) (6.3 참조) HEK293A를 감염. </li><li> 그들 모두는 CPE를 표시하지만, 분리되기 전 세포를 수확해야한다. 효율적인 바이러스 생산이 상태는 감염 후 48 시간 이내의 거리에 있습니다. (이것은 1 주일까지 소요되는 경우, 4.2에 설명 된 감염에 사용되는 아데노 바이러스 주식의 양을 증가 증폭의 또 다른 라운드를 고려한다.) </li><li> 50 ML의 폴리스티렌 튜브에 부드러운 피펫 및 전송 세포와 SN하여 세포를 분리. 4 10 분 ° C.에 대한 300 XG에서 세포를 스핀 다운 </li><li> SN를 제거하고 중간 SN (ca. 1 ML)의 적절한 볼륨 펠렛을 resuspend을. </li><li> 4 ℃에서 15 분 800 XG에서 세포와 원심 분리를 방해하는 3 F / TC를 수행 (집중 바이러스 해물 즉) 바이러스 입자를 포함 SN을 벗고 나누어지는 바이러스 해물은 -80를 저장 ° C. </li></ol> 5. 바이러스 역가 결정 <ol><li> 씨앗 10 5 A549 세포를 잘 당에 1 ML 매체와 세포가 6 시간 동안 준수하게에 12 잘 플레이트의 5 우물. </li><li> 중간에 시리얼 희석 (1:5,000, 1:10,000, 1:50,000, 1:100,000)을 수행하고, 잘 당 10 μl를 추가하는 집중 아데노 바이러스 (얼음에 해동) 1 μl를 사용합니다. 유동 세포 계측법에 게이트를 조정 한 잘 감염되지 않은 둡니다. </li><li> 36 시간 후, PBS 및 분리 세포 (예를 들어, 트립신에 의해)로 씻어, SN를 벗어. 생물주의 사항은, 그것은 C를 해결하는 것이 좋습니다10 실온에서 분간 PBS 한 번에 세척을위한 PBS 100 μL 4 % 파라 포름 알데히드의 ELL 학생. </li><li> 감염 마커 표현의 FACS 분석을 수행합니다. 플롯 감염된 세포의 절대 수 (그림 4)에 &#39;μL 바이러스 해물 적용된&#39;. 감염의 선형 범위를 결정하고 X = 1,000 μL를 사용하여 선형 범위의 표준 곡선으로부터 희석 바이러스의 ML 당 역가를 계산합니다. </li></ol> 6. T 세포 감염 <ol><li> 에서 휴식 / 순진 CD4 T 세포를 분리 DO11.10 TG, MACS (나이브 CD4 + T 세포 분리 키트 II) 또는 FACS는 정렬을 사용하여 CARΔ1 TG 마우스 (CD4 + CD25-CD62L + CD44-). </li><li> 소규모 실험, 96 - 웰 둥근 바닥 플레이트 잘 하나에 MOI 50를 달성하기 위해 바이러스 해물의 적절한 볼륨을 피펫. </li><li> T 세포 배지에 50 μL의 최종 감염 볼륨 (RPMI1640, 10 % FBS, 5 % PenStrep, 5 % NaPyruvate, 1X NEAA, 1X MEM 필수에 4 × 10 5 T 세포를 추가비타민, 1X L-글루타민, 1:250,000 메르 캅토 에탄올, 10 MM HEPES). 예를 들면 : MOI 50는 3 × 10 5 T 세포를 감염하는 데 사용되어야한다; 바이러스 역가가 3 × 10 9 ML -1 바이러스 양 = MOI X T / 휴대폰 번호 / 바이러스 역가 = 50 × (3 × 10 5) (3 × 10 9 ML -1) = 0.005 ML </li></ol> 참고 : 느슨한 컵 (튜브 당 TP 3 ML까지)와 폴리스티렌 튜브 10 6 순진 T 세포 당 165 μL의 감염 볼륨 MOI 50를 사용하여 큰 세포 수, 규모의 감염. <ol start="4"><li> 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 90 분 동안 세포를 품어. </li><li> 상온에서 5 분 300 XG에서 세포를 스핀 다운, 200 μl의 PBS에 resuspend을 SN을 벗어. 다시 원심 분리 SN을 벗어. </li></ol> (선택 사항 : 세포를보다 효율적으로 바이러스를 제거하기 위해 다시 세척 할 수있다) <ol start="6"><li> 세포를 resuspend200 μL T 세포 자극 항체가없는 및 IL-2 또는 다른 사이토 카인없이 중간 37 40 시간 동안 그들을 나머지 5 % CO 2 배양기에서 ° C가 활성화되기 전에 그 유전자의 발현을 허용합니다. </li></ol> 7. T 세포 활성화 및 편광 <ol><li> 의 볼륨 항 CD3와 작은 시약 컵에 휴대폰 번호 (예 : 4 × 10 5)에 해당 안티 CD28 결합 비즈를 피펫, PBS의 10 배 볼륨을 추가하고 2 분 동안 자석에 올려 . 상층 액을 취하여 200 μL 편광 매체 구슬 (Tregs의 경우 : T 세포 배지 + 1 NG / ML TGFβ, 100 U / ML IL-2) resuspend을. </li></ol> 참고 : 셀은 또한 안티 CD28 및 안티-CD3 항체로 코팅 조직 배양 접시를 사용하여 활성화 할 수 있습니다, 또는 알부민 323-339 펩타이드 항원 펄스 조사 BALB / C 비장 세포를 사용하여 DO11.10 T 세포 수용체 특정 방식으로합니다. <ol start="2"><li> Centrifug전자는 이전과 같이 세포를 휴식, 200 포함 μL 편광 중간 항 CD3를 및 안티 CD28 항체 결합 비즈 SN과를 Resuspend 세포를 벗어. 매체를 변경하지 않고 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 72 시간 동안 배양한다. </li></ol> 8. T 세포 고정 및 유동 세포 계측법에 대한 염색 <ol><li> 세포를 씻으 : 상온에서 5 분 300 XG에서 세포를 스핀 다운, 200 μl의 PBS에 resuspend을 SN을 벗어. 다시 원심 분리 SN을 벗어. 따라서 다음의 모든 세척 단계를 수행합니다. </li><li> 100 μL 고칠 수 죽은 세포 염색 용액에 세포를 resuspend을 4에서 30 분 동안 품어 ° C. </li><li> 세포를 씻으, 100 μL PBS에 resuspend을, PBS, RT에서 부화 15 분에 100 ㎕의 4 % 파라 포름 알데히드를 추가합니다. </li><li> 세포를 씻으, PBS 200 μL 얼음처럼 차가운 70 % 메탄올에서 그들을 resuspend을하고 얼음에 30 분간 배양한다. </li></ol> 참고 : 세포 생물주의하지 않고 지금부터 취급 할 수 있습니다!<ol start="5"><li> 60 μL의 마스터 믹스 60 μL PBS + 10 ㎍ / ㎖ FC-블록 (불특정 바인딩을 차단하는 안티 FCR3). 준비 세포를 씻어 PBS + 안티 FCR3의 40 μL에서 그들을 resuspend을하고 RT에서 15 분 알을 품다. </li><li> 20 μl를 추가 PBS + 안티 FCR3 1 μg PE-결합 방지 Foxp3의 항체를 포함, ° C 하룻밤 4에 잘 혼합 배양. </li><li> PBS로 두 번 세포를 씻으과 흐름 cytometer에 대한 세포를 분석 할 수 있습니다. </li></ol>

