Name: 글리코겐의 생화학 적정 체외 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-24T19:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: 학습하세요 세포 샘플에서 글리코겐을 생화학적으로 적정하는 방법을 배우세요. 알파 아밀라아제로 가수분해하고 형광 측정을 통해 정확하고 재현 가능한 글리코겐 정량 분석을 수행할 수 있습니다.

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우리는 우리가 형광 분석기를 사용할 수 있도록과 그의 도움을 박사 티에리 Pourcher에게 감사의 말씀을 전합니다. 연구소는 리그 국립 Contre 르 암 (키프의 labellisée)에 의해 자금 지원, 협회는 라 공들인 contre 르 암, 문화원 국립 뒤 암 (INCA)을 부어, 직원은 국립 라 공들인, METOXIA (EU 프로그램 FP7), 센터에게 부어 A. 위치 : Lacassagne, 센터 내셔널 드 라 공들인 Scientifique, 문화원 국립 드 라 상테 외 드 라 공들인 Médicale 니스의 대학 ( <a href="http://www.unice.fr/isdbc/" target="_blank">http://www.unice.fr/isdbc/</a> ). 우리는 비판적 읽기 및 편집 보정 박사 M 크리스티안 Brahimi를 혼 감사합니다.

글리코겐의 생화학 적정 1. 세포 용해 <ol><li> 100mm 직경 접시 당 0.5 × 106의 농도로 시드 세포. </li><li> 치료 : 세포를 품어 24, 1 % 또는 0.1 % O 2, 94 % 또는 설정 버그 박스 혐기성 워크 스테이션 (Ruskinn 기술 Biotrace 국제적인 Plc, 브리 젠드, UK)에서 낮은 산소 농도 (저산소증)에서 48, 또는 72 시간 94.9 %의 N 2, 5 % CO 2. 병행 (21 % O 2, 5 % CO 2) 정상 산소 상태에서 세포를 배양한다. 실험의 시간 동안 포도당 농도의 변화를 최소화하기 위해 모든 24 시간 (25 mM의 포도당 함유 매체) 매체를 변경합니다. </li><li> 처리 후, 세척 세포는 배양 배지에서 포도당의 흔적을 제거하기 위해 PBS로 2 배. 차가운 PBS의 세포를 다 쳤어요. </li><li> 5 분 동안 1,000 rpm에서 솔루션을 원심 분리기, 상층 액을 버리고 PBS로 한번 펠렛을 씻으십시오. 펠렛을 더 진행하기 전에 -20 ° C에서 얼 수있다.</li><li> 증류수 100 μL에 펠렛을 재현 탁. 글리코겐 분석 키트 (ABCAM)와 함께 제공되는 글리코겐 가수 분해 버퍼 100 μl를 추가합니다. 효소를 불 활성화하기 위해 5 분 동안 95 ° C에서 용해 액을 끓인다. </li><li> 불용성 제품을 제거하는 10 분 동안 13,000 rpm으로 소용돌이 원심 분리기 해물. 뜨는을 유지합니다. </li><li> 샘플 사이의 단백질 함량에 글리코겐 수준을 정상화하기 위해, 단백질의 정량은 Bicinchoninic 산성 분석 (BCA-Interchim)를 사용하여 상청액의 25-35 ㎕를 사용하여 수행 할 수있다. </li></ol> 파쇄물 중 일부는 세포 내부에서 자유롭게 글루코스 농도를 측정하기 위하여 사용될 수있다. 2. 글리코겐의 가수 분해 <ol><li> 가수 분해 효소 믹스 1 μL와 상층 액 (1 단계) 50 μl를 섞는다. 이 혼합물은 글루코 아밀라아제가 포함되어 있습니다. 실온에서 30 분 동안 배양한다. </li><li> 표준 글리코겐 희석하여 검량선을 작성 (2 ㎎ / ㎖)의가수 분해 완충액에서 10 ㎍ / ㎖의 용액으로 키트 upplied. 다음에, 여섯 별도 0으로 튜브, 4, 8, 12, 16 및 10 ㎍ / ㎖의 표준의 20 μL를 준비하여 0으로 글리코겐의 농도를 제공하기 위해 가수 분해 완충액 50 μL의 최종 부피로 각각의 튜브를 조정 0.04 , 0.08, 0.12, 0.16, 0.2 ㎍ / ㎖의. 기준에 가수 분해 효소 믹스 1 μl를 추가하고 실온에서 30 분 동안 품어. </li></ol> 자유 글루코스 농도 값에 의해 주어진 세포주의 배경 글루코스 농도는, 셀의 글리코겐의 수준을 결정하기 위해 전체 글루코스 농도 (글리코겐 분해 + 자유 글루코오스로부터 글루코오스)의 값으로부터 감산되어야한다. 3. 개발 및 형광의 읽기 <ol><li> 각 조건에 대해 무료 포도당 농도와 두 개의 튜브를 측정하기 위해 (튜브 1) 하나의 튜브를 준비 (관 2, 3) 총 포도당 농도 (각 관의 지혜를 측정하는가수 분해 된 글리코겐의 하 다른 볼륨). </li><li> 관 (1) 1 단계의 끝에서 추출 상층 액의 15 μl를 추가합니다. 50 μL의 최종 볼륨에 완료하기 위해 가수 분해 버퍼의 35 μl를 추가합니다. 획득 형광 무료 포도당 농도를 줄 것이다. </li><li> 튜브 2 (2 단계에서 얻은) 가수 분해 된 글리코겐의 X의 μl를 추가합니다. 50 μL의 최종 볼륨을 조정합니다. 시료량 (X μL)는 검량선의 농도를 넘지 않은 형광 값을 얻기 위해서는, 세포 밀도 및 / 또는 세포 종류에 따라 조정되어야한다. </li><li> 관 (3)의 가수 분해 된 글리코겐의 2 개의 X μl를 추가합니다. 50 μL의 최종 볼륨을 조정합니다. </li><li> 각각의 튜브에 대한 개발 버퍼의 48.7 μL, 개발 효소 믹스 1 μL와 (글리코겐 분석 키트에 제공) OxiRed 프로브 0.3 μL를 혼합하여 시료와 표준의 개발 솔루션을 준비합니다. 예를 들어, 2 조건을, 12 관을위한 혼합 준비초 (표준 6, 무료 혈당 2 총 포도당 형광 4). </li><li> 각각의 튜브에이 믹스의 50 μl를 추가하고 어둠 속에서 실온에서 30 분 동안 배양한다. </li><li> 권장 535 nm의, 587 ㎚의 발광 파장의 여기 파장에서 형광과 여기 및 발광을위한 3 ㎚의 슬릿을 측정한다. </li></ol>

