Name: 단백질 지혜 : 용 워크 벤치 실리코에 드 노보 디자인 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: 학습하세요 단백질 WISDOM을 활용한 컴퓨터 기반 단백질 설계 방법을 통해 안정성과 결합 친화도가 향상된 단백질을 설계하는 기술을. 이 연구는 생명공학 및 의학 분야의 치료제 개발에 활용됩니다.

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CAF는 NSF, NIH의 지원에 감사를 표합니다(R01 GM52032; R24 GM069 736) 및 미국 환경 보호국, EPA(R 832721-010)에서 확인할 수 있습니다. 이 연구의 일부는 DoD, Air Force Office of Scientific Research의 정부 지원으로 가능했습니다. JS는 NIH (P50GM071508-06)의 지원에 감사드립니다. MLBP는 NDSEG(National Defense Science and Engineering Graduate) 펠로우십, 32 CFR 168a의 지원에 감사드립니다. GAK는 보조금 번호 DGE-1148900으로 National Science Foundation 대학원 연구 펠로우십의 지원에 감사드립니다.

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

de novo 단백질 설계 프레임워크는 서열 선택 단계와 검증 단계의 두 단계로 구성됩니다. 이 프레임워크는 견고하고 유연한 설계 템플릿을 처리할 수 있을 만큼 견고하며 단일 단백질 설계 또는 복잡한 단백질 설계에 적용할 수 있습니다. 이 프레임워크는 수십 가지 질병에 적용되는 수많은 단백질 시스템에 성공적으로 적용되었습니다. 많은 디자인이 실험적으로 검증되어 현재까지 발견된 일부 단백질의 가장 강력한 억제제 또는 작용제를 제공합니다. 이 프레임워크는 이제 Protein WISDOM을 통해 학계에서 사용할 수 있습니다.
이 방법에는 세 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫 번째는 단백질 설계를 위한 글로벌 최적화 기술을 사용하는 서열 선택 단계입니다. 단백질 설계 문제는 매우 복잡한 문제입니다(n개의 돌연변이 가능한 위치에 대해 20개의 가능한 서열). 이 숫자는 실험 설계 방법으로 고려할 수 있는 가능한 시퀀스 수보다 훨씬 높습니...

