Name: 비 침습 온열 암 치료를위한 금 나노 입자 및 생물 시스템과 고주파의 상호 작용을 평가하기위한 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-28T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: 학습하세요 금 나노입자와 고주파 전기장의 상호작용을 평가하는 비침습 암 치료법을 배양암세포와 생체내 마우스 모델을 활용하여 온열 특성과 독성을 분석하는 방법입니다.

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이 작품은 NIH (U54CA143837), NIH MD 앤더슨 암 센터 지원 보조금 (CA016672), V 재단 (SAC) 및 Kanzius 연구 재단 (SAC, 이리, PA)에서 제한없는 연구 보조금에 의해 투자되었다. 우리는 행정 지원, 외과 종양학, MD 앤더슨 암 센터에서 크리스틴 재 감사합니다.

완전한 실험 개요는도 1에 도시된다. 더 자세한 사항은 아래의 1-3 단계에 묘사되어있다. 1. NP 콜로이드의 평가 RF 난방 : 예를 들어 금 나노 입자 <ol><li> 일반적으로, 각각의 NP 샘플이 조사되고 들면 제 배경 이온 및 오염 물질을 제거하는 탈 이온 (DI) 물로 원심 분리 필터를 통해 샘플을 여러 번 세척 하였다. 모든 이온과 오염 물질이 씻겨되는 액체가 DI 워터와 유사한 RF 가열 속도 (시간)이 AuNP 현탁액에서 제거 된 것입니다. 이러한 정제 공정은 얻어지는 NP에 높은 농도를 허용. 이것은이 예에서 금 나노 입자를 사용하지만, 기본 원리는 다른 NP 재료에 적용 할 수 있다는 것을 주목할 가치가있다. </li><li> 예를 들어, 지름 5 ㎚의 상업적으로 이용 가능한 금 나노 입자의 500 ㎖ 병을 정화하고 전기 무선 인터넷의 13.56 MHz의 RF 필드에 대상ELD 강도 90 kV의 / m. <ol><li> ~ 여섯 50 kDa의 원심 분리기 필터 튜브 사이의 주식 AuNP 솔루션 및 분할에서 125 mL를 취하여. 3,000 rpm에서 원심 분리기. 2 분 5 초. 더 원액을 여과 버퍼와 리필 필터를 제거합니다. 모두 500 ㎖를 여과 될 때까지 반복합니다. </li><li> DI 물과 비슷한 양으로 필터링 된 버퍼를 교체하고 약 8 배 (또는 필터링 된 버퍼 RF의 시간 DI 물에 해당 될 때까지)를 반복합니다. UV-VIS 분석은 또한 오염물 흡수 피크를 모니터링하는 데 사용될 수 있습니다. 버퍼 오염 물질은 완전히 각 필터로, 피펫 약 0.5 ml의 DI 물을 제거하고 반복 피펫 팅에 의해 금 나노 입자를 재현 탁하고 나면. 이것은 완전히 필터에서 금 나노 입자를 제거하고 전체 재 부유를 허용해야합니다. 한 15 ㎖의 에펜 도르프 튜브에 여섯 현탁액을 결합합니다. </li><li> 금 나노 입자는 정제, 농축 한 후, I​​CP-OES 및 / 또는 ICP-MS, UV-VI와 concentratio의 데이터에 대한 제타 전위를 사용하여 샘​​플을 분석N과 순이익 안정성, 각각. SEM 및 / 또는 TEM 분석은 형태 학적 데이터를 얻기 위해 사용될 수있다. 이러한 기술에 대한 상세한 샘플 준비는 문헌 4에서 찾아 볼 수있다. </li></ol></li><li> Kanzius RF의 이전 연구 8에 설명 된 시스템, 또는이 시스템의 유도, (아무 샘플 현재에) 공기 RF 전기장이 될 수 있도록 1.3 ㎖의 원통형 석영 큐벳을 배치 ~ 큐벳 내부 90 kV의 / M을 사용. 표준 식염수 샘플 (0.9 % 염화나트륨) 전기 필드 ~ 1.1 kV의 / m로 감소 될 것이다. 이러한 비교는 서로 다른 시스템간에 이루어질 수 있도록하는 데 사용되는 대략적인 조건이다. <ol><li> 피펫 석영 큐벳에 정제 AuNP 콜로이드의 1,000 ㎎ / ℓ의 시료 1.3 ㎖ 및 RF 필드에이를 소개합니다. 이렇게 맞춤형 테플론 샘플 홀더를 사용하여 수행 할 수있다. 120 초 동안 또는 샘플이 전기 불꽃 또는 빠른 비등을 방지하기 위해 70 °의 C에 도달 할 때까지 RF 필드에 샘플을 노출. 캘리포니아IR 카메라 및 관련 소프트웨어를 사용하는 열 화상 화 데이터 (뿐만 아니라 제어 분야) pture. 이 과정을 세 번 반복합니다. </li><li> DI 물 버퍼에서 금 나노 입자를 추출하는 다른 50 kDa의 원심 분리 필터를 통해 샘플을 고를. 세 번 다시, RF 필드에 버퍼를 재 노출. AuNP 콜로이드와 배경 DI 물 버퍼 사이의 홈런의 차이로 인해 금 나노 입자 자신에게 인사를 결정합니다. ~의 홈런을 얻을 것으로 예상 0.3 ° C / 초와 ~ 0.25 ° C / 초 AuNP 따라 HR을 제공하기 위해 0.05 ° C / 초. 생체 외 / 생체 실험에 1.3 ㎖의 물을 필터에 남아있는 금 나노 입자를 재현 탁. </li></ol></li></ol> 2. 나노 입자를 이용한 RF 유도 고열 : 체외 연구 <ol><li> 이러한 시험 관내 연구는 2 차원 단일 층을 형성하는 암 세포 유형 중 어느 타입에 적용될 수있다. 이 실험에서 인 Hep3B 세포 유래 인간의 간세포 암을 사용합니다. <ol><li> 플레이트 ~ 50,000 CEL성장 배지 1 ㎖와 12 - 웰 플레이트의 앞 세 개의 우물에 LS. 이 6 번 (컨트롤로 NP 연구를위한 3 개의 판과 3 개의 판을 사용)을 반복합니다. NPS를 도입하기 전에 24 시간 동안 37.5 ° C에서 알을 품다. 5 분 동안 바이오 안전성 내각 UV 빛 노출을 사용하여 첫 번째 NPS를 소독. </li><li> 각에 잘 1,000 ㎎ / L AuNP 솔루션의 0.1 ML을 소개하고 또 다른 24 시간 동안 둡니다. 세 제어 셀 플레이트의 각 웰에 물 0.1 ㎖를 추가하고 또한 24 시간 동안 둡니다. </li><li> 24 시간이 경과 한 후, 세포 미디어를 대기음 및 표면 바인딩 된 금 나노 입자를 제거하는 PBS로 세척. 세포 미디어를 교체합니다. 세포는 현재 RF 노출에 대한 준비가되어 있습니다. </li></ol></li><li> RF 필드에서 각 12도 전지 팩을 넣습니다. 세포가 31 ° C로 냉각 될 때까지 기다립니다 RF 발생기의 전원을 켜고 5 분 동안 노출. 세포 미디어의 최종 온도는 ~ 37 ℃가 될 것입니다 RF 필드를 끕니다. 세포를 제거하고 분석하기 전에 24 시간 동안 인큐베이터에 배치합니다. <ol> &lt;리&gt; 보육 및 대기음 세포 미디어에서 세포를 제거합니다. MTT 시약 0.4 ml로 잘뿐만 아니라 각 셀 매체의 1.6 ML을 추가합니다. 4 시간 동안 세포를 품어. 대기음 매체 및 디메틸 설폭 사이드 (DMSO) 중에서 2 ㎖로 대체. 벤치 로커의 셀 플레이트를 놓고 DMSO는 MTT 시약을 용해 할 수 있도록 10 분 동안 둡니다. 마지막으로, 광학적으로 피펫 100 개의 96 - 웰 플레이트에 각 μL와는 SPECTROstar 나노 플레이트 리더로 ​​플레이트 리더를 사용하여 570 nm에서 잘 읽어 보시기 바랍니다. </li></ol></li></ol> 3. 나노 입자를 이용한 RF 유도 고열 : 생체 내 연구 <ol><li> 이러한 생체 내 연구는 동소 또는 자궁외 쥐 모델에서 고형 종양을 형성하는 암의 유형에 적용 할 수 있습니다. 