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</ol>

저자는 이익에 대한 갈등을 선언하지 않습니다.

바이러스 생성 및 적정 최적의 형질 결과, 선형화 된 벡터의 질과 양이 가장 중요 나타납니다. 감염이 빠르게 번 효율적인 바이러스 생산이 발생 진행할 것이기 때문에 우리는 문화의 초기 전면에 자라 난의 기본 해물 생산에 부정적인 영향을 관찰하지 않았다. 그러나 HEK293A 세포에 의해 바이러스 생산 효율을 감소 긴 삽입에 의해 영향을받을 수 있습니다. 일부 오픈 읽기 프레임은 실제로 바이러스의 생산을 방해 발견되었다. 이 바이러스 주식은 일반적으로 증폭 여러 라운드를 통해 구조 될 수 있으며, 단 몇 오픈 읽기 프레임은 바이러스 제품과 호환되지 않는 것으로 밝혀졌다. 5 × 10 10 감염성 입자 / ML - 우리의 경험에서, 바이러스 증폭 감염 후 48 시간 이내에 CPE의 모양은 일반적으로 약 1 × 10 9 바이러스 해물을 얻을 것입니다. 나이브 T 세포의 아데노 바이러스 감염 <p...

Tregs의 면역 관용을 유지하고 지나친 면역 반응을 저해하는 중요합니다. Tregs의는 방관자 T 세포의 활성화를 억제합니다. 따라서, Tregs의의 제거가 활성화 된 T 세포 1에 의해 구동 치명적인자가 면역과 자기 파괴에 이르게한다. Tregs의는 CD4 단일 긍정적 인 전구체의 부정적인 선택시 흉선에서 개발하지만, 그들은 또한 차선의 공동 자극 1,2 낮은 복용량 항원의 자극에 따라 순진 CD4 T 세포에서 주변에 구별 할 수 있습니다. 주변 Tregs의이 용기 나 폐에 내성을 제공 연루되어있다 반면 흉선 Tregs의는 자기 항원에 대한 조직의자가 면역을 억제하는 것 같습니다. 이러한 유도 Tregs의이 유력 음식과 공기, 공생 세균 및 알레르기 3,4에서 환경 항원을 포함하여 점막 외국 항원을 인식 한 후 T 세포의 활성화를 방지합니다. 또한, Tregs의 태아 펩티드에 산모의 허용 오차 5를 구축하고 사전에 중요하다환기 이식편 대 숙주 질환 6. 동시에, Tregs의도 7,8 종양 세포의 면역 감시를 감쇠에 의해 원치 않는 효과를 중재. Tregs의의 특징 기능은 하위 - 지정하는 전사 인자 Foxp3의 필요와 기능 9,10 Treg 부여하기에 충분 포크 헤드 도메인을 포함하는 전사 인자의 표현이다. Foxp3의 발현을 유도 할 수있는 몇 가지 신호 전달 경로가 알려져있다. 하지만, 제어, 규제, 또는 트리거 T 세포 수용체에 대한 응답으로 차별화를 Treg 조절하는 분자 프로세스는 덜 잘 이해하고 있습니다. Tregs의 매우 효율적으로 TGFβ와 IL-2 (11)의 존재 반대로 CD3와 anti-CD28 항체 순진 CD4 T 세포의 자극을 통해 체외에서 유도 할 수 있습니다. 새로운 Tregs의 생체, Treg 분화를 촉진 분자의 조작에 기능적으로 미래 therapi에 대한 엄청난 잠재력을 품는다ES 예를 들어, 천식 치료, 크론 병, 및 이식 11,12. 반대로, Treg 차별화를 차단하는 분자의 치료 변조 종양 환자의 복합 치료의 향후 접근 방법의 이점을 제공 할 수 있습니다. 체외 분화 분석에서 T 세포 부분 집합의 분화와 관련된 분자 변화에 대한 설명은 쓸모있다. 순간, 검색 또는 제어 T 세포 분화가 자궁외 유전자 발현의 가장 일반적인 방법은 순진 T 세포에서 실패한다는 사실에 의해 방해되는 유전자 제품의 화면으로 실험하려고합니다. 예를 들어, 일렉트로와 레트로 바이러스 전달이 활성화 된 T 세포에만 효과가 있습니다. 초기의 기대, 휴식 세포에서 일반적으로 효과적입니다 렌티 바이러스 전달, 대조적으로 사이토 카인 13만큼 순진 T 세포의 사전 활성화가 필요합니다. 또한, 일렉트로 동안의 cDNA 또는 발현의 전송자체가 T 세포 활성화의 기능을 부여하고 심지어 칼슘 2 + 신호를 동원 할 수 세포막의 탈분극을 포함 하고 NFAT 단백질 (미발표 관찰과 REF. 14) 활성화합니다. 40 시간 - 마찬가지로, 레트로 바이러스 전달을 위해, 순진 T 세포는 18 활성화해야합니다. 이 시간 동안, 세포 분열의 과정에서 핵 막 고장이 발생하고 레트로 바이러스 벡터 15의 후속 게놈 통합 할 수 있습니다. 이러한 방법은 따라서 헬퍼 T 세포 분화의 결정적인 단계이다 항원과 초기 T 세포 발생의 초기 분자 규제를 해결 할 수 없습니다. 아데노 바이러스 전달은 인간의 콕 사키 아데노 바이러스 수용체 (CAR)을 표현하는 인간의 세포 유형의 숫자​​에 과도 자궁외 유전자 발현을 부여하는 것으로 알려져있다. 그것은 세포 활성화 또는 세포주기의 진행에 대한 요구 사항없이 진행됩니다. C의 표면 발현AR 효율적인 바이러스 부착 및 국제화를 위해 필수적이며, T 세포 특이 적 프로모터에 따라 절단 된 버전 CARΔ1의 유전자 발현 아데노 바이러스 감염 16에 감염 마우스 흉선 세포 및 T 세포를 렌더링하는 발견되었다. 중요한 유전자는 흉선 세포 발달을 변경하지 않거나 순진 CD4의 체외 분화 서로 다른 하위 집합으로 셀 (데이터 표시되지; 심판 17.) 마. T 세포의 아데노 바이러스 - 매개 형질는 이전에 접근 19,20 발현 17,18에 사용되며 노크 다운되었다. 형질 전환 된 T 세포는 시판 DO11.10 TG에서 정제 될 수있다 CARΔ1 TG (코닉, 주식 회사와 REF 17.). 중요한 것은, 아데노 바이러스 전달이 활성화 명백한 증거를 유도하지 않고 순진 T 세포에 대한 관심의 유전자의 고 발현 할 수 있습니다. T 세포는 순진 유지 (CD44 낮은 CD62L 높은)과 휴식 (CD25 - CD69 -) 후 infecti에 비에 감염된 세포와 유사한 Treg으로 활성화하고 차별화 할 수 있습니다. 재조합 아데노 바이러스 생산은 아데노 바이러스 플라스미드 (그림 1) HEK293A 세포의 형질 전환 한 후 얻을 수 있습니다. 이 플라스미드는 일반적으로 복제 무능한 재조합 아데노 바이러스 21을 렌더링 삭제 E1 및 E3 유전자와 인간 유형 5 아데노 바이러스 게놈을 포함합니다. 그들은 전단 아데노 바이러스 (22)의 안정적 통합을 통해 불후의 한으로 HEK293A 세포가 복제 결핍을 보완. 아데노 바이러스 벡터가 큰 (~ 40 KB) 결과적으로 잘 기존의 제한 효소 중재 복제에 적합하지 않습니다 때문에, 우리는 게이트웨이 시스템을 채택했다. 