De novo protein design은 향상된 특성 또는 기능을 가진 원하는 3차 구조를 생성하는 단백질 서열을 식별하는 것입니다. 단백질의 네이티브 폴드(native fold)는 자유 에너지 최소값에 놓인 형태이기 때문에 de novo protein design은 타겟 폴드에서 자유 에너지 최소값을 갖는 염기서열을 찾습니다. 이 문제는 Drexler1과 Pabo2에 의해 처음 설명되었으며 "역 폴딩 문제"라고 불렸습니다. 그러나 염기서열이 하나의 접힌 구조 솔루션만 생성할 수 있는 단백질 접힘 문제와 달리 de novo protein design 문제는 퇴화를 나타냅니다. 많은 다른 아미노산 서열은 동일한 3차 구조와 기능을 생성할 수 있습니다.
단백질 설계는 전통적으로 합리적 설계와 지시된 진화를 통해 실험적으로 수행되어 왔지만, 최근에는 실험 방법에 내재된 제한된 검색 공간을 극복하기 위해 계산 방법이 채택되었습니다. 결정론적 방법(deterministic method), 확률론적 방법(stochastic methods), 확률론적 방법(probabilistic method)을 포함한 다양한 계산 방법이 사용되어 왔다. 3,4 초기의 계산 방법은 문제를 더 쉽게 해결할 수 있도록 고정 백본 템플릿을 사용했습니다. 5-7 더 빠른 프로세서, 고성능 컴퓨팅 및 더 효율적인 알고리즘의 출현으로 백본 유연성은 고정 백본 템플릿8-14의 앙상블을 사용하거나 원자 간 거리 및 이면각의 범위로 템플릿을 표현하여 진정한 백본 유연성을 통합함으로써 통합되었습니다. 15,16년
이 백서에서는 새로운 단백질 설계 프레임워크 computational을 활용하기 위해 학계에서 사용할 수 있는 온라인 도구인 Protein WISDOM에 대해 자세히 설명합니다. 이 프레임워크는 HIV, 암, 보체 질환 및 기타 자가면역 질환과 같은 질병을 표적으로 하는 치료용 단백질의 설계에 적용되었습니다. 예측된 펩타이드 중 다수가 실험적으로 검증되어 이 방법의 힘을 입증했습니다. 표 1은 단백질 또는 펩타이드의 크기, 예측 횟수 및 실험적 검증을 포함하여 설계된 다양한 단백질에 대한 요약을 제공합니다.
<테이블 테두리="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>단백질 디자인</td>
			<td>단백질 길이</td>
			<td># 계산 예측</td>
			<td># 실험적 검증</td>
			<td>참조</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>인간 beta-defensin-2의 가득 차있는 순서 디자인</td>
			<td>41</td>의
			<td>340</td>의
			<td> </td>
			<td>(17)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>인간 C3의 콤프스타틴 억제제</td>
			<td>13</td>세
			<td>28</td>분
			<td>3/3</td>
			<td>(18, 19)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>쥐 C3c에 결합하는 콤프스타틴 유사체</td>
			<td>13</td>세
			<td>5</td> 개
			<td> </td>
			<td>(20)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>디세린 확장이 있는 콤프스타틴 유사체</td>
			<td>15</td>분
			<td>8</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>콤프스타틴 아날로그 W4A9의 안정화 구조</td>
			<td>13</td>세
			<td>18</td>분
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C3a 수용체 작용제 및 길항제</td>
			<td>77</td>의
			<td>20</td>분
			<td>4/7</td>
			<td>(21)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C5a 수용체 작용제 및 길항제</td>
			<td>74</td>의
			<td>61</td>의
			<td>2/61</td>년
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 gp14 억제제</td>
			<td>12</td>세
			<td>6</td>
			<td>4/5</td>년
			<td>(22)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 gp120 억제제</td>
			<td>9</td> 개
			<td>14</td>분
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bcl-x L 및 Bcl-2의 Bak 억제제</td>
			<td>16-18</td>호
			<td>10</td>분
			<td>5/5</td>년
			<td>(23)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERK2 억제제</td>
			<td>11</td>세
			<td>25</td>분
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZH2 억제제</td>
			<td>21</td>분
			<td>17</td>의
			<td>10월 10</td>일
			<td>(24)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSD1 및 LSD2 억제제</td>
			<td>16</td>세
			<td>41</td>의
			<td>20월17일</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-DR1 억제제</td>
			<td>13</td>세
			<td>6</td>
			<td> </td>
			<td>(25세)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNP 억제제</td>
			<td>5</td> 개
			<td>13</td>세
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 1. De novo Protein Design Framework를 사용하여 설계된 단백질 및 펩타이드 요약. 계산 예측의 #은 유리한 예측의 수로 표시됩니다(즉, 특정 컷오프 이상의 폴드 특이성 또는 기본 시퀀스보다 큰 근사 결합 친화도). # of experimental validations는 두 개의 숫자를 제공합니다: 첫 번째는 실험적으로 검증된 예측의 수이고 두 번째는 실험적으로 테스트된 예측의 총 수입니다.
펩타이드의 항균성을 향상시키기 위해 human-beta-defensin-2 (hβD-2)의 설계가 수행되었습니다. 17 이 설계를 위해 우리는 두 가지 경우를 고려했습니다: 1) hβD-2를 따라 최대 10개의 돌연변이와 2) 시스테인(8, 15, 20, 30, 37 및 38)을 제외한 모든 hβD-2 잔기 위치의 전체 염기서열 설계. 세 가지 다른 디자인 템플릿과 세 가지 다른 시퀀스 선택 모델이 디자인에 사용되었습니다. 돌연변이의 높은 수준의 유사성은 10개의 돌연변이 설계와 전체 염기서열 설계 모두에 대해 가중 평균과 거리 빈 모델 간에 관찰되었습니다. 또한, 많은 수의 염기서열(sequence)이 네이티브 염기서열(native sequence)보다 더 유리하게 계산된 Fold Specificity(폴드 특이성) 값을 갖는 것으로 밝혀졌습니다.
보체 시스템 억제제(C3, C3a 및 C5a)는 뇌졸중, 심장마비, 알츠하이머병, 천식, 류마티스 관절염, 이종 이식 거부 반응, 성인 호흡기 질환, 건선 및 크론병과 같은 여러 면역 질환과 싸우도록 설계되었습니다. 단백질 설계 프레임워크에 의해 예측된 C3c의 콤프스타틴 억제제 3종과 합리적으로 설계된 염기서열 3종은 실험적으로 네이티브 콤프스타틴보다 더 나은 결합제인 것으로 검증되었습니다. 18,19년
추가 연구에서는 비영장류 C3c에 대한 콤프스타틴의 활성 상실을 조사하고 여러 후보 랫드 및 마우스 C3c 억제제를 설계했습니다. 5개의 염기서열은 C3c를 억제하는 것으로 알려진 W4A9 콤스타틴 돌연변이보다 쥐 C3c와 더 유리한 연관 자유 에너지를 갖는 것으로 나타났습니다. 이것은 Arg1에 의한 새로운 소금 다리 형성 때문입니다. 20 N-말단 확장을 가진 8개의 염기서열은 디세린 확장을 가진 W4A9보다 더 나은 결합체로 예측되었습니다. 마지막으로, 18개의 콤프스타틴 염기서열은 W4A9의 결합 형태를 안정화하여 영장류 및 비영장류 C3c 억제제에 대한 강력한 후보를 제공하는 것으로 예측되었습니다.