이 실험은 이소성 종양 BALB-C 누드 마우스 모델에서 인 Hep3B 간암 세포를 사용한다. </li><li> 참고 : 모든 생체 실험은 모든 관련 지침, 규정 및 규제 기관 준수에 실행. 또한, 설명하는 프로토콜은 텍사스 대학 MD 앤더슨 암 센터 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의지도와 승인하에 수행되었다. <ol><li> 적절한 성장 배지와 조직 배양 플라스크에서 세포의 적절한 수 (100 ~ K)을 성장한다. 세포 배양 기간 동안 5 % CO 2와 37 ° C 배양기에서 배양한다. </li><li> 트립신 (플라스크에서 분리)와 세포를 치료하고 매 25 μL에 대한 2 백만 세포의 솔루션을 생산하고 있습니다. (얼음) 리겔의 동일한 양을 추가하고 최종 주입 용액을 제조 잘 혼합. 마우스의 뒷면에 원하는 위치에이 솔루션을 주사하고 종양이 원하는 크기 (대부분의 세포에 대한 2-4 주)에 성장하는 시간의 적당량을 기다립니다. RF 노출 전에, BALB-C 누드 마우스는 고체 자궁외 종양에게 0.5 cm 직경를 부담해야한다. </li></ol></li><li><ol><li> anae 의해 (이 경우 BALB-C 누드 마우스) 사용되는 마우스를 준비IP의 주사 케타민과 자일 라진의 솔루션을 sthetizing. 쥐가 잠 동안, 37 ℃에서 온도 조절 실에 보관 총 20 마우스는 모든 베어링과 유사한 크기의 종양이 필요합니다. 더 AuNP 주사로 두 그룹 : 나머지 10 마우스는 RF 노출 및 비 RF 노출 컨트롤 사이에 분할됩니다 동안 열 마우스 (후자 인 PBS 주사 만)와 함께 및 금 나노 입자없이 사용됩니다. </li><li> 일단 적절히 마취 직접 27 G 바늘로 1-CC 주사기를 이용하여 종양에 금 나노 입자를 주입. AuNP 솔루션은 PBS 0.1 ㎖에 200 ㎎ / L의 오 농도에 있어야합니다. 분사 후 닦아 알코올을 혈액을 흡수하고 주사 부위를 닦아 수술 면봉을 사용합니다. </li><li> 그런 RF 발생기의 수신 머리에 처리 될 마우스 마운트. 종양이 전송 머리에 가장 가까운 수 있도록 마우스가 위치해야합니다. 피 처리되지 않은 영역을 차폐뿐만 아니라 센시구리 테이프로, 같은 눈, 귀, 발가락 등의 분야를 세 심하게 배. 아무 책임도 상승이 발생하지 않도록 구리 테이프가 적절하게 접지면과 접촉되어 있는지 확인합니다. 또한, 노광 영역은 원하는 치료 부위의 크기보다 적어도 1cm의 간격이 있어야. </li><li> 위치 IR 열 화상 카메라 종양 치료 영역이 표시되도록. 5 분 동안 RF를 켭니다. 그 결과 온도 곡선을 기록한다. 치료는 즉시 온도보다 42 ° C의 정지 처리를 실현합니다. </li></ol></li><li><ol><li> 그들은 의식이 될 때까지 RF 노출은 따뜻한 실에서 마취에서 마우스를 복구 한 후. </li><li> 나중에 같은 쥐 48 시간과 실험을 (- 3.4.1 3.3.1 단계)를 반복합니다. </li><li> 실험 후, 기관 프로토콜 및 절차에 따라 마우스를 안락사. 종양의 무게를 기록한다. 조직 학적 분석을 위해 포르말린을 사용하여 종양은 고정 및 파라핀을 포함 할 수 있습니다. 종양 섹션은 일반적으로 재치 더러워H의 헤 마톡 실린 및 에오신 및 계측 치료 효과, 예를 들어, KI-67와 관련된 대상에 대해는, 등 카스파 제 3을 절단. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Gannon, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+nanotube-enhanced+thermal+destruction+of+cancer+cells+in+a+noninvasive+radiofrequency+field%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Carbon nanotube-enhanced thermal destruction of cancer cells in a noninvasive radiofrequency field.</a> Cancer. 110, 2654(2007).</li>
<li>Curley, S. A., Cherukuri, P., Briggs, K., Patra, C. R., Upton, M., Dolson, E., Mukherjee, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+radiofrequency+field-induced+hyperthermic+cytotoxicity+in+human+cancer+cells+using+cetuximab-targeted+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Ther.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Noninvasive radiofrequency field-induced hyperthermic cytotoxicity in human cancer cells using cetuximab-targeted gold nanoparticles.</a> J. Exp. Ther. Oncol. 7, 313(2008).</li>
<li>Gannon, C. J., Patra, C. R., Bhattacharya, R., Mukherjee, P., Curley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+gold+nanoparticles+enhance+non-invasive+radiofrequency+thermal+destruction+of+human+gastrointestinal+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Intracellular gold nanoparticles enhance non-invasive radiofrequency thermal destruction of human gastrointestinal cancer cells.</a> Journal of Nanobiotechnology. 6, 2(2008).</li>
<li>Raoof, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+antibody-conjugated+gold+nanoparticles+in+the+endolysosomal+nanoenvironment%3A+implications+for+noninvasive+radiofrequency-based+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Stability of antibody-conjugated gold nanoparticles in the endolysosomal nanoenvironment: implications for noninvasive radiofrequency-based cancer therapy.</a> Nanomedicine. 8, 1096(2012).</li>
