비 침습 온열 암 치료를위한 금 나노 입자 및 생물 시스템과 고주파의 상호 작용을 평가하기위한 프로토콜

이 절차의 전반적인 목표는 13.56MHz 무선 주파수 전기장, 시험관 내 및 생체 내에서 금 나노 입자의 가열 특성을 평가하는 것입니다. 이것은 먼저 석영 수의사에서 농축된 금 나노 입자와 그 완충액의 가열 속도를 평가하여 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 배양된 암세포를 사용하여 금 나노 입자의 체외 독성 연구를 수행하는 것입니다.

세 번째 단계는 이소성 마우스 암 모델에서 금 나노 입자에 대한 생체 내 연구를 수행하는 것입니다. 궁극적으로, 결과는 조사된 나노 입자가 현탁액, 시험관 내 및 생체 내 나노 입자의 분석을 통해 RF 매개 온열요법에 사용할 수 있는 효과적인 제제가 될 수 있는지 여부를 보여줄 수 있습니다. 이 방법은 입자 자체로 인한 가열과 같은 나노 입자 매개 비침습적 고주파 저체온증 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며 치료 목적으로 사용할 수 있습니까?

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 이러한 유형의 실험을 수행하기 위한 잘 정립된 프로토콜이 많지 않기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 연구 조교인 시스네로스(Cisneros), 박사 후 연구원인 스튜어트 코어(Stuart Core), 또 다른 박사 후 연구원인 레일라 그린(Leila Green)이 절차를 시연할 예정이다. 예를 들어, 시중에서 판매되는 500ml 병의 직경이 5나노미터인 금 나노 입자로 시작합니다.

약 125ml의 스톡 금 나노 입자 용액을 6개의 50킬로달톤 원심분리기 필터 튜브로 나누고 나노 입자를 3000RPM에서 2분 5초 동안 원심분리합니다. 여과된 버퍼인 상등액을 제거하고 각 필터를 다시 채웁니다. 더 많은 재고 솔루션으로.

모든 나노 입자 용액이 여과될 때까지 원심 주입을 계속하고 버퍼를 제거하고 튜브를 다시 로드합니다. 마지막 첨가 후 여과된 버퍼를 유사한 양의 탈이온수로 교체하고 여과된 버퍼 샘플을 RF 기계에 로드한 후 이 과정을 약 8회 더 반복합니다. 적외선 카메라 소프트웨어를 사용하여 QVE 위에 상자를 만들어 가열 프로파일을 캡처합니다.8회 세척 후 5나노미터 금 나노입자 여과액의 가열 데이터는 탈이온수의 가열 데이터에 접근합니다.

UV VIS 분석은 오염 물질 흡수를 모니터링하는 데에도 사용할 수 있습니다. 봉우리. 여기에 표시된 것은 깨끗한 스펙트럼입니다. 완충액 오염 물질이 완전히 제거되면 필터에서 나노 입자를 제거하는 필터 튜브의 0.5ml의 탈이온수에 나노 입자를 현탁시킵니다.

그런 다음 6개의 서스펜션을 모두 하나의 15ml 튜브에 결합합니다. 이제 안정성 데이터를 위해 UV VIS 및 제타 전위를 사용하여 샘플을 분석합니다. I-C-P-O-E-S 및/또는 ICP 질량 분석기를 사용하여 나노 입자 농도를 측정합니다.

SEM 및/또는 TEM 분석을 사용하여 Kansas RF 시스템 또는 부하 유도, 1.3 밀리리터 주사기 석영 vete를 사용하여 형태학적 데이터를 얻고 Q vete가 상주하는 공기 중에서 RF 전기장을 미터당 약 90k볼트로 설정할 수도 있습니다. 염화나트륨이 0.9%인 표준 식염수 샘플의 경우 전기장은 미터당 약 1.1킬로볼트로 감소합니다. 다음은 서로 다른 RF 시스템 간의 비교를 허용하는 데 사용되는 대략적인 조건입니다.

이제 깨끗한 석영 베트에 1.3ml의 정제된 금 나노 입자 현탁액을 리터당 1000밀리그램의 농도로 로드합니다. 샘플을 RF 필드에 120초 동안 또는 샘플이 섭씨 70도에 도달할 때까지 노출시킵니다. 과도하게 노출되면 전기 아크 또는 빠른 끓는 현상이 발생할 수 있습니다.

열화상 데이터를 캡처하고 IR 카메라 및 관련 소프트웨어를 사용하여 영역을 제어합니다. 동일한 샘플에서 이 절차를 세 번 반복합니다. 이제 다른 50킬로달톤 원심분리기 필터를 통해 샘플을 필터링하여 물 버퍼에서 금 나노 입자를 추출합니다.

그런 다음 버퍼만 RF 필드에 다시 노출시킵니다. 다시 말하지만, 금 나노 입자 콜로이드와 여과액 사이의 시간 차이가 3 배 더 크면 금 나노 입자 자체로 인한 HR이 결정됩니다. 마지막으로, 추가 실험을 위해 필터에서 남은 금 나노 입자를 1.3ml의 물에 현탁시킵니다.

이러한 체외 연구는 2D 단층을 형성하는 모든 유형의 암 세포 유형에 적용할 수 있습니다. 이 보기에서는, 인간적인 간세포 암종 유래된 Hep 3 B 세포는 대략 50, 000개의 세포 판으로 이용될 것이다. 1 밀리리터의 성장이있는 12 웰 플레이트의 3 개의 웰에서.

배지는 나노 입자 연구를 위해 3개의 플레이트가 채워지고 대조군으로 3개의 플레이트가 채워질 때까지 세포를 계속 로드합니다. 플레이트를 섭씨 37.5도에서 24시간 동안 배양합니다. 다음날, 0.1 밀리리터의 1000 밀리그램 금 나노 입자 용액을 3 개의 나노 입자 플레이트의 각 웰에 대조판에 주입합니다.