C3c 억제제 외에도 C3a 및 C5a 수용체 작용제 및 길항제는 C3a 및 C5a의 구조를 기반으로 설계되었습니다. 모델에 의해 예측된 7개의 C3a 염기서열을 실험적으로 테스트했습니다. 염기서열 중 2개는 강력한 작용제였고 다른 2개는 부분 작용제였다. 21 두 가지 강력한 작용제는 이전에 발견된 "초작용제"에 비해 58배의 개선을 보였다. C5a 수용체 작용제 및 길항제의 설계는 61개의 염기서열 세트를 제공했습니다. 모든 염기서열을 합성하였고 2개는 새로운 C5a 작용제인 것으로 밝혀졌습니다.
AIDS를 일으키는 바이러스인 HIV-1의 융합 억제제는 HIV-1이 세포를 감염시키는 것을 막기 위해 고안되었습니다. 첫 번째 설계는 HIV-1의 외피 당단백질인 gp41을 표적으로 했습니다. 단백질 설계 프레임워크는 네이티브 염기서열보다 더 나은 결합재인 6개의 염기서열을 예측했습니다. 이러한 예측된 염기서열 중 4개는 IC50이 29μM만큼 낮은 최상의 염기서열로 HIV-1을 억제하는 것으로 실험적으로 검증되었습니다. 이 염기서열은 네이티브 염기서열보다 3-15배 개선된 것으로 나타났으며 Enfuvirtide 내성 바이러스 균주에 대해 활성을 잃지 않았습니다. 22 두 번째 설계는 HIV-1의 또 다른 외피 당단백질인 gp120을 표적으로 했습니다. 14개의 염기서열은 gp120의 결합체이며 HIV-1의 추가적인 잠재적 융합 억제제를 제공하는 것으로 예측되었다.
암과 관련된 수많은 단백질이 암 치료의 유망한 표적을 제공했습니다. Bcl-2 및 Bcl-xL은 세포 사멸을 예방하는 항세포사멸 단백질입니다. 이 두 단백질의 억제제는 암세포에서 세포 사멸을 유도하도록 설계되었습니다. 10개의 염기서열은 네이티브보다 더 나은 결합재로 예측되었으며, 이러한 결과는 이전의 실험 및 돌연변이 유발 결과를 포착했습니다. 23 또 다른 표적 단백질인 ERK2는 항증식성 암 치료의 유망한 표적이 되는 신호 전달 캐스케이드에 관여합니다. 25개의 염기서열이 ERK2의 억제제인 것으로 예측되었다.
히스톤 메틸전이효소 및 탈메틸화효소는 전립선암, 유방암, 림프종, 골수종, 방광암, 결장, 피부암, 간암, 자궁내막암, 폐암, 위암 등 많은 암과 관련된 히스톤 메틸화를 동적으로 제어합니다. de novo protein design framework는 EZH2(Lysine methyltransferase)의 17가지 억제제를 확인했으며, 실험적으로 테스트된 10가지 중 모두 EZH2를 억제하는 것으로 밝혀졌습니다. 24 가장 강력한 펩타이드는 약 13μM의 IC50을 가졌고, 효소 농도가 높아도 동일하게 효과적이었으며, 보조인자와 경쟁하지 않았습니다. 이 펩타이드는 EZH2의 첫 번째 억제제 세트였습니다. 프레임워크에 의해 53개의 LSD1 억제제(탈메틸화효소)가 예측되었으며, 실험적으로 시험된 20개의 억제제 중 17개는 LSD1의 억제제였고 18개는 LSD2의 억제제였다. 최고의 억제제는 IC50 값이 1μM 미만으로 현재까지 발견된 가장 강력한 펩티드 억제제입니다.
마지막 두 단백질 시스템은 셀리악병, 진성 당뇨병 1형, 전신성 홍반성 루푸스, 쇼그렌 증후군, 츄르그-스트로스 증후군, 하시모토 갑상선염, 그레이브스병, 특발성 혈소판 감소성 자반병, 류마티스 관절염 및 알레르기와 같은 다양한 자가면역 질환을 치료하기 위한 표적을 제공했습니다. 이러한 잠재적 억제제 중 어느 것도 실험적으로 검증되지 않았지만, 프레임워크는 HLA-DR1에 결합하는 6개의 염기서열과 PNP에 결합하는 13개의 염기서열을 예측했습니다.
표 2는 de novo protein design framework를 사용하여 예측된 실험적으로 검증된 억제제 및 작용제를 요약한 것입니다. approximate binding affinity metric은 9개의 염기서열(human C3c, HIV-1 gp41, EZH2, LSD1 및 LSD2 억제제)을 예측하는 데 사용되었으며, fold specificity metric은 4개의 염기서열(C3aR의 agonists/antagonist)을 식별하는 데 사용되었습니다. 이러한 펩타이드는 de novo 단백질 설계 프레임워크, 특히 추가된 근사 결합 친화도 메트릭의 성공을 강조합니다. 이 프레임워크는 적용 가능성이 매우 다양합니다. 25개의 서로 다른 질병과 관련된 6개의 서로 다른 단백질이 성공적으로 설계되고 실험적으로 검증되었습니다.
<표 테두리 ="1" cellpadding ="1" cellspacing="1" 높이 ="147" 너비 ="856">
	<tbody>
		<tr>
			<td>이름</td>
			<td>IC50</td> 시리즈
			<td>50 EC50</td>
			<td>단백질 타겟</td>
			<td>적용 가능한 질병</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ027</td>
			<td>0.94 μM의</td>
			<td> </td>
			<td>인간 C3c</td>
			<td colspan="1" rowspan="7">뇌졸중, 심장마비, 알츠하이머병, 천식, 류마티스 관절염, 전신성 홍반성 루푸스, 다발성 경화증, 건선, 당뇨병 I형, 크론병, 췌장염 및 낭포성 섬유증</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ086</td>
			<td>1.98 μM</td>
			<td> </td>
			<td>인간 C3c</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ059</td>
			<td>4.73 μM</td>
			<td> </td>
			<td>인간 C3c</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ110-4 (단</td>편)
			<td> </td>
			<td>15.2 nM</td>
			<td>C3아르</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ060-4</td> (단편)
			<td> </td>
			<td>36.4 nM</td>
			<td>C3아르</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ007-5</td> (단)
			<td>15.4 nM</td>
			<td> </td>
			<td>C3아르</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ002-5</td> 시리즈
			<td>26.1 nM</td>
			<td> </td>
			<td>C3아르</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ435</td>
			<td>29 - 253 마이크로미터</td>
			<td> </td>
			<td>HIV-1 gp41</td>
			<td>AIDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ037</td>
			<td>13.57 μM</td>
			<td> </td>
			<td>이즈2</td>
			<td colspan="1" rowspan="5">전립선, 유방암, 림프종, 골수종, 방광암, 결장암, 피부암, 간암, 자궁내막암, 폐암 및 위암</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ011-1</td> (단)
			<td>0.521 μM</td>
			<td> </td>
			<td>증권 시세 표시기1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ016-1</td>
			<td>0.249 μM</td>
			<td> </td>
			<td>증권 시세 표시기1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ026-1</td>
			<td>2.51 μm</td>
			<td> </td>
			<td>증권 시세 표시기2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ015-1</td>
			<td>1.332 μM</td>
			<td> </td>
			<td>증권 시세 표시기2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 2. 다양한 질병을 표적으로 하는 전산을 통해 예측하고 실험적으로 검증된 펩타이드.