<ol><li>Pelletier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+Synthesis+is+Induced+in+Hypoxia+by+the+Hypoxia-Inducible+Factor+and+Promotes+Cancer+Cell+Survival%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Glycogen Synthesis is Induced in Hypoxia by the Hypoxia-Inducible Factor and Promotes Cancer Cell Survival.</a> Front Oncol. 2, (2012).</li>
<li>Alonso, M. D., Lomako, J., Lomako, W. M., Whelan, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+look+at+the+biogenesis+of+glycogen%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">A new look at the biogenesis of glycogen.</a> FASEB J. 9, 1126-1137 (1995).</li>
<li>Bollen, M., Keppens, S., Stalmans, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+features+of+glycogen+metabolism+in+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Specific features of glycogen metabolism in the liver.</a> Biochem. J. 336 (Pt 1), 19-31 (1998).</li>
<li>Parker, G. J., Koay, A., Gilbert-Wilson, R., Waddington, L. J., Stapleton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMP-activated+protein+kinase+does+not+associate+with+glycogen+alpha-particles+from+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">AMP-activated protein kinase does not associate with glycogen alpha-particles from rat liver.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 362, 811-815 (2007).</li>
<li>Sullivan, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature+of+alpha+and+beta+particles+in+glycogen+using+molecular+size+distributions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Nature of alpha and beta particles in glycogen using molecular size distributions.</a> Biomacromolecules. 11, 1094-1100 (2010).</li>
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</ol>

저자는 이익에 대한 갈등을 선언하지 않습니다.