각각 0.1ml의 물을 넣고 모든 플레이트를 24시간 동안 더 배양합니다. 다시 24시간 후에 세포 배지를 흡인하고 PBS로 세포를 세척하여 표면 결합 금 나노 입자를 제거합니다. 그런 다음 세포 매체를 교체합니다.

이제 셀이 RF 노출될 준비가 되었습니다. 각 12웰 셀 팩을 RF 필드 내에 놓고 셀이 섭씨 31도까지 냉각될 때까지 기다립니다. 약간 냉각되면 세포를 3.5분 동안 rf에 노출시킵니다.

셀 매체의 최종 온도는 약 섭씨 37도입니다. 세포를 인큐베이터로 옮기고 24시간 동안 기다렸다가 분석합니다. 세포가 준비되면 배지를 흡인하고 배지에 25%MTT 시약 2밀리리터로 교체합니다.

그런 다음 세포가 다시 4시간 동안 배양하도록 합니다. 그런 다음 MTT 매체를 2밀리리터의 DMSO로 교체합니다. DMSO가 MTT 시약을 용해시킬 수 있도록 세포판을 벤치 로커에 10분 동안 놓습니다.

마지막으로, 각 웰에서 100마이크로리터 샘플을 96웰 플레이트에 피펫팅하고 570나노미터에서 플레이트를 광학적으로 판독합니다. 이러한 생체 내 연구는 정소성 또는 이소성 미러링 모델에서 고형 종양을 형성하는 모든 유형의 암에 적용할 수 있습니다. 이 예시에서, 3개의 B형 간암 세포는 BPC 누드 마우스와 함께 사용됩니다.

대략 100개, 000개의 세포로 시작해서 트립신이 세포를 얼리고 25 마이크로리터 당 200만개의 세포의 해결책을 일으키십시오. 세포 현탁액에 동일한 양의 얼음처럼 차가운 마트리 겔을 첨가하고 피펫에서 반복 흡인하여 완전히 혼합합니다. 이제 각 동물의 등에 있는 원하는 위치에 혼합 현탁액을 주입합니다.

몇 주 후, 종양은 이때 1/2에서 1 센티미터 라운드가 될 것이고, RF 치료를 시작하고 IP 주사에 의해 케타민과 자일라진의 용액으로 마우스를 마취하고 따뜻하게 유지합니다. 그런 다음 27 또는 30 게이지 바늘이 있는 1cc 주사기를 사용하여 금 나노 입자를 종양의 절반에 직접 주입합니다. 수술용 면봉을 사용하여 혈액을 흡수하고 알코올 물티슈로 주사 부위를 닦습니다.

대조군으로, 종양의 다른 절반에 PBS만 주입합니다. 이제 각 그룹에서 쥐의 절반을 치료하십시오. RF 발생기의 수신 헤드에 마우스를 장착하고 눈, 귀, 발가락 등 처리되지 않은 부분을 구리 테이프로 보호합니다.

이 실험에서 가장 중요한 부분은 마우스의 적절한 접지입니다. 적절한 접지가 없으면 동물에 전하가 축적되어 열 또는 전기 부상을 유발할 수 있습니다. 이것은 쉽게 예방할 수 있습니다.

원하는 치료 부위의 너비보다 최소 1cm 더 큰 투과 머리에서 종양을 배치합니다. 이제 종양과 치료 부위가 보이도록 IR 열화상 카메라를 배치합니다. RF를 5분 동안 켜고 결과 온도 곡선을 기록합니다.

피부 표면 온도가 섭씨 42도 이상으로 상승하면 RF 노출 직후 즉시 치료를 중지하십시오. 쥐가 의식을 가질 때까지 따뜻한 방에서 회복하도록 합니다. 3주 동안 일주일에 두 번씩 트리트먼트를 반복한다.

그런 다음 최종 RF 노출 후 48시간 후에 마우스를 안락사시키고 종양을 처리합니다. 정제 된 금 나노 입자의 RF 가열은 이들과 배경 탈 이온수 완충 용액 사이의 시간 차이에 의해 결정되었다. 결과는 5나노미터 및 10나노미터 나노입자 모두에 대해 예상한 대로였습니다.

인간 간세포 암종에 통합된 정제된 금 나노입자는 Hep three B 세포를 파생했습니다. 이러한 세포가 RF 필드에 노출되면 일반적으로 내부화된 나노 입자가 없는 RF에 노출된 세포보다 생존 가능성이 떨어집니다. 그림 3은 사용된 금 나노 입자가 그 자체로 독성이 제한적인 이상적인 시나리오를 보여주지만, 다양한 유형의 나노 물질을 사용하여 현재까지 시험관 내 결과에 대한 포괄적인 검토를 위해 우수한 RF 개시 세포 독성 특성이 문헌을 참조합니다.

3 개의 B. 간암 세포를 사용하여 babsi 누드 마우스의 등에 종양을 생성했습니다. 이 종양에 PBS 부유 금 나노 입자를 주입한 후 RF에 노출시켰습니다. 토마스 치료 후 분석은 치료가 종양 성장을 조절하고 종양 질량을 감소시키는 것으로 밝혀졌습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 in vitro 및 in vivo에서 RF 반응성 특성과 용액을 결정하여 RF 매개 저체온증에 사용하기 위해 나노 입자를 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 고출력 RF 전기장으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 활성 전기장을 만지거나 그 안에 닿지 마십시오.

전기장을 측정하고 필요한 경우 패러데이 케이지와 같은 적절한 차폐를 사용하십시오. 일반적으로 지속적인 고강도 전기장에 대한 노출을 항상 최소화하십시오.