Name: 장기 상승 작용으로 매우 안정하고 재현성 기록을위한 향상된 준비 및 해마 마우스 조각의 보존 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: 학습하세요 성인 마우스 해마 급성 절편을 준비하고 보존하는 방법을 통해 8시간 이상 지속되는 매우 안정적인 장기 강화(LTP)를 기록하는 기법을. 이 프로토콜은 시냅스 가소성 메커니즘 연구에 필수적입니다.

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우리는 기술 지원 버나드 Foucart 감사합니다. 이 작품은 과학 연구를위한 벨기에 기금 (FRS-FNRS)에 의해 의료 연구를위한 엘리자베스 여왕 기금에 의해 지원되었다. 아녜스 빌러는 과학 연구를위한 벨기에 기금의 연구원입니다.

모든 동물의 절차는 연구에 동물의 관리 및 사용에 대한 보건 규정의 국립 연구소에 따라 그리고 지역 윤리위원회의 계약을 수행 하였다. 1. 인공 세리 - 척수의 준비 동일한 매체가, 해부 잘라 휴식 기간 전기 생리학 녹음하는 동안 조각 (1 ML / 분) 붓는다하는 데 사용됩니다. 이 매체는 124 mM의 NaCl을 4.4 mM의 KCl을 26 mM의 NaHCO3를, 1 ㎜의 NaH 2 PO 4, 2.5 MM의 염화칼슘, 1.3 mM의 황산 마그네슘 및 10 MM D-포도당으로 구성되어 있습니다. <ol><li> (1 M) 용액에 이미 황산 마그네슘을 제외한 ACSF 2 L에 대해 서로 다른 구성 요소를 무게. 분말 황산 마그네슘이 높은 흡습성 + 때문에 표준 용액을 사용하여 마그네슘 2의 정확한 농도를 확인 할 수 있습니다. 칼슘 2 + : 마그네슘 2 + 비율이 크게 LTP 유도 및 유지에 영향을14 따라서 ​​그들의 비율은 항상 존중되어야합니다. </li><li> 유리에 염화칼슘을 제외한 모든 구성 요소를 넣어 실린더를 졸업하고 증류수 H 2 O 2 L에 가져다 </li><li> 적극적으로 약동하십시오. 모든 것을 녹일 때, 탱크 (95 % O 2, 5 % CO 2)에 부착 된 수족관 버블과 튜브를 통해 carbogen을 추가합니다. 몇 분 기다린 후 pH를 중탄산염 버퍼의 작용에 의해 7.4로 고정되어 염화칼슘을 추가합니다. </li><li> 냉장 사각 유리 접시에 600 mL를 유지하고 ° C 접시 주위에 얼음을 4로 냉각. 이 매체는 해마 해부에 사용됩니다. </li><li> 나머지 1,400 mL를 필터링하고 삼각 플라스크에 유의하십시오. </li></ol> 2. 전기 생리 조작과 뇌 슬라이스 녹음 챔버의 준비 관류 회로는 2 연동 펌프, 예비 탱크에서 신선한 액체를 펌핑 하나 t에서 다른 펌핑 사용되는 액체로 만든다그는 빈에 챔버를 기록. 신선한 유체는 다시 산소와 중력 (그림 1A)에 의해 인터페이스 녹음 챔버에 도달하기 전에 따뜻하게 집에서 만든 관류 시스템에 추가됩니다. 인터페이스 녹음 챔버는 FST (파인 과학 도구, 밴쿠버, 캐나다, 그림 1B)에 의해 설계되었습니다. 조직 슬라이스는 이동식 잘 링에 부착하고 지속적으로 잘 바늘 흡인의 높이를 조정하여 인터페이스 상태에서 유지 될 수 짠 그물 필터에 배치됩니다. 그 말과 (0.5 mm) 옆 구멍에서 차단 집에서 만든 플라스틱 관은 챔버 수준의 안정성을 높이기 위해 흡입 바늘로 고정됩니다. 기록 헤드는 기록 헤드 (물방울 형성​​을 감소하는)의 편향 포트를 통해 습한 공기를 전달하여 습한 환경을 유지하는 데 도움 가스 분산 돌을 포함하는 물을 욕조에 장착됩니다. 목욕 및 중간 온도는 지속적으로 DC 전류 일의 수준을 변화시킴으로써 제어거친 실리콘 고무가 내장 된 수조에 히터 요소입니다. 물 목욕 및 녹음 우물 서미스터 챔버 온도는이 사이트에 설정하고 정확하게 모니터링 할 수 있습니다. 실의 난방 시스템은 전체 장비의 온도를 제어하는​​ 글로벌 난방 시스템에 의해 완료됩니다. 에든버러 대학 (연구자에 의해 개발 된 소프트웨어 <a href="http://www.etcsystem.com" target="_blank">www.etcsystem.com는</a> ) 산소 공기의 온도, 뇌 슬라이스, 전극 및 장기 레코딩 (그림 1C)를위한 안정적인 환경을 제공하는 나머지 장비를 모니터링하고 이퀄라이제이션 . 마우스 해마 슬라이스에 사용되는 온도는 28 ° C.이다 <ol><li> 20 분의 최소 증류수 H 2 O와 모든 관류 회로를 헹구고 난방 시스템을 시작합니다. </li><li> 회로의 carbogen 버블 링을 시작합니다. Carbogen f를 통해 집에서 만든 관류 관에 도착ilter 초 및 기록 챔버 아래에 목욕한다. 물 목욕 유량은 유량계에 의해 제어됩니다. 흐름 속도가 너무 느린 경우, 조직 저산소증 될 수 있습니다. 유량이 너무 높으면 반대로, 가스는 충분히 따뜻하게하고 조직의 건조로 이어지는 습기를하지 않을 수 있습니다. 높은 가스 유량은 삼투 충격을 선도 아래에 목욕에서 조직에 살포 물의 가능성을 높일 수 있습니다. 이 편향 포트의 출구 나일론 메쉬 비트 (100 μM)을 첨가하여 방지 할 수 있습니다. </li><li> 회로를 배수하고 필터링 ACSF와 입력하십시오. </li><li> 보유 챔버에서 슬라이스를 지원하는 반지를 넣어. 500 ~ 750 μm의에 이르기까지 메쉬 개구부 짠 그물 필터는 두 부분 에폭시 수지 접착제로 뻗어 고리에 연결되어 있습니다. 짠 그물 필터는 87 % 폴리 아미드와 13 % 스판덱스 (팬티 15 덴)로 만든다. 접착제 린의 표면 릴리프의 형성을 피하기 위해 신중하게 적용해야g. </li><li> 회로에서 모든 공기 방울을 조심스럽게 제거합니다. </li><li> 흡입 바늘의 나사를 기록 챔버에서 ACSF의 레벨을 조정합니다. 연동 펌프의 속도는 유입 펌프 1 ML / 분에 5 ML / 콘센트 펌프 분으로 조정됩니다. </li></ol> 관류 시스템은 엄격한 내진 테이블에 배치하고 패러데이 케이지에 의해 둘러싸여 있습니다. 3. 해부 영역의 준비 수술기구 : # 11 블레이드 스탠다드 해부 가위, 봄, 가위, 곡선 포셉, 두 HEIDEMANN spatulae와 숟가락 메스. 보충 자료 : 단두대,있는 underpad, 면도날 맥일 웨인 조직 헬기, 필터 종이, 고무 젖꼭지와 유리 파스퇴르 피펫, 2 플라스틱 파스퇴르는 넓은 입, 페트리 접시의 금속 실린더 중 하나를 피펫 7mm 직경 (그림 2A). <ol><l난&gt; 차가운 ACSF (단계 1에서 제조) 가득 해부 접시에 필터 종이에 싸서 염색 접시에서 냉장 유리 뚜껑을 담그지. 조심스럽게 수족관 버블 (그림 2A)를 통해 기포 및 산소 ACSF를 제거합니다. </li><li> 사용 순으로 악기를 배치. 조직 헬기 플레이트와 증류수와 에테르 (그림 2B)로 세척 새로운 면도날에 필터 종이의 세 가지 레이어를 추가합니다. 이 종이에 닿을 때 면도날은 수평이어야한다. 블레이드 힘은 최대 값의 약 삼분에 최대 값과 속도의 절반으로 조정됩니다. </li><li> 당신이 나중에 시간이 없기 때문에 모든 (악기, 온도 ...) 