단백질 지혜 : 용 워크 벤치<em&gt; 실리코에</em&gt;<em&gt; 드 노보</em생체 분자의&gt; 디자인

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

드 노보 단백질 설계의 목적은 기본 순서를 기준으로 같은 결합력, 작용제 또는 길항제의 행동이나 안정성 등의 특정 속성, 개선에 필요한 3 차원 구조로 접을 것 아미노산 서열을 찾을 수 있습니다. 단백질 디자인은 현재 발전 약물 설계 및 발견의 중심에 자리 잡고 있습니다. 뿐만 아니라 단백질 디자인은 잠재적으로 유용한 약물 표적에 대한 예측을 제공하지만, 그것은 또한 단백질 폴딩 과정과 단백질 - 단백질 상호 작용에 대한 우리의 이해를 향상 않습니다. 같은 방향 진화 등의 실험 방법은 단백질 디자인에서 성공을 보여 주었다. 그러나, 이러한 방법은 tractably 검색 할 수 있습니다 제한된 순서 공백으로 제한됩니다. 반면, 전산 설계 전략 특성과 다양한 기능을 포함 시퀀스의 훨씬 더 큰 집합의 심사 할 수 있습니다. 우리는 전산 드 노보 단백질 디자인 METHO의 범위를 개발했습니다단백질 설계의 몇 가지 중요한 영역을 다루는 능력 DS. 이러한 증가 바인딩 선호도 증가 안정성과 단지에 대한 단량체 단백질의 디자인이 (가) 있습니다. 넓은 위해 이러한 방법을 전파하는 것은 우리가 단백질 지혜 (현재 사용 <a href="http://www.proteinwisdom.org" target="_blank">http://www.proteinwisdom.org</a> ), 단백질 설계 문제의 다양한 자동화 된 방법을 제공하는 도구입니다. 구조 템플릿은 디자인 프로세스를 초기화하기 위해 제출됩니다. 설계의 첫 번째 단계는 시퀀스 공간에 잠재적 인 에너지의 최소화를 통해 안정성을 향상을 목표로 최적화 순서 선택 단계입니다. 선택한 시퀀스는 다음 배 특이 무대와 결합 친화 단계를 통해 실행됩니다. 프로세스의 각 단계에 대한 염기 서열의 순위 정렬 된 목록은 함께 관련 설계 구조로, 디자인의 포괄적 인 양적 평가와 함께 사용자를 제공합니다. 여기에서 우리는 세부 사항 O를 제공합니다F 각 설계 방법뿐만 아니라, 방법의 사용을 통해 달성 몇 가지 주목할만한 실험 성공.