체외에서 글리코겐의 생화학 적정 세포 글리코겐 함량을 정확하게 정량화 할 수 있습니다. 다른 기술 (글리코겐 항체 PAS, 면역, 등.)에 비교해서,이 적정 매우, 특정 민감하고 재현. 그것은 어떠한 방사능하지만 형광 분광기가 필요하지 않기 때문에 더욱, 방법은 편리하다. 그러나,이 방법은 순전히 정량적이고 셀 글리코겐 분포에 대한 정보를 제공하지 않는다. 이 논문에 설명 된 기술은 세포 추출물에서 달성되지만 또한 조직에서 글리코겐의 추출을위한 적절한 방법으로 조직 절편에서 달성 될 수있다. 이 분석은 시험 관내 용도에 사용되며 의한 글리코겐 간접 측량 (포도당으로 가수 분해 후), 이는 생체 내에서 글리코겐 저장소를 수행하기 위해 개발 될 수 없다. PAS 염색 널리 이미많은 글리코겐 저장 질환 (폰 Gierke 병, 코리 병, McArdle 병 등)을...

글리코겐은 여러 종류의 세포의 세포질에 존재하는 글루코스 잔기의 다 분기 폴리머이다. 그것은 세포의 에너지 저장 장치의 주요 형태 중 하나이며 글루코스 대사에 중요한 역할을한다. 대부분의 포유 동물 세포는 빠르게 대사 스트레스를받는 동안 작용과 ATP의 생산을 촉진하기 위해 포도당으로 분해 할 수 있고, 저장 글리코겐을 생성 할 수있다. 간세포함으로써 신체의 포도당 연속적인 공급을 제공하는 혈당치를 조절하기 위해 글리코겐 대량 생산. 대조적으로, 다른 셀 (근육, 적혈구 등) 글리코겐의 농도는 상대적으로 낮다. 그러나, 국부적으로, 이들 양들은 세포가 갑자기 영양소 박탈 환경에 노출되어 단기간에 에너지를 제공하기에 충분하다. 글리코겐 합성과 글리코겐 분해는 모든 조직에서 동일한 단계 (그림 1)을 다음과 같습니다. 첫째, 포도당포도당 수송 체 (과잉)에 의해 세포를 입력하고 빠르게 포스 포 글루코스 -1 - 포스페이트 (G1P)에 포도당 -6 - 인산 (G6P)에서 변환됩니다. G1P이어서 UDP-글루코스로 변성되고, UDP-글루코스 탄소 C1은 glycogenin, 글리코겐의 고정 단백질의 티로신 잔기에 부착된다. 이 분자는 글리코겐 프라이머 고려, 글리코겐 합성 효소를 통해 α (1 → 4) 결합에 의해 터미널 포도당 UDP-글루코오스의 부착에 의해 확장됩니다. 11 이상의 글루코오스 잔기의 선형 사슬이 형성되면 마지막으로, 브랜칭 효소 부근 α (1 → 6) 결합을 통해 체인의 다른 포도당 6 글루코오스 잔기의 최소로 이루어지는 단자 올리고당을 전송한다. 이 과정의 반복은 다시 6.5 포도당과 나선을 형성하는 지점을 포함하는 대규모의 프랙탈 구조를 제공합니다. 글리코겐은 공동 작용에 의해 포도당 역으로 가수 분해 될 수있다분기의 포도당의 마지막 잔여 물과 글리코겐 분자 사이의 결합 글리코 시드 α (1 → 4)을 가수 분해 α (1 → 6) 결합과 글리코겐 포스를 가수 분해 효소를 debranching의. 글리코겐 분해 불리는이 반응은 (ATP 소모를 반영하는) AMP의 농도 증가에 의해 활성화하고, 글루코스 및 ATP 2,3에 의해 억제된다. 전자 현미경으로 글리코겐 분자는 여러 세포 유형, 직경 15 ~ 30 ㎚의 입​​자로서 β 무료 (또는 글리코겐 monoparticles)에서 설명되었다. 그러한 간세포 등의 특정 세포 유형에서, β 입자는 80 nm 내지 200 nm의 (4)의 최대 직경이 될 또한 α 입자라고도 로제트를 형성하도록 복합체로 조립 될 수있다 </SUP&gt;. 이러한 β 입자는 α 입자의 큰 클러스터를 형성하기 위해 결합되는 방식은 아직 완전히 해명되지 않습니다. 몇몇 증거는 β 입자 공유 결합 4.0, 수소 결합, 또는 단백질 - 단백질 상호 작용을 통한 6 의해 결합 될 수 있다는 것을 증명하는 경향이있다. 