준비가되어 있는지주의 깊게 확인합니다. </li><li> 차가운 ACSF 가득 파스퇴르 피펫과 절개를 살포 사람을 부탁드립니다. </li><li> 잘린 전에 Nembutal IP (100 ㎎ / ㎏)로 마우스를 마취. 할로 탄 마취도 사용할 수 있습니다. 우리는 방법과 obta을 모두 비교 한동일한 결과를 ined. 잘린 마취하에 수행해야하지만 자궁 경부 전위도 사용할 수 있습니다. 그러나 자궁 경부 전위 동물의 고통을 피하기 위해 매우 좋은 연습이 필요합니다. </li><li> 추운 ACSF 연속에서 샤워 가능한 한 빨리있는 underpad에 해부. </li></ol> 4. 뇌 제거 <ol><li> 총구에 한 손의 검지 손가락과 엄지 손가락으로 여전히 머리를 들고있는 동안, 단두대 컷의 가장자리에서 시작하여 정면 뼈 rostrally 실행하는 머리의 상단 중앙을 따라 해부 가위로 절개를 . </li><li> 완전히 두개골 판을 노출하고 머리의 꼬리 측에 근육을 제거하는 머리의 각 측면에 피부 근육을 잘라. </li><li> 해부 가위, 각 측면에 측두근 근육을 잘라 측두근 판을 따라, 그 횡단, 중앙에 정면 플레이트를 잘라. 그런 다음 두 개의 PL 사이의 후두 뼈에 약간의 상처를 만들ATES. </li><li> 각 측면에 대해, 후두 격판 덮개의 꼬리 기지에서 잘라. </li><li> 스프링 가위로 시상 봉합을 따라 잘라. </li><li> 포셉, 서로를 멀리 확산에 의해 두개골 반쪽을 제거합니다. </li><li> 메스, 단지 후각 망울 후 횡단 잘라 소뇌는 차가운 ACSF과 해부 접시에 추출 된 뇌 자녀들의 나이를 직전. </li></ol> 5. 해마 해부 <ol><li> 뇌 해부 접시에 immerged되면​​, 중간에 삽입 메스 서로의 두 반구를 절단. </li><li> 해마의 박리는 양안 수술 현미경 (X25, 그림 2A)를 통해 시각적으로 제어 spatulae으로 수행됩니다. 하나의 반구에 신중 측면 뇌실을 볼 구조를 확산. 뇌간과 간뇌를 제거합니다. 이 한 쪽 전두엽 피질에 spatulae을 적용하고에 간뇌에 이루어집니다다른 측면. spatulae와 해마를 만지지하고 조직 절편 동안 그것을 스트레칭하지 않도록주의하십시오. </li><li> 원개 다음 부드럽게 뇌실에 주걱을 삽입하여 피질 (굴러)의 해마를 밀어 절단. </li><li> 해마가 추출 될 때, 과도한 피질 조직과 남아있는 혈관을 제거합니다. </li></ol> 6. 조각의 절단 <ol><li> 넓은 입 플라스틱 파스퇴르 피펫으로, 그 알 비어 표면 위쪽 (볼록면)와 숟가락 해마를 전송합니다. </li><li> 표준 플라스틱 파스퇴르 피펫과 초과 액체를 제거합니다. </li><li> 수직으로 거의 헬기의 필터 용지 (그림 2B)를 터치 숟가락을 기울 빠르게 필터 종이를 만져, 숟가락 해마 내려 다음 숟가락을 다시 이동합니다. </li><li> 해마의 방향 및 (hippocam의 방향에 대한 그림 2C를 참조 헬기와 400 μm의 횡단을 슬라이스면도날을 기준으로 고름). 가능한 한 빨리 역할을합니다. </li><li> 슬라이스 해마와 필터 용지를 제거하고 조각 조금을 확산하기 위해 금속 실린더 주위를 감 쌉니다. 그런 다음, 무료 표준 플라스틱 파스퇴르 피펫과 차가운 ACSF 가득 페트리 접시에 그들을 수집을 사용하여 ACSF의 스프레이 조각. </li></ol> 7. 인터페이스의 조각의 배양 <ol><li> 표준 플라스틱 파스퇴르 피펫 조각을 선택하고 빠르게 녹음 챔버에 배치합니다. 조각은 28에서 인터페이스에서 직접 녹음 챔버 해부 외상 복구 ° C. </li><li> 슬라이스는 대부분 싱크됩니다. 슬라이스 수준에 도달하기 위해 유체 수준을 낮 춥니 다하고 그것을 떠 있도록 할 올립니다. </li><li> 레벨을 낮추면서 올바른 위치에 조각을 켭니다. 조각 CA1 영역에서 전극의 위치 (2 자극 한 기록 전극)을 용이하게하기 위해 같은 방법으로 항상 지향합니다. </li><li> 시 정지유체 인터페이스입니다. 슬라이스 주위 매체의 &quot;초승달은&quot;매체의 충분한 수준을 나타내는 것입니다. 넷 필터는 미디어 포화는하지만, 완전히 침수되지해야합니다. </li><li> 구멍 뚜껑 위에 배치 여과지로 덮여 챔버를 유지합니다. </li><li> 28 적어도 1.5 시간 동안 슬라이스 나머지를하자 ° C. </li></ol> 8. 시냅틱 응답의 기록 <ol><li> 전극 기록 : ACSF 가득 할 때 유리 모세관 MΩ 2-5의 팁 저항을 얻기 위해 뽑아됩니다. 필터 종이의 작은 조각은 전극의 끝 부분 주위에 배치되어 뼈 왁스 응축을 줄이기 위해 말단에 적용됩니다. 자극 전극 : 12.5 μm의 직경 백금 - 이리듐 바이폴라 클러스터 전극 FHC (USA)에서 구입. 적절한 치료와 함께, 각 전극은 최소 30 시간 (그림 1B)를 사용할 수 있습니다. </li><li> CA1 지역의 지층 radiatum에 전극을 놓고, 모든 전극 지어최대 (그림 3A). 전극은 Narishige의 미세 조작기와 조각의 표면 아래 75-150 μm의 하향 조정됩니다. 두 자극 전극은 샤퍼 담보의 두 가지 번들을 자극하는 배치됩니다. 전극 슬라이스로 내려 할 때, 여과지주의 깊게 챔버를 닫 모든 주위에 배치됩니다. </li><li> 바이 페이 자극 (반 파장 당 0.08 밀리 초 펄스 지속 시간) SIU-V 절연 장치에 연결된 잔디 자극과 일정한 전압에서 수행됩니다. 최대 응답은 12 V. 필드 EPSPS는 WPI ISO-80 앰프와 1000 배 증폭, 10 Hz에서 10 kHz에서 필터링 최대 2 V에서 자극 강도를 증가에 의해 확인된다. 신호는 국립 악기 A / D 변환기를 통해 PC로 전송됩니다. 자극, 데이터 수집 및 분석 WinLTP 프로그램 (사용하여 수행됩니다 <a href="http://www.winltp.com">www.winltp.com을</a> ). 필드 EPSPS는 입력 아웃에서 얻은 최대 진폭의 40 %에 기록됩니다곡선을 넣어. 각 조각, fEPSP 슬로프는 LTP 유도 앞에 30 분 동안의 평균 기울기에 대한 정규화됩니다. </li><li> LTP는 두 번째 경로는 제어 역할을하면서 하나의 통로에 테스트 강도 자극 한 열차 (100 Hz에서)을 적용하여 트리거됩니다. </li></ol> 9. 설치 청소 <ol><li> 적어도 10 분 동안 과산화수소 (H 2 O 2)의 3 % 용액으로 모든 회로를 씻어 후, 드레인. 회로는 조심스럽게 실험을 시작하기 전에 증류수로 세척한다. 다른 실험실 청소 만 증류수를 사용하지만 물을 사용할 때 우리는 튜브 시스템의 어두운 잔류의 증착을 발견했습니다로서 H 2 O 2를 사용 절대적으로 필요하지 않습니다. </li><li> 녹음 챔버 아래의 물을 욕조에 물을 교체합니다. </li><li> 5 분 알코올 목욕은 자극 전극 팁. </li></ol>