<li>Glazer, E. S., Massey, K. L., Zhu, C., Curley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+carcinoma+cells+are+susceptible+to+noninvasive+radio+frequency+fields+after+treatment+with+targeted+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Pancreatic carcinoma cells are susceptible to noninvasive radio frequency fields after treatment with targeted gold nanoparticles.</a> Surgery. 148, 319(2010).</li>
<li>Glazer, E. S., Curley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiofrequency+field-induced+thermal+cytotoxicity+in+cancer+cells+treated+with+fluorescent+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Radiofrequency field-induced thermal cytotoxicity in cancer cells treated with fluorescent nanoparticles.</a> Cancer. 116, 3285(2010).</li>
<li>Glazer, E. S., Curley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+radiofrequency+ablation+of+malignancies+mediated+by+quantum+dots%2C+gold+nanoparticles+and+carbon+nanotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Therapeutic+Delivery%22%5BJournal%5D)">Non-invasive radiofrequency ablation of malignancies mediated by quantum dots, gold nanoparticles and carbon nanotubes.</a> Therapeutic Delivery. 2, 1325(2011).</li>
<li>Corr, S. J., Raoof, M., Mackeyev, Y., Phounsavath, S., Cheney, M. A., Cisneros, B. T., Shur, M., Gozin, M., McNally, P. J., Wilson, L. J., Curley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Citrate-Capped+Gold+Nanoparticle+Electrophoretic+Heat+Production+in+Response+to+a+Time-Varying+Radiofrequency+Electric-Field%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+C%22%5BJournal%5D)">Citrate-Capped Gold Nanoparticle Electrophoretic Heat Production in Response to a Time-Varying Radiofrequency Electric-Field.</a> J. Phys. Chem. C. 116, 24380(2012).</li>
<li>Kruse, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Radio-Frequency+Coupling+Network+for+Heating+of+Citrate-Coated+Gold+Nanoparticles+for+Cancer+Therapy%3A+Design+and+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">A Radio-Frequency Coupling Network for Heating of Citrate-Coated Gold Nanoparticles for Cancer Therapy: Design and Analysis.</a> IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 58, 10(2011).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negligible+absorption+of+radiofrequency+radiation+by+colloidal+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Colloid+Interf.+Sci%22%5BJournal%5D)">Negligible absorption of radiofrequency radiation by colloidal gold nanoparticles.</a> J. Colloid Interf. Sci. 358, 47(2011).</li>
<li>Liu, X., Chen, H. J., Chen, X., Parini, C., Wen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+frequency+heating+of+gold+nanoparticle+dispersions+for+non-invasive+thermal+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Low frequency heating of gold nanoparticle dispersions for non-invasive thermal therapies.</a> Nanoscale. , (2012).</li>
<li>Sassaroli, E., Li, K. C. P., O'Neill, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radio+frequency+absorption+in+gold+nanoparticle+suspensions%3A+a+phenomenological+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+D+App.+Phys%22%5BJournal%5D)">Radio frequency absorption in gold nanoparticle suspensions: a phenomenological study.</a> J. Phys. D App. Phys. 45, 075303(2012).</li>
<li>Worle-Knirsch, J. M., Pulskamp, K., Krug, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oops+they+did+it+again%21+Carbon+nanotubes+hoax+scientists+in+viability+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Oops they did it again! Carbon nanotubes hoax scientists in viability assays.</a> Nano Lett. 6, 1261(2006).</li>
</ol>