HIV-1 진입 억제제의 De Novo 설계
Protein WISDOM에 구현된 de novo 설계 프레임워크는 여러 중요한 치료 시스템을 위한 억제 펩타이드 설계에 사용되었습니다(표 1 및 2). 주목할 만한 시스템 중 하나는 호스트 세포 수용체인 CD4로의 HIV-1 진입을 억제하는 펩타이드 설계이며, 본에서는 Protein WISDOM 인터페이스의 실질적인 사용법을 입증하기 위한 대표 시스템으로 활용됩니다. 이 펩타이드들은 호스트 T 도움 세포로의 HIV-1 융합 및 진입의 핵심 역할을 하는 막관통 서브유닛 gp41을 표적으로 설계되었습니다. 결과가 원본 논문에 제시된 것과 반드시 동일하지는 않을 수 있음에 유의하십시오. 이는 본 방법의 이 단계에서 사용된 Rosetta 방법의 확률적 특성과 원본 논문 발표 이후 Rosetta2.3에서 Rosetta3.4로의 업데이트로 인한 것입니다.
<p class="jove...

우리는 단백질 설계의 몇 가지 중요한 영역을 다룰 수 있는 computational de novo 단백질 설계 방법을 개발했습니다. 이러한 방법을 보급하기 위해 단백질 설계를 위한 온라인 도구인 Protein WISDOM을 제시합니다(<a href="http://www.proteinwisdom.org" target="_blank">http://www.proteinwisdom.org</a>). 구조적 주형에서 시작하여 안정성 향상을 위한 단량체 단백질과 결합 친화도 향상을 위한 복합체의 설계를 수행할 수 있습니다.

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific ...

