주변 줄기 세포 이주의 분석을위한 마우스 Cremaster 근육에있는 미세 혈관의의 intravital 현미경

이 절차의 전반적인 목표는 생체 내에서 줄기세포 내피 세포의 상호 작용을 시각화하는 것입니다. 이는 먼저 동맥 내 접근을 위해 진정된 동물에 대퇴 동맥 카테터를 도입함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계에서는 채도 근육을 폐하계로 생체 내 형광 현미경 검사를 준비합니다.

다음으로, 관심 줄기세포 집단을 대퇴동맥 카테터를 통해 주입합니다. 궁극적으로, 양적으로 이식된 줄기세포와 주근 미세순환의 내피 사이의 상호 작용을 시각화하고 정량화할 수 있습니다. 이 방법은 재생 의학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

미세수술 D 공기를 시작하기 전에 0.9%염화나트륨이 함유된 1밀리리터 주사기에 카테터를 연결합니다. 그런 다음 오른쪽 음낭의 앞쪽과 20-25밀리그램의 마취된 수컷 쥐의 오른쪽 허벅지와 사타구니를 부드럽게 면도합니다. 물에 적신 면봉으로 느슨한 머리카락을 모두 모은 다음 마우스 복부 쪽을 플렉시 유리, 맞춤형 보기 스테이지에 놓습니다.tage 베이스 플레이트의 코들 가장자리에 있는 베이스 플레이트와 두 번째 플레이트로 구성된 뒷다리와 음낭의 높이를 위해

신축성 있는 드레이프로 발을 고정한 후 스테이지를 가열 패드에 올려 동물의 체온을 섭씨 37도로 유지합니다. 그런 다음 10-16배 배율을 사용하여 해부 현미경과 가위를 사용하여 무릎에서 사타구니까지 대퇴 혈관 바로 앞쪽에 있는 오른쪽 허벅지를 처음 절개합니다. 대퇴 동맥을 확인하고 이를 근접하게 추적하여 주변 연조직에서 동맥을 동원합니다.

그런 다음 열 소작을 사용하여 왼쪽 고환으로 이어지는 큰 동맥 가지를 식별하고 자릅니다. 왼쪽 고환에 6 oh prolene stay 봉합사를 표면적으로 놓습니다. 그런 다음 허벅지에서 내측으로 달리는 큰 동맥 가지를 식별하고 열 소작합니다.

다음으로, 부드러운 견인을 사용하여 오른쪽 허벅지의 원위 부분에서 대퇴 동맥을 결찰한 다음 동물의 중심에 최대한 가깝게 근위 대퇴 동맥 주위에 봉합사를 놓습니다. 이제 대퇴 동맥 주위에 느슨한 매듭을 짓되 묶지 마십시오. 그런 다음 봉합사에 부드러운 견인력을 적용하여 동맥 꼬임을 만듭니다.

꼬임을 설정한 후 마이크로 가위를 사용하여 대퇴 정맥이 손상되지 않도록 각별히 주의하면서 동맥 크기를 조심스럽게 조정합니다. 다음으로, 미리 준비한 마이크로 카테터를 절개 부위에 삽입합니다. 카테터가 쉽게 통과할 수 있도록 꼬임을 조심스럽게 풉니다.

동맥 혈류는 카테터 내에서 즉시 볼 수 있어야 합니다. 카테터를 이전의 꼬임보다 몇 밀리미터 더 천천히 전진시킵니다. 그런 다음 카테터를 고정하기 위해 준비된 합자를 묶습니다.

이제 염화나트륨으로 카테터를 부드럽게 세척한 다음 용액을 흡인하여 카테터의 올바른 위치를 확인합니다. 테이프를 사용하여 카테터를 작동 단계까지 더 단단히 고정합니다. 카테터를 적절하게 고정하고 옆으로 옮긴 후 오른쪽 음낭의 복부 쪽 위쪽의 피부와 근막을 잘라냅니다.