우리는 공개 아무것도 없어.

이러한 프로토콜은 실험자 완전히 (이 경우는 금 나노 입자) 암 치료를위한 RF 유도 고열을 증가 할 수있는 나노 정도를 분석 할 수있다. 첫 번째 프로토콜은 특히 고농도 정제 AuNP 샘플에서 열 생산을 분석 다룬다. 다른 그룹은 주로 금 나노 입자는 금 나노 입자 자체 9-11 아니라 현탁 버퍼로부터 열 생산을보고되었지만, 그들의 RF 시스템은 직경이 금 나노 입자의 낮은 농도&gt; 10 ㎚뿐만 아니라, 함께 저급 RF 운영 권한을 사용한 전기 전계 강도 &lt;금 나노 입자에서 눈에 띄는 RF 난방 효과를보고 너무 낮은 90 kV의 / m. 만이 보고서에 나열된 프로토콜과 매개 변수에 따라 실험자은 나노 열 현상을 관찰 할 수 있습니다. 생체 부분은 셀룰러 RF-NP 인터페이스의 개발에 최적화 된 RF / NP 유도 고열 공부를 할 수 있습니다. BEF금 나노 입자 및 RF 노출 광석 첨가하면 (이 경우에는 인 Hep3B에서) 관련 ...

(때문에 고유의 전기 유전율) 생체 조직에 의한 RF 에너지의 흡수는 결국 고열에 의해 세포 죽음에 이르게 시간의 함수로 높은 조직의 온도에서 발생합니다. 그것은 암 고열이 암세포 내에 내부화 그대로 인접 건강한, 정상 세포를 남기고 RF-열 변환기로서 작용 대상 나노 물질의 사용을 통해 최적화 될 수 있다고 가정한다. 몇몇 보고서는 이미 국민 연금 다양한하는 암 괴사 1-4 원조 효과적인 RF 열원의 역할을 할 수있는 것으로 나타났습니다. 이들 관해서, 금 NP에 (금 나노 입자) 3-5, 탄소 나노 튜브 1 및 양자점 06 모두 시험 관내 및 생체 내 RF 실험에 사용될 때 7 흥미로운 특성을 나타내왔다. RF 필드에 노출이 된 NP의 가열기구의 정확한 특성은 여전히​​ 논의되고 있지만, 일련의금 나노 입자를 사용하여 기본적인 실험은 NP의 크기와 응집 상태 모두에서 큰 의미를 두었다. 그것은 RF 필드 8에 노출되면 직경 &lt;10 nm의 만 금 나노 입자를 가열 할 것으로 나타났다. 금 나노 입자가 응집되는 경우이 가열기구는 크게 감쇠된다. 이 집계 조건은 효과적인 RF 치료 4 endolysomal 세포 구획 내에서 AuNP 콜로이드 안정성을 최적화에 중요성을 배치 체외 모델 내에서 확인되었다. 그러나,이 데이터를 수집하고 평가하는 데 사용되는 기술과 실험 원리 특히 NP 콜로이드로부터 RF 열 프로파일을 검증하는 경우에 문제가 될 수있다. 몇몇 보고서는 국민 연금이있는 일시 중단 배경 이온 정지 줄 난방의 주요 RF 열 생산의 소스가 아닌 국민 연금 자체 9-12 될 수있는 것으로 나타났습니다. 우리의 최근 종이 (8)는 t을 확인했지만그는 10 ㎚ 이하의 직경의 금 나노 입자의 열을 생성하는 RF 상호 작용의 사용, 우리는이 문서를 통해보다 자세히 이러한 프로토콜을 설명하는 것을 목표로하고 있습니다. 또한 프로토콜 및 시험 관내 및 간암 모델 생체 내 실험에서 모두 온열 열 보호제로서 금 나노 입자의 효과를 평가하기 위해 필요한 기술들을 설명한다. 우리는 구연산 덮인 금 나노 입자의 간단한 콜로이드에 주로 초점을하지만, 동일한 기술은 항체 및 화학 요법 복합 단지와 같은 다른 AuNP 하이브리드에 적용 할 수 있습니다. 이러한 원칙을 준수하여 실험자 희망 빠르게 효과적인 RF 유도 열 온열 요원이 될 수있는 나노 물질에 대한 가능성을 평가 할 수 있어야한다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">시약/재료</</td></tr><tr><td>strong>500 ml 금 나노 입자(5nm)</td><td>Ted Pella, INC</td><td>15702-5</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4/-15 원심 필터 장치(50 kDa)</td><td>Millipore</td><td>UFC805024/UFC910096</td><td>(4 ml 및 15 ml 용량)</td></tr><tr><td>MEM X1 세포 배양 배지</td><td>Cellgro</td><td>10-101-CV(</td><td>필요에 따라 추가 영양소 추가)</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma</td><td>F4135-500 ml</td><td></td></tr><tr><td>구리 테이프</td><td>Ted Pella</td><td>16072</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Kanzius RF System (13.56 MHZ)</td><td>ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IR Camera</td><td>FLIR SC 6000, FLIR Systems, Inc. (Boston, MA, USA)</td><td>Contact FLIR</td><td></td></tr><tr><td>1.3 ml Quartz Cuvette</td><td>ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotary Stage ThermMed</td><td>, LLC, Inc. (Erie, PA, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPECTROstar Nano Microplate reader</td><td>BGM Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV-Vis spectrometer</td><td>Applied Nanofluorescence, Houston, TX)</td><td>NS1 NanoSpectralyzer</td><td></td></tr><tr><td>ICP-&#8211; S</td><td>PerkinElmer</td><td>Optima 4300 DV</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer</td><td>Malvern</td><td>Zen 3600 Zetasizer</td><td></td></tr></tbody></table>

비 침습 온열 암 치료를위한 금 나노 입자 및 생물 시스템과 고주파의 상호 작용을 평가하기위한 프로토콜

Protocols for Assessing Radiofrequency Interactions with Gold Nanoparticles and Biological Systems for Non-invasive Hyperthermia Cancer Therapy

기존에 비해 독성이 덜하고 침략 암 치료는 매우 바람직하다. 최소한의 독성을 일으키는 깊이 체내에 침투 RF 전기 필드의 사용은, 현재 비 침습성 암 치료의 유력한 수단으로 연구되고있다. 이는 나노 입자를 내재화 공단과 RF 에너지의 상호 작용이 궁극적으로 세포 괴사로 끝나는, 다음 셀 (고열)가 과열 될 수있는 열을 해방시킬 수있는 것이 구상된다. 비 생물학적 시스템의 경우, 우리는 고농도 NP 콜로이드에 의해 해방 된 열을 정량화에 관한 자세한 프로토콜을 제시한다. 생물학적 시스템의 경우, 시험 관내 실험의 경우, 우리는 효율적으로 크게 데이터를 모호하게 대량 미디어 난방 유물없이 RF 에너지에 암 세포를 노출하기 위해 준수해야하는 기술과 조건을 설명합니다. 마지막으로, 우리는 상세한 방법론 F 줄또는 이소성 간 암 종양 생체 마우스 모델에서.

