장기 상승 작용으로 매우 안정하고 재현성 기록을위한 향상된 준비 및 해마 마우스 조각의 보존

이 논문은 준비하고 유지하는 완벽한 방법을 제공합니다

이 절차의 전반적인 목표는 급성 해마 절편에서 매우 안정적이고 재현 가능한 장기 강화를 기록할 수 있는 것입니다. 이것은 먼저 쥐의 뇌를 추출하고 현미경으로 차가운 A CSF에서 해마를 해부함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 조직 초퍼로 가로 해마 조각을 자르는 것입니다.

다음으로, 절편을 계면 기록 챔버에 넣고 산소가 공급된 인공 뇌척수액으로 관류합니다. 마지막 단계는 전극을 배치하고 해마의 한 부위인 CA에서 시냅스 활동을 기록하는 것입니다. 궁극적으로, 고주파 자극 프로토콜은 매우 안정적인 장기 강화의 유도를 보여주는 데 사용됩니다.

이 방법을 통해 시냅스 가소성의 기저에 있는 메커니즘에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 신경 퇴행성 또는 신경계의 동물 모델 또는 면역 질환과 같은 다른 시스템에 적용 할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 모든 조작에 뛰어난 기술과 많은 연습이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.

최소 20분 동안 증류수로 관류 회로를 헹구어 이 절차를 시작합니다. 그런 다음 난방 시스템을 켭니다. 서킷에서 카보겐 버블링을 시작합니다.

탄소는 공기 확산기를 통해 기록 챔버 아래의 수조로 전달됩니다. 다음으로, 유량계로 수조의 유량을 제어 한 후 회로를 배수하고 여과 된 A CSF 두드리기로 채워 거품을 제거합니다. 그런 다음 홀딩 챔버에서 슬라이스를 지지할 링을 놓습니다.

회로에서 모든 기포를 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 흡입 바늘의 나사로 기록 챔버의 A CSF 수준을 조정하고 입구 펌프의 속도를 분당 1밀리리터로 조정하고 출구 펌프를 분당 5밀리리터로 조정합니다. 절개 전에 모든 수술 기구를 준비하십시오.

희생된 쥐의 뇌를 제거합니다. 검지와 엄지손가락으로 머리를 잡고 절개 가위로 머리 꼭대기 중앙을 따라 단두대 가장자리에서 시작하여 전두골까지 자르고 뻗어 절개합니다. 그런 다음 머리 양쪽의 피부 근육을 잘라 두개골 플레이트를 완전히 노출시킵니다.

그런 다음 머리의 꼬마 쪽에 있는 근육을 제거합니다. 그런 다음 측두엽 플레이트를 따라 양쪽의 측두근을 자릅니다. 그런 다음 중간의 정면 플레이트를 가로로 자릅니다.

이제 두 판 사이의 후두골을 약간 자릅니다. 양쪽에 있는 후두판의 코들 바닥을 자릅니다. 그런 다음 스프링 가위로 시상 봉합사를 따라 자릅니다.

마지막으로 집게로 반쪽을 서로 벌려 두개골을 제거합니다. 이제 소뇌 바로 앞과 후각 전구 바로 뒤의 메스를 잘라낸 다음 가로로 추출한 뇌를 차가운 A CSF가 있는 해부 접시로 옮깁니다. 해부 접시에서 뇌가 나오면 양안 수술 현미경으로 중간에 메스를 삽입하여 두 반구를 서로 절단하고 한쪽 반구의 구조를 조심스럽게 펴서 측면 심실을 드러냅니다.

뇌간과 두부는 전두엽 피질에 한 대, 두부에 다른 주걱을 올려 제거합니다. 주걱으로 해마를 만지지 않도록 주의하고 조직 절편 시 잡아당기지 않도록 주의합니다. 그 후, fornix를 절단하십시오.

그런 다음 심실에 주걱을 삽입하여 해마를 피질 밖으로 부드럽게 밀어냅니다. 해마가 추출되면 입이 넓은 플라스틱 목초지 피펫으로 과도한 피질 조직과 남아 있는 혈관을 제거합니다. 숟가락에 담긴 해마를 알비 표면이 위쪽으로 향하게 하여 헬리콥터의 플랫폼으로 옮깁니다.