관심의 유전자는 처음에 쉽게 람다 재조합 반응 (LR) 23를 통해 아데노 바이러스를 대상 벡터에 전송 될 수있는 작은 입력 벡터로 복제됩니다. 우리는 pCAGAdDu 벡터를 생성원핵 ccdB 선택 마커 24 측면을 노릴 LR 사이트를 포함하는 발현 카세트 CAG 프로모터 (닭 액틴 프로모터 및 CMV 증강)을 결합하여. 이 발현 카세트 소 성장 호르몬 폴리 (A) 신호를 포함하는 시퀀스 융합 진핵 세포 감염 마커 강화 된 녹색 형광 단백질 (EGFP)의 coexpression 수 있도록 내부 ribosome 항목 사이트 (IRES) 요소가 융합되어 있습니다. 프로토 타입 CMV 프로모터가 매우 활성화에 의존하고 순진 T 세포의 유전자 발현 그러므로 불리한 것으로 발견 된 이후 우리는 CAG CIS 규제 시퀀스를 선택했다. 여기, 우리는 체외 Treg의 분화 효율을위한 프로토콜 및 활성화 (그림 2)하지 않고 순진 CD4 T 세포를 형질 도입하는 방법을 제공합니다. 방법은 자궁외 유전자 발현을 활성화하거나 순진 상태에서 위의 CD4에게 T 세포 분화를 노크. 그것은 overexpresse의 효과를 테스트 할 수 있습니다T 세포 부분 집합의 약속까지 초기 TCR 자극에 따라 초기 신호 이벤트 기간 동안 관심의 D 유전자. 우리의 검증 실험은 Th2 사이토 같은 살전 다른 T 세포 집합, Th9, Th17의, TH22, 또는 TFH 세포의 분화와 비슷한 아데노 바이러스 응용 프로그램을 구축하는 기초를 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>pENTR/D-TOPO 클로닝 키트</td><td>Invitrogen</td><td>K240020</td><td></td></tr><tr><td>Gateway LR Clonase II 효소 혼합물</td><td>Invitrogen</td><td>11791020</td><td></td></tr><tr><td>PacI</td><td>New England Biolabs</td><td>R057S</td><td></td></tr><tr><td>jetPEI</td><td>Polyplus-transfection</td><td>101-10N</td><td></td></tr><tr><td>HEK293A 세포주</td><td>Invitrogen</td><td>R705-07</td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>6웰 플레이트</td><td>BD Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>14cm 조직 배양 접시</td><td>Nunc</td><td>168381</td><td></td></tr><tr><td>BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CAR&Delta; 1)1Jdgr</td><td>Taconic Farms</td><td>모델 번호 4285</td><td></td></tr><tr><td>Naive CD4+ T 세포 분리 키트 II</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-094-131</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>41966-052</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>PAN Biotech</td><td>1502-P110704</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>BE12-167F</td><td></td></tr><tr><td>NaPyruvate</td><td>Lonza</td><td>BE13-115E</td><td></td></tr><tr><td>NEAA 100x</td><td>Lonza</td><td>BE13-114E</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 완충 용액 (1 M)</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-7522</td><td></td></tr><tr><td>MEM 필수 비타민 혼합물 (100x)</td><td>Lonza</td><td>13-607C</td><td></td></tr><tr><td>세포 확장 및 활성화를 위한 Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28</td><td>Invitrogen</td><td>114-56D</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 TGF-beta 1</td><td>R& D Systems</td><td>240B</td><td></td></tr><tr><td>Proleukin S (18 x 106IE)</td><td>Novartis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 고정식 블루 데드 셀 스테인 키트</td><td>Invitrogen</td><td>L-23105</td><td></td></tr><tr><td>마우스 BD Fc BlockT</td><td>BD Pharmingen</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>안티-마우스/랫 Foxp3 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-5773-82</td><td></td></tr><tr><td>Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA 분석</td><td>Roche Applied Biosystems</td><td></td><td></td>4427975</tr><tr><td>LightCycler 480 프로브 마스터</td><td>Roche Applied Biosystems</td><td>04902343001</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA 역전사 키트</td><td>Roche Applied Biosystems</td><td>4366596</td><td></td></tr></tbody></table>