1. 예를 들어 금 나노 입자 : NP 콜로이드의 RF 가열을 평가. 1.1 절 다음 한 - 1.2.3을 5 나노 미터, 10 나노 미터 직경의 금 나노 입자의 고도의 집중, 안정, 정제 솔루션을 기대합니다. 원액을 구입 한 그대로, 500 ㎖에서 1000 ㎎ / L의 농도에서 용액의 적어도 4 밀리리터를 구하는 것이 기대 금 나노 입자와이 농도의 배경 DI 물 완충 용액 사이의 홈런의 차이는해야 ~ 0.25 ° C / 초 및 그림 2에 나타낸 바와 같이 각각 5 ㎚, 10 ㎚의 금 나노 입자, 0.1 ° C / 초. 2. 나노 입자를 이용한 RF-유도 고열 : 시험 관내 연구 결과는 이상적으로 금 나노 입자를 내면화 한 RF 필드에 노출 된 세포가 아닌 AuNP RF 노출 된 세포보다 실행 가능한 것을 보여...

우리는 13.56 MHz의 고주파 (RF)의 상호 작용을 조사하는 데 사용되는 프로토콜을 설명하는 두 비 생물학적, 생물학적 시스템 (생체 외 / 생체)의 금 나노 입자 콜로이드와 전기 분야. 이러한 상호 작용은 암 치료에 응용 프로그램에 대한 조사를 받고 있습니다.

Cancer therapies  which are less toxic and invasive than their existing counterparts are highly  desirable. The use of RF electric-fields that penetrate ...