표준 플라스틱 목초지 피펫으로 숟가락에서 과도한 액체를 제거하십시오. 그런 다음 숟가락을 세로로 기울이고 헬리콥터의 여과지에 거의 닿을 정도입니다. 여과지를 빠르게 만져 해마를 떨어뜨립니다.

그런 다음 숟가락을 빼냅니다. 다음으로, 해마의 방향을 잡고 자릅니다. 초퍼로 가로로 400미크론까지.

가능한 한 빨리 절차를 수행합니다. 그런 다음 해마 조각이 있는 여과지를 제거하고 조각을 약간 펴기 위해 금속 실린더 주위를 감쌉니다. 그런 다음 표준 플라스틱 목회 피펫을 사용하여 A CSF 스프레이로 조각을 풀고 냉기로 채워진 페트리 접시에 모으십시오.

CSF입니다. 선택한 슬라이스를 표준 플라스틱 과거 피펫을 사용하여 기록 챔버로 옮깁니다. 슬라이스가 섭씨 28도의 기록 인터페이스 챔버에서 해부 외상으로부터 회복되도록 합니다.

슬라이스가 A CSF 수준을 슬라이스 수준으로 낮추면 A CSF 수준을 다시 올려 슬라이스가 떠오르도록 합니다. 그런 다음 CA 한 영역에서 전극 배치를 용이하게 하는 위치로 슬라이스를 배치합니다. 인터페이스에 있을 때 A CSF 수준을 낮추지 마십시오.

슬라이스 주위의 매체의 반월판은 충분한 수준의 A CSF를 나타냅니다. 메쉬는 미디어로 포화되어야 하지만 완전히 잠기지 않아야 합니다. 그런 다음 구멍이 뚫린 뚜껑 위에 여과지로 챔버를 덮은 상태로 유지하십시오.

기록하기 전에 슬라이스를 섭씨 28도에서 최소 1시간 30분 동안 그대로 두십시오. 다음은 두 개의 독립적인 시냅스 입력이 동일한 뉴런 집단에 대해 1과 S, 2로 표시되는 스케치입니다. S 하나의 경로는 LTP를 유도하는 데 사용되었고 S 두 개의 경로는 대조군으로 작용했습니다.

이는 빨간색 트레이스로 표시된 LTP 인덕션 직전과 파란색 트레이스로 표시된 LDP 인덕션 1시간 후에 기록된 샘플 F-E-P-S-P 트레이스입니다. 다음은 완벽하게 건강한 슬라이스의 F EPSP이고, 다음은 슬라이스가 완벽하게 건강하지 않을 때 높은 수준의 흥분성을 나타내는 슬라이스의 F EPSP입니다. 폴리 시냅스 반응이 관찰되고 F-E-P-S-P 경사 강화가 감소합니다.

본 연구실에서 2005년, 2010년, 2011년에 기록된 단일 고주파 자극 트레인에 의해 유도된 LTP 후 F-E-P-S-P 경사의 시간 경과를 비교한 것입니다. 첫 번째 실험은 2005년에 기록되었으며 채워진 원으로 표시되었습니다. 채워진 사각형으로 표시된 후속 기록은 개선된 해부 절차의 이점을 얻었습니다.

현재의 결과는 열린 원으로 표시된 전극 표준화와 함께 계면 산소화 및 온도 제어의 최적화에서 발생합니다. 여기에서 우리는 파란색 곡선으로 표시된 것처럼 기록 챔버 아래 수조의 산소 유량을 분당 0.15리터에서 0.25리터로 증가시키면 F-E-P-S-P 기울기가 20% 감소하여 온도를 섭씨 28도에서 29도로 증가시킨다는 것을 보여줍니다. 표시된 바와 같이 녹색 곡선은 F-E-P-S-P 기울기를 50% 이상 증가시킵니다.

이 절차를 시도하는 동안 모든 단계가 중요하며 프로토콜의 오류로 인해 다른 결과가 발생할 수 있음을 기억하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청하면 매우 안정적인 장기 강화를 얻는 방법을 잘 이해할 수 있습니다. 급성 해마 조각으로 녹음.