다음 실험의 전반적인 목표는 폴딩, 결합 또는 기능적 특성이 향상된 단백질 또는 펩타이드를 설계하는 것입니다. 이는 단백질 또는 복합체 구조를 업로드하고 돌연변이 및 생물학적 제약 조건을 정의함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로 설계 목표를 정의하기 위해 서열 선택 최적화를 수행하며, 이를 통해 안정성과 상호작용 특성이 향상된 수많은 가능한 단백질 또는 펩타이드 서열이 생성됩니다. 다음으로 폴딩을 진행합니다.설계된 단백질이나 펩타이드가 원하는 개선된 특성을 갖추었는지 검증하기 위해, 설계된 서열에 대해 특이성 및/또는 근사 결합 친화도 계산을 수행합니다. 이 과정을 통해 생성된 구조의 계산 분석을 바탕으로, 설계된 서열의 특성이 개선되었음을 보여주는 결과를 얻습니다. 본 프로토콜은 프린스턴 대학교의 플루트 연주자인 Chris Doles 교수의 실험실에서 개발되었습니다.이 일반적인 계산 기반의 de novo 단백질 설계 프로토콜은 단백질 설계의 여러 중요한 영역을 다룰 수 있습니다. 여기에는 안정성 향상을 위한 단량체 단백질 설계와 결합 친화도 향상을 위한 복합체 설계가 포함됩니다. 저희는 H-I-V-G-P 41 억제제, 암 치료제를 위한 EZH2 표적 억제제, 보체 성분 C3 A 표적 억제제 등 다양한 치료 분야에서 여러 주목할 만한 설계 성공 사례를 거두었습니다. 단백질 설계 방법론을 더 넓은 학계에서 활용할 수 있도록, 저희는 Protein Wisdom이라는 웹 인터페이스를 개발하였습니다.이 인터페이스를 통해 사용자는 템플릿 제출, 디자인 제약 조건 정의 및 방법 매개변수 지정을 완전히 제어할 수 있어, 매우 다양한 디자인 문제에 디자인 방법을 쉽게 적용할 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 protein wisdom 웹사이트에 사용자 등록을 마친 후, 사용자 로그인 버튼을 클릭하여 단백질 서열과 템플릿 구조를 제출하십시오. 단백질 디자인 실험을 시작하면 사용자 홈 페이지가 나타나며, 여기에는 제출된 작업 수, 업로드된 구조 수 및 지금까지 업로드된 구조 목록이 표시됩니다. 새로운 디자인 작업을 시작하십시오.'새 작업 생성'을 클릭하면 작업 제출 페이지로 이동합니다. 작업 이름을 지정하고, 이전 작업에 기반한 것인지 여부를 표시하십시오. '계속'을 클릭합니다.설계 템플릿의 단백질 구조를 업로드하십시오. 이 템플릿은 표준 단백질 구조 데이터뱅크(protein data bank) 또는 PDB 형식이어야 합니다. 모든 원자에 대해 하나의 좌표 세트를 갖는 강체 템플릿이거나, NMR 용액 구조에서 얻은 것과 같이 여러 모델을 포함하는 유연한 템플릿일 수 있습니다.단일 단백질을 설계하는 경우, 체인은 하나만 존재할 수 있습니다. 템플릿 단계에서 사용자는 새로운 템플릿을 업로드하거나 이전에 업로드한 기존 템플릿 중에서 선택할 수 있습니다. 여러 개의 템플릿을 업로드하는 경우, 각 모델이 model number로 시작하고 end model로 끝나는지 확인하십시오.모든 잔기가 천연 아미노산으로 지정되었는지 확인하십시오. 계속(continue)을 클릭합니다. 템플릿이 성공적으로 업로드되고 확인되면, 사용자는 메인 제어 페이지로 이동합니다.이 페이지에서 사용자는 작업 상태를 확인하고, 돌연변이 세트 및 생물학적 제약 조건을 수정하며, 1단계 서열 선택을 위한 작업을 제출할 수 있습니다. 현재는 1단계가 완료되지 않았으므로 2단계 옵션이 제공되지 않습니다. 2단계 옵션은 1단계 결과가 도출되면 나타납니다.다음으로, 메인 제어 페이지의 mutation sets 링크를 클릭하여 돌연변이 세트를 정의하고, 돌연변이가 허용될 잔기를 선택한 후 해당 잔기가 어떤 아미노산으로 돌연변이될 수 있는지 선택하십시오. 기본적으로, 특정 위치에서 허용되는 아미노산은 용매 접근 가능 표면적 또는 SSA mutation sets를 기반으로 선택됩니다. 돌연변이 세트 선택 후 save changes를 클릭하십시오.해결해야 할 최적화의 계산 복잡도를 확인하십시오. 허용되는 계산 복잡도의 상한선은 20의 25제곱입니다. 그런 다음 메인 제어 페이지에서 생물학적 제약 조건 링크를 클릭하여 생물학적 제약 조건을 정의하고, 단백질 전체 또는 단백질 일부 범위에 대해 전하 또는 아미노산 함량 제약 조건을 지정하십시오.필요한 경우 허용되는 총 돌연변이 수이며, 생물학적 제약 조건은 선택 사항입니다. 완료되면 메인 제어 페이지로 돌아가십시오. 1단계 시작 링크를 클릭하여 사용자를 1단계 제출 페이지로 이동시키십시오.거리 의존적 힘의 장(distance dependent force field) 및 모델 계산을 위해 생성할 서열 수를 설계할 체인을 선택하십시오. 이러한 선택에 관한 자세한 내용은 텍스트 프로토콜에서 확인할 수 있습니다. 작업을 제출하면 사용자는 메인 제어 페이지로 다시 리다이렉트됩니다.작업 상태는 작업의 현재 진행 상황을 나타내도록 업데이트됩니다. 제출 후에는 편집을 위해 작업이 잠깁니다. 작업이 완료되면 사용자는 설계된 서열 목록으로 구성된 결과가 포함된 이메일을 받게 됩니다.결과는 메인 제어 페이지에서도 확인할 수 있습니다. 페이지에 stage two fold specificity를 위한 상자가 나타나 사용자가 이 검증을 수행할 수 있도록 합니다. 이를 위해 begin stage two fold specificity를 클릭하십시오. build stage two 페이지로 진입하려면, 템플릿 유연성 계수(template flexibility factor)를 거리의 백분율 또는 고정 거리로 지정하여 상단 및 하단 alpha carbon, alpha carbon 거리 경계를 정의하십시오.