<ol><li>Bliss, T. V., Lomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lasting+potentiation+of+synaptic+transmission+in+the+dentate+area+of+the+anaesthetized+rabbit+following+stimulation+of+the+perforant+path%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anaesthetized rabbit following stimulation of the perforant path.</a> J. Physiol. 232 (2), 331-356 (1973).</li>
<li>Douglas, R. M., Goddard, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+potentiation+of+the+perforant+path-granule+cell+synapse+in+the+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Long-term potentiation of the perforant path-granule cell synapse in the rat hippocampus.</a> Brain Res. 86, 205-215 (1975).</li>
<li>Squire, L., Kandel, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSquire%2C+L+%22Memory%3A+From+mind+to+molecules%22">Memory: From mind to molecules</a>. , WH Freeman & Company. New York, New York, USA. (1999).</li>
<li>Nguyen, P. V., Abel, T., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+a+critical+period+of+transcription+for+induction+of+a+late+phase+of+LTP%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Requirement of a critical period of transcription for induction of a late phase of LTP.</a> Science. 265 (5175), 1104-1107 (1994).</li>
<li>Frey, U., Morris, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+tagging+and+long-term+potentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synaptic tagging and long-term potentiation.</a> Nature. 385 (6616), 533-536 (1038).</li>
<li>Bortolotto, Z. A., Collingridge, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+protein+kinase+C+in+a+form+of+metaplasticity+that+regulates+the+induction+of+long-term+potentiation+at+CA1+synapses+of+the+adult+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A role for protein kinase C in a form of metaplasticity that regulates the induction of long-term potentiation at CA1 synapses of the adult rat hippocampus.</a> Eur. J. Neurosci. 12 (11), 4055-4062 (2000).</li>
<li>Migues, P. V., Hardt, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKMzeta+maintains+memories+by+regulating+GluR2-dependent+AMPA+receptor+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">PKMzeta maintains memories by regulating GluR2-dependent AMPA receptor trafficking.</a> Nat. Neurosci. 13 (5), 630-634 (2010).</li>
<li>Ehlers, M. D., Heine, M., Groc, L., Lee, M. -C., Choquet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusional+trapping+of+GluR1+AMPA+receptors+by+input-specific+synaptic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Diffusional trapping of GluR1 AMPA receptors by input-specific synaptic activity.</a> Neuron. 54 (3), 447-460 (2007).</li>
<li>Vickers, C. A., Dickson, K. S., Wyllie, D. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+maintenance+of+late-phase+long-term+potentiation+in+isolated+dendrites+of+rat+hippocampal+CA1+pyramidal+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Induction and maintenance of late-phase long-term potentiation in isolated dendrites of rat hippocampal CA1 pyramidal neurones.</a> J. Physiol. 568 (3), 803-813 (2005).</li>
<li>Fonseca, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+actin+dynamics+are+required+for+the+maintenance+of+long-term+plasticity+and+for+synaptic+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent actin dynamics are required for the maintenance of long-term plasticity and for synaptic capture.</a> Eur. J. Neurosci. 35 (2), 195-206 (2012).</li>
<li>Redondo, R. L., Okuno, H., Spooner, P. A., Frenguelli, B. G., Bito, H., Morris, R. G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+tagging+and+capture%3A+differential+role+of+distinct+calcium%2Fcalmodulin+kinases+in+protein+synthesis-dependent+long-term+potentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic tagging and capture: differential role of distinct calcium/calmodulin kinases in protein synthesis-dependent long-term potentiation.</a> J. Neurosci. 30 (14), 4981-4989 (2010).</li>
<li>Sajikumar, S., Navakkode, S., Frey, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+synthesis-dependent+long-term+functional+plasticity%3A+methods+and+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Protein synthesis-dependent long-term functional plasticity: methods and techniques.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 15 (5), 607-613 (2005).</li>
<li>Connor, S. A., Wang, Y. T., Nguyen, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+beta-adrenergic+receptors+facilitates+heterosynaptic+translation-dependent+long-term+potentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Activation of beta-adrenergic receptors facilitates heterosynaptic translation-dependent long-term potentiation.</a> J. Physiol. 589 (17), 4321-4340 (2011).</li>
<li>Villers, A., Godaux, E., Ris, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lasting+LTP+requires+neither+repeated+trains+for+its+induction+nor+protein+synthesis+for+its+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Long-lasting LTP requires neither repeated trains for its induction nor protein synthesis for its development.</a> PLoS One. 7 (7), e40823(2012).</li>
<li>Capron, B., Sindic, C., Godaux, E., Ris, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+characteristics+of+LTP+induced+in+hippocampal+slices+are+dependent+on+slice-recovery+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Learn.+Mem%22%5BJournal%5D)">The characteristics of LTP induced in hippocampal slices are dependent on slice-recovery conditions.</a> Learn. Mem. 13 (3), 271-277 (2006).</li>
<li>Villers, A., Godaux, E., Ris, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late+phase+of+L-LTP+elicited+in+isolated+CA1+dendrites+cannot+be+transferred+by+synaptic+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Late phase of L-LTP elicited in isolated CA1 dendrites cannot be transferred by synaptic capture.</a> Neuroreport. 21, 210-215 (2010).</li>
<li>Nguyen, P. V., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+theta-burst+stimulation+induces+a+transcription-dependent+late+phase+of+LTP+requiring+cAMP+in+area+CA1+of+the+mouse+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Learn.+Mem%22%5BJournal%5D)">Brief theta-burst stimulation induces a transcription-dependent late phase of LTP requiring cAMP in area CA1 of the mouse hippocampus.</a> Learn. Mem. 4 (2), 230-243 (1997).</li>
<li>Dewachter, I., Ris, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+synaptic+plasticity+and+Tau+phosphorylation+by+wild-type+and+mutant+presenilin1%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Aging%22%5BJournal%5D)">Modulation of synaptic plasticity and Tau phosphorylation by wild-type and mutant presenilin1.</a> Neurobiol. Aging. 29 (5), 639-652 (2008).</li>
<li>Dewachter, I., Filipkowski, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deregulation+of+NMDA-receptor+function+and+down-stream+signaling+in+APP%5BV717I%5D+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Aging%22%5BJournal%5D)">Deregulation of NMDA-receptor function and down-stream signaling in APP[V717I] transgenic mice.</a> Neurobiol. Aging. 30 (2), 241-256 (2009).</li>
<li>Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Acute+Hippocampal+Slices+from+Rats+and+Transgenic+Mice+for+the+Study+of+Synaptic+Alterations+during+Aging+and+Amyloid+Pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology.</a> J. Vis. Exp. (49), e2330(2011).</li>
<li>Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slices+have+more+synapses+than+perfusion-fixed+hippocampus+from+both+young+and+mature+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Slices have more synapses than perfusion-fixed hippocampus from both young and mature rats.</a> J. Neurosci. 19 (8), 2876-2886 (1999).</li>
<li>Bourne, J. N., Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Warmer+preparation+of+hippocampal+slices+prevents+synapse+proliferation+that+might+obscure+LTP-related+structural+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Warmer preparation of hippocampal slices prevents synapse proliferation that might obscure LTP-related structural plasticity.</a> Neuropharmacology. 52, 55-59 (2007).</li>