세포에서 저장된 글리코겐의 양은 많은 변수에 의존한다 : (I) 글리코겐 합성을 개시 셀 glycogenin의 양, 단백질 인산화 / 탈 인산화에 의해 조절 글리코겐 신타 제 및 포스 포 릴라 제의 (II) 활성, (III) 농도 이러한 혈관 시스템에서 포도당의 공급과 세포의 포도당 흡수 등 여러 가지 매개 변수에 의존하는 세포에 포도당. 글리코겐 저장 단단히 에너지 대사를 조절하는 호르몬에 의해, 중간 대사 물질을 생합성 호르몬의 알로 스테 릭 조절에 의해 조절하고, 영양이 감지 신호 전달 경로 7로됩니다. 그것은하는 것이 중요합니다더 나은 몸 전체 및 세포 수준에서 글리코겐 대사의 중요성을 이해하는 생물학적 샘플에서 글리코겐을 정할 수. 우리는 여기에서 글리코겐을위한 체외 분석에서, 정확한 재현하고 편리한 생화학을 설명합니다. 이 기술은 글리코겐의 구체적인 가수 분해 전후 정량화 포도당 형광에 기초한다. 다른 방법은 세포에서의 글리코겐 수준을 추정하기 위해 존재하지만, 대부분은 정량적 않는다. 세포에있는 글리코겐의 정량화 한 제 방법 중 하나는 글리코겐 8,9에 [14 C] - 포도당 결합 측정을 기반으로했다. 방사능 사용 취급이 과정을 더욱 어렵게 만들지 만이 글리코겐으로 그리고 외측 분기와 분자의 코어에서 글루코오스 잔기의 분포를 구별 글루코스 혼입 비율을 제공하는 이점이있다 (또한 필요합니다 추가 β-amylolySIS 및 크로마토 그래피 단계). 또 다른 기술은보다 최근에 개발되었고, 2-NBDG의 혼입에 기반 (2 - {N-[7-nitrobenz-2-옥사 -1,3 - diazol -4 - 일] 아미노} -2 - 데 옥시 글루코오스) 글리코겐 (10)에 2 - 데 옥시 글루코오스 형광 유도체. 측정 된 형광 강도는 제조 글리코겐의 양을 반영하고 형광 판독기로 측정 할 수있다. 셀에서 형광의 분포는 공 초점 현미경에 의해 평가 될 수있다. 다른 nonquantitative 기술 중, 요오드 산 쉬프 염색 (PAS)는 아마도 가장 일반적입니다. 그것은 고정 된 세포, 파라핀 조직 절편 또는 냉동 글리코겐의 검출을 위해 사용될 수있다. 보라색이 조직 학적 기술의 색깔이 아닌 구체적으로 다당류, 당지질, 당 단백질, 셀룰로오스 및 중립 뮤신​​. 이 테스트의 특이도는 특별히 글리코겐 소화 디아스타아제, 고정 세포 또는 조직 섹션의 처리에 의해 증가 될 수있다. 그 후,글리코겐의 수준은 질적 (탄수화물 글리코겐 제외한 고분자를 변경됨) 가수 분해 된 샘플을 가수 분해되지 않은 샘플 (전체 탄수화물 고분자 변경됨)을 비교함으로써 추정 될 수있다. 글리코겐의 생화학 적 분석법 달리 PAS 염색 및 현미경 분석은, 확산 또는 셀의 특정 부분에 집중 될 수있는 셀 글리코겐의 분포를, 관련된 정보를 제공한다. 심지어 다른 조건 사이의 글리코겐 축적 PAS 염색 추정치의 차이하지만 그러나, 11 양적 없습니다. 단일 클론 마우스 항체는 원래 항원 체외 12 세포에서 글리코겐으로 정제 글리코겐과 반응을 보여줘왔다로서 하악 과두 연골을 사용했다. 이러한 항체는 특히 글리코겐 관련 당 사슬 인식로서, PAS 염색보다 더 구체적인 방법으로 면역 조직 화학에 의해 글리코겐의 검출을위한 유용한 도구이다. </p&gt; 전자 현미경은 세포와 글리코겐 저장의 정도의 평가에 글리코겐의 곡물의 시각화를 허용 다른 기술이다. 사실, 글리코겐 β 입자는 전자 조밀 한 과립과 같은 전자 현미경으로 용이하게 인식 할 수있다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>31966.047</td><td></td></tr><tr><td>글리코겐 분석 키트</td><td>Abcam</td><td>ab65620</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>형광 분광계</td><td>PerkinElmer</td><td>LS 50B</td><td></td></tr></tbody></table>