나이브 cd4의 아데노 바이러스 형질은 treg의 분화를 연구하는 세포를 t

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

규제 T 세포 (Tregs의)는 자체뿐만 아니라 특정 외국 항원에 대한 면역 내성을 제공하기 위해 필수적입니다. Tregs의는 TGFβ와 IL-2의 존재 TCR과 공동 자극 체외 순진 CD4 T 세포에서 생성 할 수 있습니다. 이 미래의 치료를위한 엄청난 잠재력을지지하지만, 분자 신호 전달 경로 제어 차별은 대부분 알 수 있다고. 기본 T 세포는 자궁외 유전자 발현을 조작하지만, 일반적인 방법은 일차 항원 인식 이전에 T 세포의 가장 중요한 순진 상태를 대상으로 실패 할 수 있습니다. 여기, 우리는 Treg 분화를 유도하기 전에 체외에서 순진 CD4 T 세포의 이소성 유전자를 표현하는 프로토콜을 제공합니다. 그것은 복제 결핍 아데노 바이러스 전달을 적용하고 그 생성 및 생산을 설명합니다. 아데노 바이러스는 대량 삽입 (최대 7 KB) 걸릴 수 있습니다 및 높은 과도 overexp을 달성하기 위해 발기인을 장착 할 수 있습니다T 세포 ression. 그들은 형질 전환 콕 사키 아데노 바이러스 수용체 (CAR)을 표현하면 효과적으로 순진 마우스 T 세포를 transduces. 중요한 것은 감염 후 T 세포가 순진 유지 (CD44 낮은 CD62L 높은)과 휴식 (CD25 - CD69 -)과는 Tregs의에 감염되지 않은 세포와 유사한 활성화하고 차별화 할 수 있습니다. 따라서,이 방법은 처음부터 CD4의 T 세포 분화의 조작을 할 수 있습니다. 그것은 초기 TCR 자극의 초기 신호 이벤트가 결국 차별화를 Treg으로 이어질 세포 변화를 유도 할 때 자궁외 유전자 발현이 이미 보장합니다.