어떤 기구로도 밑에 있는 조직을 만지지 않도록 주의하십시오. 절개 부위를 서혜부 주름까지 연장하고 음낭의 원위 끝까지 조금씩 연장합니다. 그런 다음 조직 자체를 건드리지 않고 cremaster sac 위의 기본 연조직과 결합 조직을 조심스럽게 분리합니다.

그런 다음 근육을 약간 확장하기 위해 크레마스터의 말단 끝에 6 oh prolene stay 봉합사를 놓습니다. 다음으로, 근육을 앞쪽으로 부드럽게 당겨 근육낭 아래에 남아 있는 연조직을 절제합니다. 결합 조직에서 완전히 분리된 후 가위를 사용하여 두개골 가장자리의 C 마스터 주머니를 열고 이 구멍에서 근육의 원위 끝까지 절개 부위를 확장합니다.

크레마스터에서 고환을 연결하는 작은 혈관을 열 소작한 후 가위를 사용하여 근육과 고환 사이의 나머지 연결을 자릅니다. 열린 크레마스터는 이제 무대 위에 평평하게 놓입니다. 이제 조직 가장자리에 4 개의 6 개의 오 프롤렌 스테이 봉합사를 놓고 신축성있는 드레이프로 고정합니다.

이 시점부터 크레마스터 근육 조직을 퍼뜨리려면 1ml 주사기를 사용하여 조직에 PBS를 지속적으로 적십니다. 제제를 15분 동안 휴지한 후 좌측 대퇴동맥을 통해 0.05-0.1ml의 1%로딘 덱스트린을 주입하여 미세혈관구조의 조영제 향상을 돕습니다. 이제 마우스와 스테이지를 전하 결합 장치 아래로 이동합니다.

비디오 카메라는 에피 조명용으로 수정된 형광 현미경에 연결되었으며 대퇴 동맥 카테터가 탈구되지 않도록 특별히 주의를 기울였습니다. chma 미세순환의 충분한 시각화를 위해 수침 목표를 조정한 후, 확고한 줄기세포 부착에 대한 추후 분석을 위해 6개의 모세관 후 ES를 확률적으로 정의했습니다. 다음으로, 1밀리리터 주사기에 이전에 표지된 형광 기증자 골수 줄기세포 200마이크로리터를 로드합니다.

주사기를 부드럽게 두드려 소생시키고 세포 현탁액을 중단한 다음 대퇴부 카테터를 통해 세포를 40마이크로리터 주사하여 총 5회 연속 주사합니다. 세포 주입 직후 줄기세포가 굴러가는 것을 기록합니다. 롤링은 일반적인 세포 스틱 및 이완 움직임과 함께 내피 내벽을 따라 세포 속도가 50% 이상 감소하는 것으로 정의합니다.

생체 내 현미경 검사가 완료된 후 크레마스터 근육을 조심스럽게 제거하고 나중에 분석할 수 있도록 보관하십시오. 일반적으로 직접 주입된 줄기 세포 또는 전구 세포와 크레마스터 근육 미세순환 내의 혈관 내피의 상호 작용은 드문 경우이며 형광 표지로 인해 모세혈관 후에서만 발생합니다. 검은색 화살촉으로 표시된 롤링 세포와 흰색 화살표로 표시된 단단히 부착된 줄기 세포는 es의 순환 내인성 백혈구와 명확하게 구별될 수 있습니다.

혈류 속도 및 벽 전단 속도로 표시되는 미세 순환 조건은 일반적으로 다른 케모카인 처리를 한 각 실험 그룹 간에 크게 다르지 않습니다. 다양한 케모카인 또는 염증 반응 매개체를 가진 ker 마스터 근육 조직의 국소 치료. 예를 들어, 기질 세포 유래 인자 1 알파 또는 종양 괴사 인자 알파는 특정 미세 환경 조건을 모방할 수 있습니다.

이러한 조건은 적용된 특정 케모카인 또는 매개체와 주입된 줄기세포 집단에 따라 다양한 정도로 줄기세포 내피 세포 상호 작용을 향상시킵니다. 이 비디오를 시청한 후에는 CreER 근육 미세순환의 생체 내 현미경을 통해 생체 내에서 줄기 세포와 세포 상호 작용을 시각화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.