글리코겐의 생화학 적정<em&gt; 체외</em

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

글리코겐은 척추 동물에있는 포도당의 주요 에너지 폴리머 및 중요한 몸 전체의 신진 대사의 역할뿐만 아니라, 세포의 신진 대사를한다. 글리코겐을 감지하는 많은 방법이 이미 존재하지만 몇 가지 양적 있습니다. 우리는 여기에 글루코 아밀라제에 의해 포도당 글리코겐의 분해에 기초하여 특정되는 ABCAM 글리코겐 분석 키트를 사용하는 방법을 설명한다. 포도당이어서 구체적으로 형광을 생성하는 OxiRed 프로브와 반응 생성물로 산화된다. 적정 결과, 정확한 구분하고 세포 추출물 또는 조직 섹션에 달성 될 수있다. 그러나, 다른 기술과 대조적으로, 그 셀의 글리코겐의 분포에 대한 정보를 제공하지 않는다. 이 기술의 예로서, 우리는 정상 산소 상태에서 배양이 세포 선 중국 햄스터 폐 섬유 아세포 CCL39 인간 결장암 LS174, 저산소증 대 (21 % O 2) (1 % O 2) 여기 글리코겐의 적정을 설명한다. 우리는 저산소증이 SIG는 것을 가정NAL 그 세포가 1 살아 남기 위해 합성 및 저장 글리코겐을 준비합니다.

종양 세포에 종양 신호의 산소 (저산소증) 살아남도록 후속 영양분 고갈을 처리하기 위해 에너지를 저장할 필요 저역. 글리코겐은 포유 동물 세포에서 포도당의 주요 에너지 폴리머, 우리는 저산소증에있는 글리코겐 저장의 규칙을 공부했다. 표 1, 2 및 3에 나타낸 바와 같이 세포 용 해물에서의 글리코겐 농도의 계산 및 표준화 형광의 원시 데이터에 대해 수행되어야한다. 글리코겐의 생화학 적 분석은 전자 밀도가 집계 (그림 2A) (그림 2B) 입자를 글리코겐했다 CCL39 세포의 전자 현미경에서 관찰 된 것을 확인했다. 저산소증에있는 글리코겐의 축적은 전사 인자 저산소증 유도 인자-1 (HIF-1) (그림 3), 저산소증 세포 적응에 관련된 주요 전사 인자에 따라 달라집니다. 마지막으로, 우리는 다른 암에 입증하고저장된 글리코겐이 빠르게 미만으로 10 시간 (도 4a)에서 셀에 의해...

우리는 여기에서 체외에서 글리코겐의 적정에 대한 정확한 재현하고 편리한 생화학 적 방법을 설명합니다. 이 기술은 ABCAM 글리코겐 분석 키트를 사용하여 형광 적정 포도당과 포도당 글리코겐의 연속적인 가수 분해에 기초한다.

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular ...