다음으로, PHI 및 side 이면각의 상한 및 하한 각도 경계를 정의합니다. 템플릿 유연성 인자를 백분율로 지정한 후 제출 버튼을 클릭하고, 서열당 생성할 구조 수를 지정한 다음 계속 버튼을 클릭합니다. 참고로, 서열당 생성 가능한 구조의 상한선은 500개입니다.그런 다음 [계속]을 클릭하여 폴드 검증(fold validation) 제출 의사를 확인합니다. 1단계와 2단계는 2단계가 완료될 때까지 편집할 수 없도록 잠깁니다. 작업이 완료되면 결과가 포함된 이메일이 사용자에게 전송되며, 결과는 메인 제어 페이지에서도 확인할 수 있습니다.여기에서 설계된 서열, 1단계의 해당 에너지 값 및 2단계의 폴딩 특이성 값이 포함된 텍스트 파일을 확인하고 다운로드할 수 있습니다. 또한, 사용자는 결과 보기 링크를 클릭하여 1단계 순위와 에너지 값, 2단계 순위와 폴딩 특이성 값이 포함된 표를 브라우저에서 확인할 수 있습니다. 설계된 리간드 단백질 또는 펩타이드와 나머지 복합체 간의 친화도를 결정하기 위해 근사 결합 친화도 계산이 사용됩니다.이 계산은 1단계 직후 또는 폴드 특이성 계산이 완료된 후에 수행할 수 있습니다. 먼저, 서열 번호를 클릭하여 서열을 선택하십시오. 근사 결합 친화도 계산을 시작하면 사용자는 서열 선택 페이지로 이동하게 되며, 이곳에서 설계 서열 목록과 함께 각 서열의 선택 순위 및 폴드 특이성 순위가 표시됩니다.서열을 선택하고 저장하면 사용자는 메인 제어 페이지로 이동합니다. 그런 다음 'Begin stage two, approximate binding affinity'를 클릭하여 작업을 제출하십시오. 작업이 완료되면 서열 번호, 근사 결합 친화도 및 분배 함수 값이 포함된 첨부 파일이 포함된 결과 이메일이 사용자에게 전송됩니다. 이후 진행되는 모든 근사 결합 친화도 작업의 경우, 이 파일에는 완료된 모든 서열에 대한 결과가 포함됩니다.전체 결과는 표시된 작업의 메인 제어 페이지에 접속하여 확인할 수도 있습니다. 여기 HIV-1 진입 억제제를 위한 디자인 템플릿이 있으며, 이는 GP41 코어와 복합체를 이룬 14잔기 교차 결합 펩타이드인 C14 link mid의 결정 구조입니다. 이 템플릿 펩타이드는 알려진 강력한 억제제이며, 교차 결합제가 제거된 상태로 제출되었습니다.설계 입력값이 정의되고 시스템이 1단계 서열 선택을 위해 제출된 후, 정렬된 서열 선택 결과는 메인 작업 페이지의 결과 보기 링크를 통해 확인할 수 있습니다. 이 링크를 통해 특정 시스템에 대해 계산된 모든 결과의 요약본을 쉽게 읽을 수 있는 형태로 제공하며, 각 단계별 결과에 따라 정렬이 가능합니다.신속한 분석을 위해, 3글자 아미노산 코드로 선택된 서열의 요약을 제공하는 서열 결과 링크를 통해 결과를 시각화할 수 있습니다. 결과를 확인하는 세 번째 방법은 에너지 결과 링크를 이용하는 것으로, 선택된 서열로 실행된 최적화 모델의 요약과 해당 에너지, 그리고 솔루션을 위해 모델을 해결하는 데 걸린 시간이 제공됩니다. 1단계인 서열 선택과 2단계인 폴드 특이성 및 근사 결합 친화도 방법의 제출이 완료되면, 요약 보기 결과 섹션에서 결과에 접근하고 이를 정렬할 수 있습니다.또는, 폴드 특이성 결과(fold Specificity Results) 섹션에서 개별적으로 확인할 수 있으며, 해당 섹션에는 서열 번호와 폴드 특이성 값이 배열 형태로 제공됩니다. 샘플 근사 결합 친화도 계산 결과는 정렬 가능한 목록으로 표시됩니다. 결과 보기(view results) 섹션에서 근사 결합 친화도 계산이 수행된 모든 서열은 보기(view) 열에 강조된 링크가 표시됩니다. 보기 링크를 클릭하면 설계 정보 페이지로 이동합니다.이 페이지에서는 사용된 모든 복합체 및 펩타이드 구조에 대한 다운로드 가능한 zip 파일을 제공합니다. 복합체와 펩타이드 구조 모두의 최종 구조 설계 단계에서, 에너지가 가장 낮은 상위 10개 구조가 순위별 목록으로 제공됩니다. 각 구조에는 뷰(view) 링크가 있어, 사용자가 대화형 JM O 환경에서 구조를 확인할 수 있습니다.사용자가 각 구조를 개별적으로 다운로드할 수 있도록 다운로드 링크도 제공됩니다. 결과에 대한 더 자세한 내용은 근사 결합 친화도 결과 섹션에 제시되어 있습니다. 이 섹션에서는 펩타이드 단백질 및 복합체 분배 함수의 값과 최종 근사 결합 친화도 값을 제공합니다.protein wisdom를 사용할 때는 설계 제약 조건의 선택이 전체 설계 결과에 큰 영향을 미칠 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 설계 제약 조건은 최적화 알고리즘이 탐색해야 하는 서열 공간의 양을 제한함으로써 전체 검색 속도를 높일 뿐만 아니라, 실험 정보에서 도출된 최적화 제약 조건을 활용하면 생물학적으로 유의미한 단백질 설계를 얻을 수 있습니다. 웹 인터페이스인 protein wisdom를 통해 이러한 설계 방법들을 이용함으로써 해당 설계 방법들이 더욱 널리 활용되기를 기대합니다.우리는 설계 방법의 기능을 지속적으로 확장 및 개발하고 있으며, 가까운 미래에 다량체 시스템, 단백질-DNA 상호작용, 그리고 번역 후 변형 및 비표준 아미노산을 포함하는 설계까지 이 프레임워크를 일반화하기를 기대하고 있습니다. 각 확장 단계마다 Protein Wisdom을 통해 제공되는 이 방법들은 학계에서 쉽고 효율적으로 응용될 수 있을 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