바이러스 생산 높은 바이러스 역가의 생성의 경우, 기본 바이러스 생산 또는 바이러스 증폭 HEK293A 세포 수확의 타이밍이 중요합니다. 바이러스 생산의 시각적 징후와 대표 형광 및 위상 콘트라스트 이미지는 그림 3에 표시됩니다. CPE는 십일 삽입하지 않고 제어 pCAGAdDu 벡터 HEK293A 세포의 형질 전환 한 후 관찰 하였다. CPE는 감염 마커 GFP의 높은 발현을 분리하고 전시하기 시작 확대와 라운드 업 세포와 영역의 모양을 특징으로하고 있습니다. CPE의 범위는 효율적으로 바이러스 생성을 나타내는 것입니다. 세포 배양과 유사한 CPE는 24 시간 이내에 수확 할 수 있습니다 보여 플레이트 - 72 시간, 그리고 원시 바이러스 해물은 동결 및 융해에 의해 생성 될 수 있습니다. 바이러스 역가은 다음 (그림 4) MOI 같은과 감염의 비교를 할 수 있도록 바이러스 해물 용액을 희석하여 확인할 수 있습니다. 선...

순진 CD4 콕 사키 아데노 바이러스 수용체의 유전자 발현과 T 세포에 아데노 바이러스 유전자 전달은 규제 T 세포 분화의 분자 분석을 가능하게<em&gt; 체외에서</em&gt;.