이 절차의 전반적인 목표는 세포 샘플에서 글리코겐을 in vitro로 적정하는 것입니다. 이것은 먼저 기계적 파괴에 의해 세포를 용해시킴으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 글리코겐을 알파 아밀라아제로 가수분해하여 포도당을 얻는 것입니다.다음으로, 포도당은 산화되어 형광 종을 생성합니다. 마지막 단계는 형광을 측정하는 것입니다. 궁극적으로 글리코겐의 생화학적 적정은 세포 내 글리코겐 함량의 변화를 보여주는 데 사용됩니다.기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 경쟁력이 있고 민감하며 정확하고 매우 구체적이라는 것입니다. 이 절차를 시작하려면 직경 100mm 접시당 0.5-200만 개의 농도로 세포를 종자화합니다. 저산소증 상태에서 24, 48 또는 72시간 동안 산소, 질소 94%, 이산화탄소 5%로 설정된 혐기성 워크스테이션에서 세포를 배양합니다.동시에 각 산소 상태에 대해 normoxia에서 다른 세포 세트를 배양합니다. 처리 후 실험 중 포도당 농도의 변화를 최소화하기 위해 24시간마다 25밀리몰 포도당 함유 배지를 변경합니다. PBS로 세포를 두 번 세척하여 배양 배지에서 미량의 포도당을 제거합니다.그런 다음 차가운 PBS 원심 분리기에서 세포를 긁어내고 PBS 용액을 1000RPM에서 5분 동안 긁습니다. 상등액을 버리고 PBS로 펠릿을 한 번 씻습니다. 다음으로, 펠릿을 100마이크로리터의 증류수에 다시 현탁시키고 글리코겐 분석 키트에서 얻은 글리코겐 가수분해 완충액 100마이크로리터를 추가합니다.용해물을 섭씨 95도에서 5분 동안 끓여 효소를 비활성화합니다. 용해물이 실온으로 냉각되면 와류 및 원심 분리기. 13, 000 번에서 용해물.불용성 생성물을 제거하기 위해 10분 동안 중력. 그런 다음 상등액을 따로 보관하여 글리코겐 수준을 샘플 사이의 단백질 함량으로 정상화합니다. bsic acid assay를 사용하여 25-35 microlit의 상등액으로 단백질을 정량화합니다.이 혼합물에 이어, 이전 단계의 상등액 50 마이크로리터와 1 마이크로리터의 가수분해 효소 혼합물을 혼합합니다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 배양하고 검량선 표준물질을 준비하기 위해 따로 보관하고, 표준 키트 글리코겐을 가수분해 완충액으로 희석하여 최종 농도가 밀리리터당 10마이크로그램이 되도록 합니다. 다음으로 밀리리터당 10마이크로그램의 0, 4, 8, 12, 16, 20마이크로리터를 추가합니다.표준물질을 6개의 개별 튜브로 희석하면 각 표준물질을 가수분해 완충액으로 희석하여 최종 부피는 50마이크로리터이고 글리코겐 농도는 각각 밀리리터당 0.04, 0.08, 0.12, 0.16 및 0.2마이크로그램입니다. 1마이크로리터의 가수분해 효소 혼합물을 표준물질에 추가하고 각 산소 조건에 대해 실온에서 30분 동안 배양합니다. 튜브 1을 유리 포도당 농도로, 튜브 2와 3을 총 포도당 농도로 표시합니다.그런 다음 추출된 상등액 15마이크로리터를 튜브 1에 추가한 다음 35마이크로리터의 가수분해 완충액을 추가하여 최종 부피 50마이크로리터를 제공합니다. 유리 포도당 농도에 해당하는 형광은 나중에 측정됩니다. 4마이크로리터의 가수분해된 글리코겐을 튜브 2에 추가하고 가수분해 완충액으로 최종 부피인 50마이크로리터로 조정합니다.검량선의 농도 내에서 형광 값을 유지하려면 2마이크로리터의 가수분해된 글리코겐을 튜브 3에 추가하고 가수분해 완충액을 사용하여 최종 부피인 50마이크로리터로 조정합니다. 다음으로, 48.7 microlit 개발 버퍼, 1 microlit 개발 효소 혼합물 및 0.3 microlit Oxy Redd Probe를 혼합하여 모든 샘플 및 표준물질에 대한 개발 솔루션을 준비합니다. 각 샘플 표준물질에 대해 이 혼합물 50마이크로리터를 각 튜브에 추가하고 어둠 속에서 30분 동안 배양합니다.형광 측정을 위해 실온에서 여기 및 방출을 위해 슬릿을 3나노미터로 설정한 다음 형광을 측정합니다. 글리코겐 저장과 저산소증의 조절은 글리코겐이 포유류 세포에서 포도당의 주요 에너지 중합체이기 때문에 연구되었습니다. 세포 내 글리코겐 농도의 계산 및 표준화는 형광의 원시 데이터에서 수행되었습니다.여기에서 형광 측정에서 볼 수 있듯이 총 유리 포도당 농도가 계산되었습니다. 이러한 결과를 사용하여 글리코겐에서 유래한 포도당량을 측정했습니다. 글리코겐에 대한 생화학적 분석은 ccl 39 세포의 전자 현미경 사진에서 관찰된 전자 밀도 응집체가 글리코겐 입자임을 확인했습니다.글리코겐과 저산소증의 축적은 전사 인자에 따라 달라집니다. 저산소증 유도 인자 1은 글리코겐이 저장된 다른 암 및 비암 세포주에서 저산소증에 대한 세포 적응에 관여하는 주요 전사 인자로, 6시간 이내에 세포에 의해 빠르게 대사될 수 있습니다. 또한, 글리코겐의 사용은 포도당 결핍 조건에서 세포 사멸을 방지합니다.또한 전자 현미경 및 주기적인 산 이동 염색과 같은 방법을 수행하여 세포 내 글리코겐 분포와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.