<li>Alger, B. E., Dhanjal, S. S., Dingledine, R., Garthwaite, J., Henderson, G., King, G. L., et al. Appendix: Brain slice methods. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAlger%2C+BE+%22Brain+Slices%22">Brain Slices</a>. Dingledine, R. , Plenum. New York. 381-437 (1984).</li>
<li>Watson, P. L., Weiner, J. L., Carlen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+variations+in+hippocampal+slice+preparation+protocol+on+the+electrophysiological+stability%2C+epileptogenicity+and+graded+hypoxia+responses+of+CA1+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of variations in hippocampal slice preparation protocol on the electrophysiological stability, epileptogenicity and graded hypoxia responses of CA1 neurons.</a> Brain Res. 775, 134-143 (1997).</li>
<li>Frey, U., Krug, M., Reymann, K. G., Matthies, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisomycin%2C+an+inhibitor+of+protein+synthesis%2C+blocks+late+phases+of+LTP+phenomena+in+the+hippocampal+CA1+region+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Anisomycin, an inhibitor of protein synthesis, blocks late phases of LTP phenomena in the hippocampal CA1 region in vitro.</a> Brain Res. 452 (1-2), 57-65 (1988).</li>
<li>Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+biology+of+memory+storage%3A+a+dialogue+between+genes+and+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The molecular biology of memory storage: a dialogue between genes and synapses.</a> Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).</li>
<li>Fonseca, R., Nägerl, U. V., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+determines+the+protein+synthesis+dependence+of+long-term+potentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity determines the protein synthesis dependence of long-term potentiation.</a> Nat. Neurosci. 9 (4), 478-480 (2006).</li>
<li>Rudy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+there+a+baby+in+the+bathwater%3F+Maybe%3A+some+methodological+issues+for+the+de+novo+protein+synthesis+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Learn.+Mem%22%5BJournal%5D)">Is there a baby in the bathwater? Maybe: some methodological issues for the de novo protein synthesis hypothesis.</a> Neurobiol. Learn. Mem. 89 (3), 219-224 (2008).</li>
<li>Sharma, A. V., Nargang, F. E., Dickson, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurosilence%3A+Profound+Suppression+of+Neural+Activity+following+Intracerebral+Administration+of+the+Protein+Synthesis+Inhibitor+Anisomycin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurosilence: Profound Suppression of Neural Activity following Intracerebral Administration of the Protein Synthesis Inhibitor Anisomycin.</a> J. Neurosci. 32 (7), 2377-2387 (2012).</li>
<li>Volianskis, A., Jensen, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+and+sustained+types+of+long-term+potentiation+in+the+CA1+area+of+the+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Transient and sustained types of long-term potentiation in the CA1 area of the rat hippocampus.</a> J. Physiol. 550 (2), 459-492 (2003).</li>
<li>Ris, L., Villers, A., Godaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+capture-mediated+long-lasting+long-term+potentiation+is+strongly+dependent+on+mRNA+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Synaptic capture-mediated long-lasting long-term potentiation is strongly dependent on mRNA translation.</a> Neuroreport. 20 (17), 1572-1576 (2009).</li>
<li>Abbas, A. -K., Dozmorov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+LTP+without+triggered+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Persistent LTP without triggered protein synthesis.</a> Neurosci. Res. 63 (1), 59-65 (2009).</li>
<li>Ho, O. H., Delgado, J. Y., O'Dell, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+proteins+involved+in+activity-dependent+forms+of+synaptic+plasticity+is+altered+in+hippocampal+slices+maintained+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of proteins involved in activity-dependent forms of synaptic plasticity is altered in hippocampal slices maintained in vitro.</a> J. Neurochem. 91, 1344-1357 (2004).</li>
<li>Whittingham, T. S., Lust, W. D., Christakis, D. A., Passonneau, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+stability+of+hippocampal+slice+preparations+during+prolonged+incubation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Metabolic stability of hippocampal slice preparations during prolonged incubation.</a> J. Neurochem. 43, 689-696 (1984).</li>
<li>Dunlop, D. S., van Elden, W., Lajtha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+conditions+for+protein+synthesis+in+incubated+slices+of+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Optimal conditions for protein synthesis in incubated slices of rat brain.</a> Brain Res. 99, 303-318 (1975).</li>
<li>Taubenfeld, S. M., Stevens, K. A., Pollonini, G., Ruggiero, J., Alberini, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profound+molecular+changes+following+hippocampal+slice+preparation%3A+loss+of+AMPA+receptor+subunits+and+uncoupled+mRNA%2Fprotein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Profound molecular changes following hippocampal slice preparation: loss of AMPA receptor subunits and uncoupled mRNA/protein expression.</a> J. Neurochem. 81 (6), 1348-1360 (2002).</li>
<li>Gruart, A., Munoz, M. D., Delgado-Garcia, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+CA3-CA1+synapse+in+the+acquisition+of+associative+learning+in+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Involvement of the CA3-CA1 synapse in the acquisition of associative learning in behaving mice.</a> J. Neurosci. 26 (4), 1077-1087 (2006).</li>
<li>Whitlock, J. R., Heynen, A. J., Shuler, M. G., Bear, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+induces+long-term+potentiation+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Learning induces long-term potentiation in the hippocampus.</a> Science. 313, 1093-1097 (2006).</li>
<li>Grant, S. G. N., Silva, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+learning%5BTitle%5D)+AND+%22TINS%22%5BJournal%5D)">Targeting learning.</a> TINS. 17 (2), 71-75 (1994).</li>
<li>Izquierdo, I., Medina, J. H., Vianna, M. R. M., Izquierdo, L. A., Barros, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separate+mechanisms+for+short-+and+long-term+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Separate mechanisms for short- and long-term memory.</a> Behav. Brain Res. 103, 1-11 (1999).</li>
<li>Morice, E., Andreae, L. C., Cooke, S. F., Vanes, L., Fisher, E. M. C., Tybulewicz, V. L. J., Bliss, T. V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+long-term+memory+and+synaptic+plasticity+despite+short-term+impairments+in+the+Tc1+mouse+model+of+Down+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Preservation of long-term memory and synaptic plasticity despite short-term impairments in the Tc1 mouse model of Down syndrome.</a> Learn Mem. 15 (7), 492-500 (2008).</li>
<li>Dunlop, D. S., van Elden, W., Plucinska, I., Lajtha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+Slice+Protein+Degradation+and+Development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Brain Slice Protein Degradation and Development.</a> J. Neurochem. 36, 258-265 (1981).</li>
<li>Izquierdo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+potentiation+and+the+mechanisms+of+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Dev.+Res%22%5BJournal%5D)">Long-term potentiation and the mechanisms of memory.</a> Drug Dev. Res. 30, 1-17 (1993).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리는 우리의 실험실에서 개발 LTP 녹음 11,17에 큰 전문 지식을 가진 다른 실험실에서 사용되는 방법의 조합에 따른 프로토콜을 개발했습니다. 이 프로토콜은 성인 쥐 해마에 적응하고 모든 연령 및 배경 유전자형의 동물에 사용할 수 있습니다. 또한 알츠하이머 병 18,19 같은 neurodegenerative 질병을 개발하는 형질 전환 생쥐에서 LTP의 분석을 할 수 있습니다. 쥐의 해마 슬라이스에 대해이 프로토콜의 활용 몇 가지 적응을 필요로 할 수 있습니다. 예를 들어, 쥐에서 수행 된 연구의 대부분은 32 ° C 대신 28 ° C.의 온도를 사용 마티스 등. 20 노화 생쥐 나 쥐에서 해마 슬라이스의 준비를 위해 다른 방법을 제안 하였다. 재료 및 방법 잰 비어 SAS (프랑스)하지만 동일한 결과에...