나이브 CD4의 아데노 바이러스 형질은 Treg의 분화를 연구하는 세포를 T

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

본 프로토콜은 나이브 T 세포(naive T cells)에 목적 유전자를 도입하여 형질전환시키거나, 이를 통해 조절 T 세포(regulatory T cells 또는 tregs)로 분화시키는 데 사용되는 감염성 아데노바이러스 입자 생산 워크플로우를 제공합니다. 먼저 목적 유전자를 아데노바이러스 목적 벡터(destination vector)에 클로닝합니다. 그 다음, 해당 벡터를 아데노바이러스 생산 세포주인 HC 2 93 A에 도입하여 감염성 아데노바이러스 입자를 생성합니다.이렇게 생성된 바이러스는 감염 후 아데노바이러스 수용체 트랜스진을 가진 마우스 유래 나이브 T 세포를 감염시키는 데 사용됩니다. 이후 세포를 휴지시켜 목적 유전자가 발현되도록 합니다. 나이브 T 세포의 경우, treg 분화를 유도하기 위해 분극화 조건에서 T 세포를 활성화합니다.그 다음, 세포를 고정하고 염색하여 유세포 분석을 수행합니다. 최종적으로, 과발현된 목적 유전자의 영향을 받을 수 있는 Treg 분화 마커인 Fox P3와 감염 마커인 GFP의 발현 결과물을 얻을 수 있습니다. 레트로바이러스 유전자 도입과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 나이브 T 세포에서 목적 유전자를 과발현시킬 수 있다는 점입니다.이는 T세포 활성화 시점에 높은 수준의 과발현이 나타나게 합니다. 이 방법은 조절 T세포 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, T-Rex 세포 정체성 확립의 기초가 되는 전사 후 유전자 조절에 관한 것입니다.관심 유전자를 엔트리 벡터(entry vector)에 클로닝하여 이 프로토콜을 시작하십시오. PCR로 증폭된 관심 유전자는 blunt 말단이며, 토포이소머라아제 결합 벡터인 P enter D topo에 라이게이션됩니다. 그 후, LR 재조합(LR Recombination)을 통해 관심 유전자를 P kakadu 목적 벡터(destination vector)로 이동시킵니다.이 벡터는 아데노바이러스 유전자와 내부 리보솜 진입 부위(internal ribosomal entry site) 또는 iris를 포함하며, 그 뒤에 GFP의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)이 이어져 감염 마커를 가진 아데노바이러스 발현 벡터를 생성합니다. 다음으로, 10 µg의 아데노바이러스 발현 벡터를 선형화합니다. PAC one 제한 효소 절단 후, DNA를 침전시키고 100 µL당 3 µg의 농도로 물에 재현탁합니다.선형화는 바이러스 DNA의 복제와 바이러스 입자로의 캡슐화에 필수적인 바이러스 역반복 서열 또는 ITR을 해방시킵니다. 다음의 모든 단계는 아데노바이러스 감염에 적절한 생물안전 조건 하에서 수행되어야 합니다. 공동 형질전환(cot transfection)을 위한 선형화 벡터를 준비하려면, 50 µM 염화나트륨 94 µL에 jet PEI 시약 6 µL를 옮긴 후 볼텍싱하십시오.간략히 설명하면, 볼텍싱을 하면서 혼합 용액을 100 µL의 선형화된 아데노바이러스 벡터에 추가합니다. 이 트랜스펙션 혼합물을 실온에서 15분에서 30분 동안 배양합니다. 다음으로, 6-웰 플레이트에서 50% 합류도(confluency)까지 성장시킨 HEK 293A 세포를 인큐베이터에서 꺼냅니다.HEC 2 9 3 A 세포가 포함된 웰에 용액을 한 방울씩 분주하고 37 °C, 10% CO2 조건에서 배양합니다. GFP 발현을 감염 마커로 사용하여 3일마다 0.5 mL의 신선한 배지를 추가합니다. 2~3일마다 도립 형광 현미경으로 형질전환 효율을 시각적으로 평가하고, 세포가 비대해지고 둥글게 변하며 떨어지기 시작하는 영역으로 나타나는 세포병성 효과(cytopathic effects)가 있는지 확인합니다.이는 효율적인 바이러스 생성의 지표입니다. 더 넓은 범위의 세포병성 효과(cytopathic effects)가 나타나면, 24에서 72시간 이내에 모든 세포가 감염됩니다. 모든 세포에서 세포병성 효과의 징후가 나타나되, 세포의 전반적인 탈착이 일어나기 전에 피펫팅을 통해 세포를 조심스럽게 수확하고 상층액과 함께 15 milliliter 폴리스티렌 튜브로 옮깁니다.세포를 파쇄하기 위해 현탁액을 드라이아이스에서 15~20분 동안 동결시킨 후, 37 °C에서 빠르게 해동합니다. 이 동결-해동 사이클을 두 번 더 반복합니다. 이렇게 파쇄된 세포 현탁액을 이제 1차 바이러스 용해물(primary virus Lysate)이라고 합니다.모든 바이러스 용해물을 얼음 위에 보관하십시오. 하루 이내에 사용하지 않고 장기 보관할 경우, -80 °C에서 냉동하십시오. 추가적인 동결-해동 주기가 반복될 때마다 바이러스 역가가 30%에서 50%까지 감소한다는 점에 유의하십시오. 일차 바이러스 용해물을 증폭하려면, 15개의 조직 배양 접시에서 90% 밀도로 성장시킨 HC 2 93 A 세포에 일차 바이러스 용해물의 절반을 감염시킨 후 최소 36시간 동안 배양하십시오.36시간 후 형광 현미경으로 감염 여부를 확인하며, 거의 모든 세포가 감염되어 있어야 합니다. 모든 세포에서 세포병성 효과가 나타나되 세포가 박리되지 않았을 때, 효율적인 바이러스 생산을 위해 완만한 피펫팅으로 세포를 수확합니다. 감염 후 48시간 이내에 이 상태에 도달하며, 세포와 상청액을 50 milliliter 폴리스티렌 튜브로 옮깁니다.세포를 4°C에서 300 G로 10분 동안 원심 분리합니다. 원심 분리 후, 상층액을 제거하고 펠렛을 적절한 부피의 배지에 재부유시킵니다. 1 mL당 10¹⁰ 범위의 타이터가 얻어져야 합니다.이전과 동일하게 세 번의 동결-해동 사이클을 수행하여 세포를 파쇄합니다. 그런 다음 4 °C에서 900 G로 20분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면, 이제 농축 바이러스 용해물이라고 지칭하는 상층액을 조심스럽게 크라이오 튜브로 옮깁니다.