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이 비디오는 글리코겐 합성효소 활성을 추정하기 위한 분광광도계 분석을 설명합니다. 이 방법은 시간이 지남에 따라 NADH의 흡수율 감소에 의존하며 글리코겐 합성효소 활성을 나타냅니다.

글리코겐 합성효소 활성을 결정하기 위한 분광광도계 분석

이 비디오에서는 특성화되지 않은 구조를 가진 글리코겐 샘플의 분지 정도를 결정하기 위한 정성적 분광 광도계 분석에 대해 설명합니다. 특성화되지 않은 샘플의 흡광도 최대값을 알려진 분지형 구조를 가진 다당류의 흡광도 최대값과 비교하면 특성화되지 않은 샘플에 분지화가 존재함을 나타냅니다.

글리코겐 분지화의 정도를 측정하기 위한 글리코겐 분지화 분석

주기적 산 쉬프 염색은 조직의 다당류 함량을 시각화하는 기술입니다. 이 기사는 인간 정맥혈에서 정제된 말초 혈액 단핵 세포에 사용하도록 조정된 주기적인 산 Schiff 염색 프로토콜을 보여줍니다. 이러한 샘플은 림프구와 면역 체계의 다른 백혈구를 위해 풍부합니다.

요오드 산 쉬프 염색 말초 혈액 단핵 세포에서 글리코겐을 감지

여기, 시아 노 박테리아 세포에서 글리코겐 함량을 측정하기위한 신뢰할 수 있고 쉬운 분석법을 제시합니다. 이 과정은 침전, 선택 가능한 해중합 및 포도당 잔류 물의 검출을 수반한다. 이 방법은 야생형 및 유 전적으로 변형 된 균주 모두에 적합하며 시아 노 박테리아의 대사 공학을 촉진 할 수 있습니다.

시아 노 박테리아의 글리코겐 함량 측정

글리코겐 대사의 주요 효소의 활성을 측정하는 기술은 가시 범위에서 작동하는 간단한 분광 광도계를 사용하여 제시됩니다.

진핵 글리코겐 대사 연구를위한 분광 광도법

최적의 슈크로스 농도는 슈크로스 밀도 구배 원심분리를 사용하여 간 글리코겐의 추출을 위해 결정하였다. 글리코겐 분해 효소를 억제하기 위해 10분 끓는 단계를 추가하면 유익한 것으로 입증되었습니다.

글리코겐 구조 측정을 위한 간 글리코겐 분자 추출

동물 조직 분석은 핵 섬광 검출을 활용하여 방사성 표지 포도당이 글리코겐에 혼입되는 것을 측정하여 글리코겐 합성효소의 효소 활성을 결정합니다.

동물 조직에서 글리코겐 합성효소 효소 활성의 방사화학적 평가

이 비디오에서 우리는 immunoperoxidase 분석으로 알려진 효소 항원 검출 기법을 사용하여 바이러스 감지 및 titering위한 대체 방법을 보여줍니다. 여기, 우리는 여러분의 바이러스 샘플을 수집하는 방법을 보여 테스트 세포를 준비하고, 바이러스 titer를 결정하는 일련 dilutions를 사용하여 최종 immunoperoxidase 분석됩니다.

Immunoperoxidase 분석을 사용하여 인간 Coronaviruses의 적정

신경 튜브 형성 후, neuroepithelium은 수축과 튜브가 배아 두뇌 심실을 형성하기 위해 배아 뇌척수 (eCSF)로 채우고 동안 주름. 우리는 더 나은 라이브 배아에서 neuroepithelial 모양 대조적으로 액체 채워진 공간을 시각화이 뇌실 주입 기술을 개발했습니다.

Zebrafish의 두뇌 뇌실 주입

적당한 바인딩 동질성과 생물 학적 시스템에 대한 바인딩을 열역학을 모니터하는 등온 적정의 열량의 사용에 대한 일반적인 프로토콜이 제공됩니다.

Macromolecule - 리간드 친화력을 측정하기위한 등온 적정의 열량

학습하세요 세포 샘플에서 글리코겐을 생화학적으로 적정하는 방법을 배우세요. 알파 아밀라아제로 가수분해하고 형광 측정을 통해 정확하고 재현 가능한 글리코겐 정량 분석을 수행할 수 있습니다.

글리코겐의 생화학 적정

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