본 절차의 전반적인 목표는 in vitro 및 in vivo 환경에서 13.56 megahertz 무선 주파수 전기장 내 금 나노입자의 가열 특성을 평가하는 것입니다. 이는 먼저 쿼츠 벳(quartz vet) 내에서 농축된 금 나노입자와 그 완충액의 가열 속도를 평가함으로써 수행됩니다. 본 절차의 두 번째 단계는 배양된 암세포를 이용하여 금 나노입자의 in vitro 독성 연구를 수행하는 것입니다.세 번째 단계는 이소성 마우스 암 모델에서 금 나노입자의 in vivo 연구를 수행하는 것입니다. 최종적으로, 현탁액 상태의 나노입자 분석과 in vitro 및 in vivo 분석을 통해 조사된 나노입자가 RF 매개 온열 치료에 효과적인 제제가 될 수 있는지 여부를 확인할 수 있습니다. 이 방법은 입자 자체로 인해 가열이 발생하는지, 그리고 이를 치료 목적으로 사용할 수 있는지와 같이 나노입자 매개 비침습적 무선주파수 온열 치료 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.일반적으로 이 방법이 처음인 연구자들은 이러한 유형의 실험을 수행하기 위한 정립된 프로토콜이 많지 않아 어려움을 겪을 수 있습니다. 본 절차의 시연은 연구원 Cisneros, 박사후 연구원 Stuart Core, 그리고 또 다른 박사후 연구원 Leila Green이 진행합니다. 예시로서, 직경 5 nm의 상용 500 milliliter 금 나노입자 용액 병으로 시작하십시오.금 나노입자 스톡 용액 약 125 milliliters를 취하여 6개의 50 kilodalton 원심분리 필터 튜브에 나누어 담고, 나노입자를 3000 RPM에서 2분 5초 동안 원심분리합니다. 여과된 버퍼인 상층액을 제거하고, 각 필터에 스톡 용액을 다시 채웁니다.모든 나노입자 용액이 여과될 때까지 원심분리와 버퍼 제거, 그리고 튜브 재충전을 계속합니다. 마지막 첨가 후, 여과된 버퍼를 비슷한 부피의 탈이온수로 교체하고, 여과된 버퍼 샘플을 RF 장치에 로딩한 후 이 과정을 약 8회 더 반복합니다. 적외선 카메라 소프트웨어를 사용하여 QVE 위에 박스를 생성해 가열 프로파일을 캡처합니다. 8회의 세척 후, 5 nm 금 나노입자 여과액의 가열 데이터는 탈이온수의 데이터에 근접하게 됩니다.UV-vis 분석은 오염 물질의 흡수 피크를 모니터링하는 데에도 사용될 수 있습니다. 여기에 표시된 것은 깨끗한 스펙트럼입니다. 버퍼 오염 물질이 완전히 제거되면, 필터 튜브 내의 필터에서 나노입자를 분리하여 0.5 milliliters의 탈이온수에 나노입자를 현탁시킵니다.그런 다음 6개의 현탁액을 모두 하나의 15 milliliter 튜브에 합칩니다. 이제 UV VIS 및 제타 전위를 사용하여 샘플을 분석하여 안정성 데이터를 얻습니다. I-C-P-O-E-S 또는 ICP 질량 분석법을 사용하여 나노입자 농도를 결정합니다.Kansas RF 시스템 또는 부하 유도체, 1.3 milliliter 시린지 쿼츠 vete를 사용하여 형태학적 데이터를 얻기 위해 SEM 및/또는 TEM 분석을 사용할 수 있으며, Q vete가 위치할 공기 중의 RF 전기장을 약 90 kilovolts per meter로 설정합니다. 0.9% sodium chloride가 포함된 표준 식염수 시료의 경우, 전기장은 약 1.1 kilovolts per meter로 감소합니다. 이는 서로 다른 RF 시스템 간의 비교가 가능하도록 설정한 대략적인 조건입니다.이제 깨끗한 석영 큐벳에 1000 mg/L 농도의 정제된 금 나노입자 현탁액 1.3 mL를 채웁니다. 시료를 RF 전장에 120초 동안 또는 시료의 온도가 70 °C에 도달할 때까지 노출시킵니다. 과도하게 노출되면 전기 아크가 발생하거나 급격한 끓음 현상이 나타날 수 있습니다.IR 카메라와 관련 소프트웨어를 사용하여 열 화상 데이터와 대조 영역을 캡처합니다. 동일한 샘플에 대해 이 과정을 세 번 반복합니다. 이제 샘플을 또 다른 50 kilodalton 원심분리 필터로 여과하여 수성 버퍼로부터 금 나노입자를 추출합니다.그런 다음 버퍼만 다시 RF 장에 노출시킵니다. 마찬가지로, 금 나노입자 콜로이드와 여과액 사이의 hrs 차이를 세 번 측정하여 금 나노입자 자체에 의한 HR을 결정합니다. 마지막으로, 필터에 남은 금 나노입자를 1.3 milliliters의 물에 현탁하여 추가 실험에 사용합니다.이러한 in vitro 연구는 2D 단층을 형성하는 모든 유형의 암세포에 적용할 수 있습니다. 본 예시에서는 인간 간세포암 유래 Hep three B 세포를 사용하여, 12-well 플레이트의 3개 웰에 1 mL의 성장 배지와 함께 약 50,000개의 세포를 분주합니다.나노입자 연구를 위해 플레이트 3개가 채워질 때까지, 그리고 대조군으로 플레이트 3개가 채워질 때까지 배지를 사용하여 세포를 계속 배양합니다. 플레이트를 37.5 °C에서 24시간 동안 배양합니다. 다음 날, 대조군 플레이트를 제외한 3개의 나노입자 플레이트의 각 웰에 1000 mg/L 금 나노입자 용액 0.1 mL를 첨가합니다.