요즘 복잡한 메모리를 저장하고 신경 회로 수준에서 호출하는 방법의 제한으로 이해가있다. 그러나 메모리 스토리지의 통합 가설이 가능하고 광범위하게 허용됩니다 : 메모리는 중추 신경계의 뉴런 사이의 시냅스 연결의 강도의 변화로 저장됩니다. 자신에 시냅스 가소성에 대한 연구는 크게 두 가지 획기적인 발견의 혜택을 받았다. (1)에서 그대로 마취 토끼를 사용하여 정액 실험, 행복과 로모 1, 짧은 높은 주파수 (1 초, 100 Hz에서) 해마의 perforant 경로에 자극의 전달이 오랫동안 (몇을 일으키는 원인 발견 시간) 관련 시냅스 연결의 증가. 이 매혹적인 현상 1975 2 더글러스 고다드에 의해 &quot;장기 상승 작용&quot;또는 LTP를 불렀습니다. (2) 나중에, 그것은 유사한 현상 (0.4 mm) 뇌 조각에서 트리거 될 수있는 것으로 나타났습니다 인위적으로 체외에서 살아 유지 </eM&gt;. 가장 널리 연구 LTP는 소위 CA1 영역의 피라미드 신경 세포에서 유발의 결과 필드 흥분성 시냅스 전위를 기록하는 동안 축삭 (소위 샤퍼의 담보)의 번들로 하나 또는 여러 tetani에 전달하여 체외에서 관찰되었다. LTP 유도의 메커니즘은 크게 공개되었다. AMPA 수용체의 인산화 (효율성 증가)과 시냅스 막 3 여분의 AMPA 수용체의 결합 : 기본적으로, NMDA 수용체를 통한 칼슘 2 + 유입은 두 가지 결과를 초래 효소를 활성화합니다. 이 실험적으로 훨씬 더 어려운 30 ~ 60 분보다 몇 시간 동안 건강한 슬라이스를 유지하는 것입니다 특히 때문에 대조적으로, LTP의 유지 보수 단계의 메커니즘은 대부분 알 수 있습니다. 연구의 많은 LTP 메커니즘과 흥미로운 이론의 이해에 전념 한이 년 4-11에 정교하고있다. 그러나 유엔틸 지금, 시냅스 강도 안정적인 증가를 기본 정확한 분자 메커니즘이 밝혀되지 않았습니다. 이 준비를 위해 서로 다른 기술을 사용하여 서로 다른 실험실에서 이전 결과를 재현하는 어려움과 해마 슬라이스의 유지에 부분적으로 인해 수 있습니다. 자신의 방법론 논문에서는 Sajikumar 등. 12 쥐의 해마 슬라이스와 안정 LTP의 기록의 준비를 위해 실험 조건의 중요성을 강조했다. 이 비디오에서 우리는 쥐 해마 슬라이스에 매우 안정적인 LTP를 기록 할 수 년 동안 우리 실험실에서 개발 된 모든 최적화 단계를 제시한다. 이 최적화는 쥐 13 쥐 11 LTP 메커니즘을 연구 다른 실험실에서 개발하고 성공적으로 사용되는 프로토콜에서 변경되었습니다. 그것은 경험이 풍부한 연구자 유도하고 성공의 높은 속도를 가진 성인 마우스에서 매우 오래 지속 LTP를 기록 할 수 있습니다. P유도 된 LTP의 hysiological 기준은주의 깊게 검사하고 14 증명되었다. 이 방법론의 논문에서, 우리는 해부 절차 깊이 슬라이스 흥분을 수정할 수 있지만 온도 나 산소와 같은 실험 조건의 수정, LTP 유지에 지대한 영향을 미칠 수 있음을 보여줍니다. 또한 이러한 모든 매개 변수의 정밀 제어가 초보 학생들을위한 몇 개월의 교육을 필요로하는 강조해야합니다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">시약/재료</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>시그마 - Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>S8875</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>시그마 - Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>D-포도</td>당 <td>시그마 - Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4 </td><td>시그마 - Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 1M</td><td>시그마 - Aldrich</td><td>63126</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Carbogen</td><td>Air Liquide (벨기에)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capillaries</td><td>WPI, Inc. (영국)</td><td>TW150-4</td><td></td></tr><tr><td>자극 전극</td><td>FHC (미국)</td><td>CE2B30</td><td></td></tr><tr><td>수술 도구</td><td>FST (독일)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>여과지 84g/m2</td><td>Sartorius</td><td>FT-3-105-110</td><td></td></tr><tr><td>메쉬</td><td>라이크라</td><td>15 덴</td><td></td></tr><tr><td>접착제</td><td>UHU</td><td>플러스 endfest300</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Instrument</td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>WPI, Inc. (영국)</td><td>ISO-80</td><td></td></tr><tr><td>인터페이스 레코딩 챔버</td><td>FST (독일)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>연동 펌프</td><td>Gilson (미국)</td><td>Minipuls 3</td><td></td></tr><tr><td>온도 컨트롤러</td><td>University of Edinburgh</td><td><a href="http://www.etcsystem.com" target="_blank">www.etcsystem.com</a></td><td></td></tr><tr><td>Tissue Chopper</td><td>Mcllwain</td><td></td><td></td></tr><tr><td>자극기</td><td>Grass (USA)</td> <td>S88X + SIU-V</td><td></td></tr><tr><td>프로그램 분석</td><td>WinLTP</td><td><a href="http://www.winltp.com" target="_blank">www.winltp.com</a></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulators</td><td>Narishige</td><td>MM-3 및 MMO-220A</td><td></td></tr><tr><td>수술용 현미경</td><td>Leica Microsystem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>A/D 컨버터</td><td>National Instruments</td><td>NIPCI-6229 M 시리즈</td><td></td></tr></tbody></table>