여러 번의 감염 실험을 위해 분주액을 만들고 -80 °C에서 보관하십시오. 마지막으로, 5 4 9 세포에서 감염 마커 발현의 fax 분석을 통해 바이러스 역가를 결정합니다. 동봉된 문서의 지침에 따라, 소규모 실험의 경우 이 프로토콜 단계는 car delta 1 형질전환 마우스에서 분리한 naive rusting CD four T 세포를 사용하여 수행합니다.96-웰 라운드 바텀 플레이트의 한 웰에 MOI 50을 달성할 수 있는 적절한 부피의 바이러스 용해물을 피펫팅합니다. 최종 감염 부피 50 µL가 되도록 최대 4 × 10⁵개의 T 세포를 추가합니다.중간 배지입니다. 이 설정을 통해 병렬적인 실험적 접근이 가능합니다. 세포를 5% carbon dioxide 인큐베이터에서 37 °C로 90분 동안 배양하십시오.배양 후, 상온에서 300 G로 5분간 원심분리하여 세포를 침전시킵니다. 원심분리가 끝나면 200 µL의 PBS에 세포를 재현탁하여 다시 원심분리한 후 상층액을 제거합니다. 자극 항체와 IL-2 또는 기타 사이토카인이 포함되지 않은 T 세포 배지 200 µL에 세포를 재현탁합니다. 그 다음, T 세포를 활성화하고 분극화하기 전 관심 유전자가 발현될 수 있도록 37 °C, 5% CO2 인큐베이터에서 40시간 동안 휴지시킵니다. T 세포를 활성화하고 분극화하기 위해, anti-CD3 및 anti-CD28 결합 비드를 작은 시약 컵에 피펫팅하여 넣습니다. 비드의 수는 세포 수와 동일해야 하며, 여기에 10배 부피의 PBS를 넣고 자석 위에 2분 동안 둡니다.다음으로, 상층액을 제거하고 재현탁합니다. 비드를 200 µL의 분극화 배지에 현탁하고, 침전된 세포를 실온에서 300 ×g로 5분간 원심분리합니다. 원심분리 후 상층액을 제거하고, 항체가 결합된 비드가 포함된 200 µL의 분극화 배지에 세포를 재현탁합니다. 배지 교체 없이 5% CO₂ 인큐베이터에서 37 °C로 72시간 동안 배양합니다. 염색 및 고정 프로토콜은 여기에서 간략하게 설명합니다.먼저, 세포를 PBS로 세척하고 고정 가능한 사멸 세포 염색 용액과 함께 배양합니다. 다시 한번 세척 단계를 거친 후, 세포를 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 고정하며, 고정 후에는 아데노바이러스 생물안전 예방 조치 없이 세포를 처리할 수 있습니다. 세포를 다시 세척하고 메탄올로 투과화합니다. 추가 세척 단계 후, 비특이적 결합을 차단하기 위해 세포를 anti FCR three와 함께 배양합니다.마지막으로, 세포를 anti FCR three 및 PE 결합 anti fox P three 항체와 함께 배양합니다. 고정 및 염색 과정 중 여러 번의 세척 단계로 인해 많은 세포를 손실할 위험이 있으므로, 손실을 방지하는 것이 중요합니다. 원심분리 직후 파이펫 팁으로 펠렛을 건드리지 않고 상층액을 제거하십시오. 세포 염색이 완료되면, PBS로 세포를 두 번 세척하고 유세포 분석기로 분석합니다.유세포 분석기의 96-웰 리더를 사용하면 동일한 96-웰 플레이트 내에서 T 세포의 감염, 분화, 고정 및 염색을 수행할 수 있어 여러 조건에 대한 병렬 분석을 위한 효율적인 워크플로우를 제공하지만, 아데노바이러스 감염이 T 세포 생존력 및 treg 분화에 미치는 영향을 평가하기 위해 표준 FACS 튜브에서 분석을 수행할 수도 있습니다. DO 1110 transgenic car delta one 형질전환 마우스에서 정제한 Naive T 세포를 서로 다른 MOI로 대조군 아데노바이러스에 감염시키고 treg 분화 유도 조건에서 활성화했습니다. 고정 및 염색된 세포를 유세포 분석법으로 분석하여 감염 마커의 발현을 확인했습니다.사멸 세포 염색 및 분화 마커인 FOX P3를 위한 GFP 도입 결과가 여기와 같이 나타났습니다. MOI를 1에서 50으로 높이면 감염된 세포의 비율이 증가합니다.세포 생존율이나 Treg 분화 모두에 영향이 없었으므로, 아데노바이러스 감염이 T 세포의 활성화 상태에 영향을 미치는지 확인하고자 하였다. 감염된 세포와 감염되지 않은 세포를 대상으로 FACS 분석을 통해 활성화 및 휴지기 마커의 발현을 분석하였다. 이후 세포를 Treg 분화 유도 조건에서 활성화시켰을 때, 감염된 세포와 감염되지 않은 세포 간의 이러한 마커 발현 수준은 구별되지 않았다.감염된 세포와 감염되지 않은 세포를 함께 분석했을 때, 활성화 마커의 상향 조절과 나이브 T세포 마커의 하향 조절 양상은 매우 유사했습니다. 이러한 데이터는 나이브 상태의 T세포 감염이 이후의 T세포 활성화를 방해하지 않음을 나타냅니다. 설명된 아데노바이러스 형질전환 프로토콜로 달성된 과발현 수준을 테스트하기 위해, 나이브 T세포를 microRNA 155 인코딩 아데노바이러스 또는 대조군 아데노바이러스로 MOI 50에서 감염시켰습니다. 세포를 40시간 동안 휴지시키거나, 40시간 동안 활성화시키거나, 또는 40시간 휴지 후 40시간 동안 활성화시켰습니다. cDNA를 생성하고, snRNA 202 대비 microRNA 155 발현량을 측정하였습니다.정량적 PCR 결과, 40시간 동안 휴지시킨 naive T 세포의 microRNA 1 55 과발현 수준은 내인성 microRNA 1 55 발현 수준과 일치합니다. T 세포 활성화 40시간 후, 해당 세포들의 활성화는 여전히 활성화 의존적인 microRNA 1 55 상향 조절을 유도합니다.이는 내인성 활성 유도 마이크로 RNA 발현에 더해, 아데노바이러스에 의한 나이브 T 세포의 높은 수준의 과발현을 보여줍니다. 클로닝 절차를 숙달하면 바이러스 생성 및 T 세포 감염을 4주 이내에 완료할 수 있습니다. 생성된 바이러스는 장기 보관하거나 3일 이내에 재증폭할 수 있습니다.이 절차를 수행할 때는 공벡터(empty vector)를 사용하여 모든 실험을 신중하게 대조군 설정하고, 아데노바이러스 감염 자체가 연구 대상 공정에 미치는 영향을 먼저 확인하는 것이 중요합니다. 아데노바이러스 감염 및 과발현은 일시적이며 약 5~7일 동안만 지속된다는 점에 유의하시기 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