각 웰에 물 0.1 milliliter를 넣고 모든 플레이트를 24시간 동안 더 배양합니다. 24시간 후에 세포 배양액을 흡입하여 제거하고 PBS로 세포를 세척하여 표면에 결합된 금 나노입자를 모두 제거합니다. 그 다음 세포 배양액을 다시 채워줍니다.이제 세포가 RF 노출 준비가 되었습니다. 각 12-well 세포 팩을 RF 필드 내에 배치하고 세포 온도가 31 °C로 낮아질 때까지 기다립니다. 온도가 약간 낮아지면 세포에 3.5분 동안 rf를 노출시킵니다.세포 배지의 최종 온도는 약 37°C가 됩니다. 세포를 인큐베이터로 옮기고 분석 전까지 24시간 동안 배양합니다. 세포 준비가 완료되면 배지를 흡입하여 제거하고, 배지에 희석한 25% MTT 시약 2mL로 교체합니다.그다음 세포를 4시간 동안 더 배양합니다. 이어서 MTT 배지를 2 mL의 DMSO로 교체합니다. DMSO가 MTT 시약을 용해시킬 수 있도록 세포 플레이트를 벤치 로커(bench rocker) 위에 10분 동안 둡니다.마지막으로, 각 웰에서 100 µL의 샘플을 취해 96웰 플레이트에 분주하고 570 nm에서 광학적으로 측정합니다. 이러한 in vivo 연구는 정위 또는 이위 모방 모델에서 고형 종양을 형성하는 모든 유형의 암에 적용될 수 있습니다. 본 예시에서는 BPC 누드 마우스와 함께 Hep three B 간암 세포가 사용되었습니다.약 100,000개의 세포로 시작하여 trypsin 처리 후 세포를 얼린 다음, 25 µL당 2백만 개의 세포가 포함된 용액을 제조합니다. 세포 현탁액에 동일한 양의 얼음처럼 차가운 Matrigel을 첨가하고 피펫으로 반복적으로 흡입하여 충분히 혼합합니다. 이제 혼합된 현탁액을 각 동물의 등 부위 중 원하는 위치에 주입합니다.몇 주 후, 종양의 크기가 0.5~1cm 정도가 되면 RF 치료를 시작하고, 케타민과 자일라진 용액을 복강 내(IP) 주입하여 마우스를 마취시킨 후 체온을 유지합니다. 그다음 27 또는 30게이지 바늘이 장착된 1cc 주사기를 사용하여 금 나노입자를 종양의 절반에 직접 주입합니다. 수술용 면봉으로 혈액을 흡수하고 알코올 솜으로 주입 부위를 닦아냅니다.대조군으로서, 종양의 나머지 절반에는 PBS만을 주입합니다. 이제 각 그룹의 생쥐 절반을 처리합니다. 생쥐를 RF 발생기의 수신 헤드에 고정하고, 눈, 귀, 발가락을 포함하여 처리하지 않는 부위를 구리 테이프로 차폐합니다.이 실험에서 가장 중요한 부분은 마우스의 적절한 접지입니다. 적절한 접지가 이루어지지 않으면 동물에게 전하가 축적되어 열 손상이나 전기 피부 손상이 발생할 수 있습니다. 이는 쉽게 예방할 수 있습니다.종양을 투과 헤드로부터 원하는 치료 부위 너비보다 최소 1cm 더 떨어진 곳에 위치시킵니다. 이제 종양과 치료 영역이 보이도록 IR 열화상 카메라를 배치합니다. RF를 5분 동안 작동시키고 그에 따른 온도 곡선을 기록합니다.피부 표면 온도가 42 °C 이상으로 상승하면, RF 조사 후 즉시 치료를 중단하십시오. 마우스가 의식을 회복할 때까지 보온 챔버에서 회복시키십시오. 3주 동안 일주일에 두 번 치료를 반복하십시오.그 후 마지막 RF 노출 48시간 후에 마우스를 안락사시키고 종양을 처리합니다. 정제된 금 나노입자의 RF 가열은 나노입자와 배경인 탈이온수 완충액 사이의 hrs 차이로 결정되었습니다. 결과는 5 nm 및 10 nm 나노입자 모두에서 예상대로 나타났습니다.정제된 금 나노입자가 인간 간세포암 유래 Hep three B 세포 내로 통합되었습니다. 이러한 세포가 RF 전장에 노출되면, 일반적으로 나노입자가 내부화되지 않은 채 RF에 노출된 세포보다 생존율이 낮아집니다. 그림 3은 사용된 금 나노입자 자체가 가지는 독성은 제한적이지만, RF에 의해 유도되는 세포 독성 특성은 매우 뛰어난 이상적인 시나리오를 보여줍니다. 다양한 유형의 나노물질을 이용한 현재까지의 인 비트로(in vitro) 결과에 대한 포괄적인 검토는 관련 문헌을 참조하십시오.Hep three B 간암 세포를 이용하여 발가벗은 생쥐(babsi nude mice)의 등에 종양을 형성시켰습니다. 이 종양들에 PBS에 현탁된 금 나노입자를 주입한 후 RF 노출을 실시하였습니다. 처리 후 분석 결과, 해당 처리가 종양 성장을 억제하고 종양 질량을 감소시킨 것으로 나타났습니다.이 영상을 시청한 후에는 나노입자의 RF 응답 특성과 in vitro 및 in vivo 용액 상태에서의 특성을 결정함으로써, RF 매개 하이퍼서미아(hyperthermia)에 사용하기 위한 나노입자 평가 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. 고출력 RF 전기장을 다루는 작업은 매우 위험할 수 있다는 점을 잊지 마십시오. 활성화된 전기장 내부에 손을 대거나 접근하지 마십시오.전기장을 측정하고, 필요한 경우 패러데이 케이지와 같은 적절한 차폐 장치를 사용하십시오. 일반적으로 지속적인 고강도 전기장에 노출되는 것을 항상 최소화해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