장기 상승 작용으로 매우 안정하고 재현성 기록을위한 향상된 준비 및 해마 마우스 조각의 보존

Improved Preparation and Preservation of Hippocampal Mouse Slices for a Very Stable and Reproducible Recording of Long-term Potentiation

장기 상승 작용 (LTP)는 시냅스 강도의 증가에 의해 특징 시냅스 가소성의 한 종류이며 메모리 인코딩에 관련된 것으로 믿었다. LTP는 광범위하게 연구되어왔다 급성 해마 슬라이스의 CA1 지역에 이끌려. 그러나이 현상의 유지 보수 단계의 기초가되는 분자 메커니즘은 여전히​​ 제대로 이해하고 있습니다. 이 서로 다른 실험실에서 사용하는 다양한 실험 조건에 부분적으로 인해 수 있습니다. 사실, LTP의 유지 보수 단계는 산소, 온도 및 습도 등 외부 변수에 크게 의존한다. 또한 절개 후 슬라이스 평면과 조각 생존의 방향이 같은 내부 파라미터에 따라 달라집니다. 이러한 모든 매개 변수의 최적화는 매우 재현성이 매우 안정적인 장기 상승 작용을 유도 할 수 있습니다. 이 방법은 더 안정적인 증가에 관련된 분자 메커니즘을 탐구 할 수있는 가능성을 제공합니다해마 슬라이스 시냅스 강도를합니다. 또한 신경 생리 학적 현상의 체외 조사에서의 실험 조건의 중요성을 강조한다.

이 방법은 성인 C57BL/6J 마우스 (잰 비어 SAS, 프랑스)의 14에서 급성 해마 슬라이스에 유도 오래 지속되는 장기 상승 작용의 특성을 분석하는 데 사용되었습니다. 놀랍게도, 실험 조건의 개선은 LTP를 바라 보는 새로운 방식을 주도하고있다. 우리는 시냅스 강도의 지속적인 증가는 새로운 단백질의 합성을 요구하지 않은 것으로 나타났다. 여기, 우리는 LTP 유도가 슬라이스 생존과 흥분에 따라 달라집니다 것을 보여줍니다. 해마의 절개가 너무 느리거나 너무 유해한, 슬라이스 흥분이 증가하고 polysynaptic 응답 (그림 3B) LTP 유도 한 후 관찰 할 수있다. 이 경우, LTP 유도가 훨씬 덜 효과​​적이었고, 상승 작용이 유지되지 않았습니다. 우리는 하나에 의해 유도도 조각에 분명히 건강, 기술적 조건은 LTP의 기간에 큰 영향을 가지고 있다는 사실을 강조하고 ...

이 논문은 준비하고 유지하는 완벽한 방법을 제공합니다<em&gt; 체외에서</em성인 생쥐&gt; 급성 해마 조각. 이 프로토콜은 95 %의 성공률로 8 시간 이상 아주 안정되어 오래 지속되는 장기 potentiation (LTP)의 녹음을 할 수 있습니다.