우리는 retroviral 전달을 사용하여 항원 - 특정 마우스 T - 세포를 생산하는 프로토콜을...

마우스 T - 세포에서 T - 세포 수용체의 Retroviral 전달

우리는 한 인간의 혈액 기증자로부터 규제, 메모리 및 나이브 T 세포를 생성하는 방법을 설명합니다. 편광 Tregs 그때도 여기에 설명된 억제 분석을 포함한 유전자 균질성와 유전 및 기능 다양한 어플 리케이션의 다른 하위 집합을 비교할 수 있습니다.

기본 인적 나이브 및 메모리 T의 세포로부터 유도된 규제 T 세포의 생성

다른 T 세포의 하위 집합에서 별개의 이펙터 기능으로, TH17 세포는 중앙 염증성자가 면역 질환에 연루되어있다. 이 체외 TH17 분화 프로토콜은 순진 CD4 + T 림프구는 TH17 세포로 분화 할 수 있고, 또한자가 면역 및 호스트 응답에서 자신의 역할을 조사할지 여부를 결정하는 방법을 제공합니다.

분리 및 나이브 CD4 T 림프구의 TH17 분화

순진한 CD4+ T cell은 활성화 시점의 환경에 따라 다양한 subset으로 분극화합니다.  naive CD4+ T cell을 다양한 effector subset으로 분화하는 것은 T cell receptor stimuli 및 specific cytokine signal의 추가를 통해 in vitro에서 달성할 수 있습니다.

마우스 나이브 CD4<sup&gt; +</sup&gt; T 세포의 분리 및<em&gt; 시험관</em&gt; T 세포 하위 집합으로 차별화

여기에서는 바이러스에 감염된 미성숙한 림프구성 융모수막염 마우스에서 분리된 조절 T(Treg) 세포의 표현형을 분석하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 또한, Treg cell의 억제 활성을 평가하는 프로세스를 제공합니다.

표현형 및 만성 림프 구성 맥락 수막염 바이러스에 감염된 마우스에서 고립 활성화 규제 T 세포의 기능 분석

많은 실험 시스템은 면역 반응의 T 세포의 발달 및 기능을 조절하는 메카니즘을 이해하는 데에 이용되고있다. 여기 레트로 바이러스 형질 도입을 이용하여 유전 적 접근 경로를 규정하는 식별 경제적 시간 효율적이고, 무엇보다도 매우 유익하다 설명한다.

공부하는 유전 적 접근으로 헬퍼 T 세포의 레트로 바이러스 형질 도입은 메커니즘 자신의 차별화 및 기능 제어

이 프로토콜은 체외 나이브 CD4 + T 세포로부터 재생 가능한 생성 유도 인간 T 조절 세포 (iTregs)의 표현형을 설명한다. Foxp3의 유도를위한 다른 프로토콜은 각각의 프로토콜로 얻은 특정 iTreg의 표현형 연구를 허용합니다.

TGF-β 함유 프로토콜을 사용하여 나이브 CD4 + T 세포에서 인간의 CD4 + Foxp3의 + 유도 규제 T 세포 (iTregs)의 체외 분화

이 프로토콜은 in vitro에서 naive CD4+ T 세포를 병원성 Th17 세포로 분화하는 과정을 설명합니다. 특히, 다중 파라미터 유세포 분석 기반 접근법과 결합하면 이 분화 방법을 사용하여 naïve CD4+ T 세포에서 병원성 Th17 세포의 90% 순도를 얻을 수 있습니다.

마우스에서 Naive CD4+ T 세포를 병원성 Th17 세포로 체외에서 분화

현재 연구는 바이러스 특이적 TFH 세포의 조기 운명 헌신을 평가하고 이러한 세포에서 유전자 발현을 조작하기 위한 프로토콜을 보여줍니다.

급성 LCMV에 감염된 마우스에서 바이러스 특이적 여포 도우미 CD4+ T 세포의 조기 분화에 접근

Cas9 형질전환 마우스의 일차 T 세포로 가이드 RNA를 레트로바이러스 형질전환하기 위한 프로토콜을 제시하여 Th17 분화 연구에서 유전자 편집을 위한 효율적인 대안을 제공합니다.

체외(in vitro)의 Th17 분화 연구를 위한 레트로바이러스 CRISPR/Cas9 매개 유전자 표적화

배우세요 아데노바이러스 형질도입을 이용하여 순수 CD4 T 세포에서 유전자를 과발현시키고 Treg 분화를 유도하는 방법을. 이 기술은 면역내성 연구에 필수적인 초기 분자 메커니즘을 분석하는 데 활용됩니다.

나이브 CD4의 아데노 바이러스 형질은 Treg의 분화를 연구하는 세포를 T

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