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마우스의 긴 기간 온 몸이 고열에 대한 프로토콜

습식 화학적 접근 방식으로 생성된 다기능 Fe2O3-Au 나노 입자의 합성 및 특성을 설명하고 레이저 조사를 사용하여 광열 특성을 조사합니다. 복합 Fe2O3-Au 나노 입자는 두 재료의 특성을 모두 유지하여 우수한 자기 및 플라즈몬 특성을 가진 다기능 구조를 생성합니다.

다기능 하이브리드 철<sub&gt; 2</sub&gt; O<sub&gt; 3</sub&gt; 효율적인 플라즈몬 난방을위한 -Au 나노 입자

여기에 제시된 자기 조립을 통한 산화철 나노입자 껍질 마이크로버블(NSM)의 제조를 위한 프로토콜이 제시되어, 자기 고열증 및 광열 병용 암 치료를 위한 하나의 나노치료 플랫폼에서 자기 조립, 자기, 음향 및 광학 반응성을 시너지 효과를 낼 수 있다.

자기 고열증 및 포토열 조합 암 치료를 위한 자기, 음향 및 광학 삼중 반응 마이크로 버블

이 프로토콜은 정교한 전달 및 모니터링 시스템을 사용하여 자성 나노입자 온열요법의 정확한 전달에 필요한 기술과 방법론을 제시합니다.

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