합의 모티프를 기반으로 하는 합성 단백질 서열은 일반적으로 IPD(Interpositional Dependencies)를 암시하는 공진화 잔기를 무시합니다.  IPD는 활동에 필수적일 수 있으며, 이를 무시하는 설계는 차선의 결과를 초래할 수 있습니다.  이 프로토콜은 StickWRLD를 사용하여 IPD를 식별하고 합리적인 단백질 설계에 정보를 제공하여 보다 효율적인 결과를 얻을 수 있습니다.

합성 단백질의 최적화 : Interpositional 종속 관계 확인이 구조적으로 표시 및 / 또는 기능적으로 연결된 잔류

우리는 X 선 결정학에 의하여 NEMO의 IKK 결합 도메인의 구조 결정에 대한 프로토콜을 기술합니다. 이 방법은 단백질 발현, 정제 및 특성화뿐만 아니라 단백질의 성공적인 결정 최적화 및 단백질의 구조 측정을 위한 전략을 포함합니다.

NEMO의 IKK 결합 도메인의 생산, 결정화 및 구조 결정

극저온 전자 현미경 검사법의 단일 입자 분석은 고해상도에서 생물학적 앙상블의 구조를 결정하는 데 사용되는 주요 기술 중 하나입니다. Scipion은 현미경에 의해 획득된 정보를 처리하고 생물학적 표본의 3D 재구성을 달성하기 위해 전체 파이프라인을 만드는 도구를 제공합니다.

Scipion을 가진 극저온 EM 및 단일 입자 분석

생체 분자 모델링의 핵심 기술은 단백질에 활성 부위를 표시하고 표시하는 것입니다. 이 기술은 매크로 분자 시각화를위한 네 가지 인기있는 무료 프로그램을 사용하여 입증된다 : iCn3D, Jmol, PyMOL, UCSF ChimeraX.

분자 시각화 프리웨어를 사용하여 효소 활성 사이트 모델링

이 프로토콜은 실험 설계 구성에서 주관적인 선택을 최소화하는 혼합물, 연속 및 범주형 연구 요인에 대한 제형 최적화에 대한 접근 방식을 제공합니다. 분석 단계에서는 효과적이고 사용하기 쉬운 모델링 피팅 절차가 사용됩니다.

SVEM(Designed Mixture-Process Experiments and Self-Validated Ensemble Model)을 사용한 지질 나노입자(LNP) 제형 최적화를 위한 워크플로우

이 프로토콜은 거대분자의 CryoEM 맵에서 소분자 리간드를 모델링하는 데 사용할 수 있는 도구를 소개합니다.

Modeling Ligands into Maps Derived from Electron Cryomicroscopy(전자 극저온 현미경에서 파생된 맵으로 리간드 모델링)

단백질 설계에는 아미노산 염기서열의 구축과 기능적 변이체를 만들기 위한 특정 모티프의 통합이 포함됩니다. 이 접근 방식은 항생제 내성 병원체와 싸우기 위한 항균 펩타이드(AMP)의 개발에 매우 중요합니다. 본 논문은 다양한 생물정보학 도구를 이용한 단백질 구축 절차를 제시합니다.

De Novo 및 In Silico 단백질 설계를 위한 I TASSER, trRosetta, UCSF Chimera, HADDOCK 서버 및 HEX loria 적용

이 프로토콜은 자동화 지원 유전자 라이브러리 생성 및 평가를 통해 유전적으로 인코딩된 바이오센서의 체계적인 글로벌 최적화 방법을 제공합니다. 이는 실험을 간소화하고 유전적 구성 요소를 선택하여 바이오센서를 특정 설계 결과에 맞게 조정할 수 있도록 하는 실험 설계 방법론과 결합됩니다.

실험 설계 및 자동화 워크플로우를 통해 유전적으로 인코딩된 바이오센서 설계 공간의 효율적인 샘플링

우리는 황금 microelectrodes와 실리콘 기판에 폴리 (에틸렌 글리콜) 자기 조립 monolayer을 (PEG - SAM) 형성을위한 절차를 제시한다. PEG - SAM은 단일 단계에서 형성과 실리콘과 금색 표면에 biofouling을 방지합니다. 전기 영동은 다음 nanoscale patterning의 biomolecules에 대한 아래 사용되고 있습니다.

Patterning의 Biomolecules에 대한 Microelectrodes에 자기 조립 Monolayers을 Antifouling

함께 비디오 GELFREE 8100 분획화 시스템의 사용, 분자량을 기준으로 파티션 복잡한 단백질 샘플을 설명하고 액상에있는 분수를 복구합니다. 비디오 기술이 사용 방법, 작동 및 fractionated 소 간 homogenate의 polyacrylamide 젤 전기 영동 분석, 결과 데이터를 제공하는 방법에 대해 설명합니다.

액상 복구와 분자량 기반 분류에 대한 GELFREE 8100 분획화 시스템을 사용하여

학습하세요 단백질 WISDOM을 활용한 컴퓨터 기반 단백질 설계 방법을 통해 안정성과 결합 친화도가 향상된 단백질을 설계하는 기술을. 이 연구는 생명공학 및 의학 분야의 치료제 개발에 활용됩니다.

단백질 지혜 : 용 워크 벤치

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