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 급성 해마 슬라이스에서 매우 안정적이고 재현 가능한 장기 강화(long-term potentiation)를 기록하는 것입니다. 이를 위해 먼저 마우스의 뇌를 적출하고, 현미경 하에서 차가운 A CSF를 사용하여 해마를 분리합니다. 두 번째 단계는 조직 절단기(tissue chopper)를 사용하여 해마의 횡단면 슬라이스를 제작하는 것입니다.다음으로, 절편을 인터페이스 기록 챔버에 넣고 산소가 공급된 인공 뇌척수액을 관류시킵니다. 마지막 단계는 전극을 배치하여 해마의 CA1 영역에서 시냅스 활동을 기록하는 것입니다. 최종적으로, 고주파 자극 프로토콜을 사용하여 매우 안정적인 장기 강화가 유도됨을 보여줍니다.이 방법을 통해 시냅스 가소성의 기저 기전에 대한 통찰을 얻을 수 있습니다. 또한 신경퇴행성 질환이나 신경계, 또는 면역 질환의 동물 모델과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 사람들은 모든 조작 과정에 고도의 기술과 많은 연습이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다.증류수로 퍼퓨전 회로를 최소 20분 동안 헹구어 이 절차를 시작하십시오. 그런 다음 가열 시스템을 켭니다. 회로 내에 카보젠 버블링을 시작하십시오.카보젠(carbogen)은 공기 확산기를 통해 기록 챔버 아래의 워터 배스(water bath)로 공급됩니다. 그다음, 유량계를 사용하여 워터 배스의 유량을 조절합니다. 이후 회로를 비우고 여과된 A CSF를 채워 기포를 제거합니다. 그런 다음 유지 챔버 내에서 슬라이스를 지지할 링을 배치합니다.회로에서 모든 기포를 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 흡입 바늘의 나사를 사용하여 기록 챔버 내의 A CSF 수위를 조절하며, 유입 펌프의 속도는 1 mL/min으로, 유출 펌프의 속도는 5 mL/min으로 조정합니다. 박리 전, 모든 수술 기구를 준비합니다.희생시킨 마우스의 뇌를 적출하기 위해, 검지와 엄지로 머리를 잡고 해부 가위로 기요틴 절단면 가장자리부터 전두골 방향으로 머리 정중앙을 따라 절개합니다. 다음으로, 머리 양측의 피부 근육을 절개하여 두개골 판을 완전히 노출시킵니다.그 다음 머리의 상단부 근육들을 제거합니다. 이어서 양측의 측두근을 측두판을 따라 절개합니다. 그 후 전두판의 중앙을 가로 방향으로 절개합니다.이제 두 판 사이의 후두골에 작은 절개를 넣으십시오. 양측 후두판의 기저부를 절개합니다. 그런 다음 스프링 가위를 사용하여 시상 봉합선을 따라 절개하십시오.마지막으로, 핀셋을 사용하여 두 반구를 서로 반대 방향으로 벌려 두개골을 제거합니다. 이제 메스로 소뇌 직전과 후각구 직후를 가로 방향으로 절단한 후, 추출한 뇌를 차가운 A CSF가 담긴 해부 접시로 옮깁니다. 뇌가 해부 접시에 잠기면, 실체 현미경 하에서 메스를 중앙에 삽입하여 두 반구를 서로 분리하고, 한쪽 반구의 구조를 조심스럽게 펼쳐 측뇌실을 노출시킵니다.한 개의 스패튤라를 전두엽 피질에 두고 다른 스패튤라를 머리 부분(cephalon)에 놓아 뇌줄기와 머리 부분을 제거합니다. 이때 스패튤라가 해마에 닿지 않도록 주의하고, 조직 절편 제작 과정에서 해마가 늘어나지 않도록 합니다. 그 후, 뇌궁(fornix)을 절단합니다.그 다음, 뇌실에 스패튤라를 삽입하여 피질 밖으로 해마를 조심스럽게 밀어냅니다. 해마가 추출되면, 입구가 넓은 플라스틱 파스처 피펫을 사용하여 과잉 피질 조직과 남아 있는 혈관을 제거합니다. 스푼을 이용해 해마의 alvi 표면이 위를 향하도록 하여 초퍼(chopper) 플랫폼으로 옮깁니다.표준 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 스푼의 과잉 액체를 제거합니다. 그 후, 스푼을 수직으로 세워 초퍼 위의 거름종이에 거의 닿을 정도로 기울입니다. 거름종이에 빠르게 접촉시켜 해마를 떨어뜨립니다.그 다음 스푼을 꺼냅니다. 이어서 해마의 방향을 잡고 절단합니다. 초퍼(chopper)를 사용하여 400 microns 두께로 횡단면 절편을 만듭니다.절차를 최대한 신속하게 수행하십시오. 그 다음, 해마 슬라이스가 놓인 여과지를 제거하고 금속 실린더에 감아 슬라이스를 약간 펼쳐줍니다. 그런 다음 표준 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 A CSF를 분사해 슬라이스를 떼어내고, 차가운 용액이 채워진 페트리 접시에 수집하십시오.A CSF. 선택한 절편을 표준 플라스틱 파스토 pipette을 사용하여 기록 챔버로 옮깁니다. 기록 인터페이스 챔버 내 28 °C에서 절편이 박리 외상으로부터 회복되도록 둡니다.슬라이스가 A CSF 수준보다 더 낮게 가라앉으면, 슬라이스가 뜰 수 있도록 A CSF 수준을 다시 높이십시오. 그 후, CA1 영역에 전극을 배치하기 용이한 위치로 슬라이스의 방향을 맞추십시오. A CSF 수준이 계면에 도달하면 더 이상 낮추지 마십시오.슬라이스 주변 배지의 메니스커스는 A CSF가 충분한 수준임을 나타냅니다. 메쉬는 배지로 포화되어야 하지만 완전히 잠겨서는 안 됩니다. 그런 다음 타공 뚜껑 위에 여과지를 덮어 챔버를 밀폐된 상태로 유지하십시오.기록하기 전, 슬라이스를 28 °C에서 최소 1시간 30분 동안 안정시킵니다. 다음은 동일한 신경세포 집단으로 들어오는 두 개의 독립적인 시냅스 입력 S1과 S2를 나타낸 모식도입니다. S1 경로는 LTP를 유도하는 데 사용되었으며, S2 경로는 대조군으로 사용되었습니다.빨간색 트레이스로 표시된 LTP 유도 직전과 파란색 트레이스로 표시된 LDP 유도 1시간 후에 기록된 샘플 fEPSP 트레이스입니다. 여기 있는 것은 완전히 건강한 슬라이스에서 얻은 fEPSP이며, 다른 하나는 슬라이스가 완전히 건강하지 않아 높은 흥분도를 보이는 슬라이스에서 얻은 fEPSP입니다. 다시냅스 반응이 관찰되며, fEPSP 기울기 증강이 감소되었습니다.본 연구실에서 2005년, 2010년, 2011년에 기록한 단일 고주파 자극 훈련으로 유도된 LTP 이후의 F-E-P-S-P 기울기 시간 경과 비교 결과입니다. 채워진 원으로 표시된 것은 2005년에 기록된 초기 실험이며, 채워진 사각형으로 표시된 이후의 기록들은 개선된 박리 절차의 혜택을 받았습니다.현재의 결과는 빈 원으로 표시된 전극 표준화와 더불어, 인터페이스 산소 공급 및 온도 제어의 최적화에서 비롯되었습니다. 여기서 파란색 곡선으로 표시된 바와 같이, 기록 챔버 하단 수조의 산소 유량을 0.15에서 0.25 liters per minute로 증가시키면 F-E-P-S-P 기울기가 20% 감소함을 보여줍니다. 표시된 바와 같이, 온도를 28에서 29 degrees Celsius로 높이면 초록색 곡선에서 F-E-P-S-P 기울기가 50% 이상 증가합니다.이 절차를 수행할 때 모든 단계가 매우 중요하며, 프로토콜상의 오류는 서로 다른 결과로 이어질 수 있다는 점을 유념해야 합니다. 이 영상을 시청하고 나면, 급성 해마 절편 기록에서 매우 안정적인 장기 강화(long-term potentiation)를 얻는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

improved-preparation-preservation-hippocampal-mouse-slices-for-very

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 문서는 뇌의 노화 및 알츠하이머 질환 같은 나이와 관련된 neurodegenerative 질병와 관련된 시냅스 변경의 연구를위한 유전자 변형 쥐 및 생쥐에서 hippocampal 조각 준비 절차를 설명합니다.

노화와 아밀로이드 병리 동안 시냅틱 얼터 레이션의 연구에 대한 고양이와 트렌스 제닉 마우스의 급성 Hippocampal 조각의 준비

이 비디오 기사는 설치류의 급성 해마 절편을 사용하여 CA1 피라미드 뉴런에서 시냅스 태깅, 캡처 및 교차 태깅과 같은 장기 가소성과 연관 과정을 연구하기 위한 실험 절차를 설명합니다.

설치류에서 급성 해마 조각을 사용하여 시냅스 태그 / 캡처 및 크로스 캡처 조사

이 프로토콜에서는 최적화 된 N의 구현을 보여 줍니다.-메 틸-D-glucamine (NMDG) 보호 복구 방법의 뇌 조각 준비. 단일 미디어 공식 안정적으로 다양 한 실험적인 응용 프로그램에 대 한 어떤 나이의 동물에서 건강 한 뇌 조각 얻을 하는 데 사용 됩니다.

최적화 된 N를 사용 하 여 급성 뇌 조각의 준비-메 틸-D-glucamine 보호 복구 방법

이 프로토콜 산소 수준 재활용된 버퍼의 작은 볼륨과 침수 급성 hippocampal 조각 활동 종속 시 냅 스가 소성 녹음의 방법 론 적 측면에서의 안정화를 설명 합니다.

급성 Hippocampal 조각에 작은 볼륨 재활용-, 관류-침수 형 챔버 시스템 유지에 시 냅 스가 소성을 기록

우리는 세로 해마 뇌 슬라이스에 기록 및 자극 전극을 사용하고 세포 외 후유증 전위를 불러 일으키고 입증하기 위해 생체 내 등도 해마에서 세로 로 배치 된 기록 및 자극 전극을 사용했습니다. 세로 인터라멜라 CA1을 따라 장기 시냅스 가소성.

전기 생리학 필드 기록에 의하여 인터라멜라 해마 CA1에 있는 장기 시냅스 가소성 조사

제시된 프로토콜은 잠재적인 항질 물질에 대한 전임상 평가 도구로 중요한 두뇌 조각을 사용하는 궁극적인 목표를 가진 절제된 인간 해마 조직의 수송 그리고 준비를 기술합니다.

전기 생리학적 기록을 위한 급성 인간 해마 슬라이스의 준비

이것은 조직에 저산소 손상을 줄이기 위해 얼음 차가운 NMDG-aCSF와 함께 경내 관류 및 슬라이스 절단을 활용하는 성인 및 노화 마우스 해마의 급성 슬라이스 준비를위한 프로토콜입니다. 결과 슬라이스는 여러 시간 동안 건강하게 유지되며 장기 패치 클램프 및 필드 레코딩에 적합합니다.

성인과 노화 마우스에서 해마 조각에서 저산소증 최소화

이 프로토콜은 자발적인 날카로운 파도 잔물결 활동을 나타내는 마우스에서 수평 해마 내톨리날 피질 (HEC) 슬라이스의 준비를 설명합니다. 슬라이스는 단순화 된 인터페이스 보유 챔버에서 배양되고 기록은 조직의 산소화와 네트워크 수준의 활동의 자발적출현을 촉진하기 위해 빠르게 흐르는 인공 뇌척수액과 침수 된 조건에서 수행됩니다.

급성 마우스 뇌 슬라이스 자발적인 해 마 네트워크 활동을 조사

이 문서는 마우스에서 수평 해마 뇌 조각을 얻기 위해 체계적인 프로토콜을 설명하는 것을 목표로합니다. 이 방법론의 목적은 천공 경로 및 이끼 섬유장과 같은 해마 섬유 경로의 무결성을 보존하여 규톨염 자이러스 관련 신경학적 과정을 평가하는 것입니다.

마우스 뇌의 수평 해마 조각

우리는 마우스의 등간 중간 해마에서 급성 슬라이스를 준비하는 프로토콜을 제시한다. 우리는 기록의 품질과 기록 된 뉴런의 형태학적 특징의 보존 측면에서 관상 슬라이스와이 트랜스 버사제 준비를 비교합니다.

성인 마우스의 덴테이트 자이루스에서 전신 기록 및 신경 재건을위한 등산 해마에서 급성 슬라이스의 준비

학습하세요 성인 마우스 해마 급성 절편을 준비하고 보존하는 방법을 통해 8시간 이상 지속되는 매우 안정적인 장기 강화(LTP)를 기록하는 기법을. 이 프로토콜은 시냅스 가소성 메커니즘 연구에 필수적입니다.

장기 상승 작용으로 매우 안정하고 재현성 기록을위한 향상된 준비 및 해마 마우스 조각의 보존

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