Name: 주변 줄기 세포 이주의 분석을위한 마우스 Cremaster 근육에있는 미세 혈관의의 intravital 현미경 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-05T18:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: 배우세요 마우스 크리마스터 근육 미세혈관에서 생체 내 현미경법을 이용한 줄기 세포-내피 세포 상호작용 분석 방법을. 이 기술은 재생의학 연구에서 줄기 세포 이주 메커니즘을 실시간으로 정량화하는 데 활용됩니다.

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세포 격리 후 전체 프로토콜은 약 2 시간 소요됩니다. 1. 미세 수술 준비 <ol><li> 9,12은 세포가 동물의 동작을 행하는 시간 동안 휴식을 허용하는 표준화 된 프로토콜에 따라 도너 골수 및 절연 모집단의 형광 라벨링에서 줄기 세포 분리를 수행한다. 형광 표지를 위해 우리는 CFDA (카르복시 디 아세테이트 숙신 이미 딜 에스테르)를 추천합니다. </li><li> 케타민 (75 ㎎ / ㎏)과 자일 라진 (2.5 ㎎ / ㎏) 20-25 g의 무게 남성 마우스를 마취. (일반적으로 매일 30 ~ 60 분) 필요에 따라 수술 및 실험 프로토콜을 통해, 마취 보조제로 (초기 주입의 10 %, IP)을 유지해야한다. </li><li> 부드럽게 오른쪽 음낭의 앞쪽 측면뿐만 아니라 오른쪽 허벅지와 사타구니를 면도. 모든 적신 면봉으로 머리를 잃을 수집합니다. 플렉시 글라스 시청 무대에서 마우스 복부 측면을 배치하고 수수료를 수정탄력있는 주름을 사용하여 t. 무대는 다리와 음낭 모두 상승의베이스 플레이트의 꼬리 가장자리에베이스 플레이트와 제 2 플레이트로 구성, 맞춤 제작된다. 37 ℃의 체온을 유지하기 위해 가열 패드에 스테이지를 놓고 스테이지에 고정 후, 조작 현미경 동물을 배치하고 (10)를 사용하여 다음의 조작을 수행하는 단계 - 16 배 배율로. </li><li> 사타구니까지 오른쪽 허벅지, 무릎에서 대퇴 혈관의 바로 앞쪽에 피부 가위를 사용하여 초기 절개를합니다. </li><li> 대퇴 동맥을 확인하고 주위 조직에서 동맥을 동원, 근위를 따릅니다. 확인하고 thermocautery 사용하여 왼쪽 고환에 큰 가지를 잘라. 그 후 왼쪽 고환에 표면적으로 숙박 봉합을 배치합니다. 부드러운 견인은 대퇴 동맥의 추가 근위 동원을 용이하게합니다. </li><li> 근위 동원 종료 후, 식별하고 대규모 분기 실행 mediall 컷thermocautery에 의해 허벅지에 y를 입력합니다. 그 후 오른쪽 허벅지의 말단 부분에있는 대퇴 동맥을 결찰. 합자에 부드러운 견인 더 준비를 도움이됩니다. </li><li> 다시 근위 대퇴 동맥에 지금 관심을 뒤집어 근위 가능한 동맥 주위의 봉합을 배치합니다. 매듭을 준비했지만 아직 묶어하지 않습니다. 봉합에 부드러운 견인을 적용하고 동맥 꼬임을 만들 수 있습니다. </li><li> 꼬임을 설정 한 후, 동맥 신중 microscissor을 사용하고 절개. 대퇴 정맥이 손상되지 않도록 특별한주의를 기울입니다. </li><li> 절개를 통해 준비된 microcatheter (내경 0.28 mm)를 삽입합니다. 카테터 (0.9 % 염화 나트륨, 염화나트륨)을 탈기하고 1 ㎖ 주사기 삽입 이전에 연결되어야한다. </li><li> 카테터의 성공적인 삽입 후, 정중 카테터의 통과를 용이하게하기 위하여 꼬임을 풀어. 동맥 혈류량은 카테터 내에 즉시 볼 수 있어야한다. 부드럽게 카테터를 몇 밀리미터를 진행이전 꼬임 이후의. 그 후, 카테터의 고정을위한 준비 합자를 묶어. </li><li> 부드럽게 정확한 위치를 확인하기 위해 카테터 (0.9 % 염화나트륨)과 대기음을 세척하십시오. 추가 작업 단계에 카테터를 확보하기 위해 테이프의 조각을 사용합니다. </li><li> 적절한 고정 후, cremaster 근육의 다음과 같은 준비 단계를 따로 카테터를 넣어. 혈전 형성을 방지하기 위해 정기적 인 세척 및 카테터마다 5 ~ 10 분의 열망을 적용합니다. </li><li> 오른쪽 음낭에 지금 관심을 켜고 오른쪽 음낭의 복부 측면 위의 피부와 근막을 절단하여 절개를합니다. 모든 악기와 기본 조직을 건드리지 않도록주의하십시오. </li><li> 최대 사타구니 배와 꼬리 쪽 음낭의 말단부에 절개를 확장합니다. </li><li> 그것을 건드리지 않고 cremaster 자루 위를 조심스럽게 분리 기본 부드러운 결합 조직. cremaster의 말단부를 식별하고, SL 여기 숙박 봉합을 배치ightly 근육을 확장 할 수 있습니다. 부드럽게 꼬리 쪽과 앞쪽 근육을 당겨 근육 자루 아래에 지금 남아있는 연부 조직을 절제. </li><li> 결합 조직에서 완전히 분리 한 후, 가위를 사용하여 두개골 가장자리에 한 지점에서 cremaster의 자루를 엽니 다. 근육의 선단이 개방 아래에서 절개를 확장합니다. </li><li> 그 후 가위를 사용하여 근육과 고환 사이의 나머지 연결을 절단, thermocautery 사용하여 고환과 cremaster를 연결하는 작은 용기를 밀봉. </li><li> 현미경 필드 중에 고환을 옆으로 누워. </li><li> 열린 cremaster 이제 무대에 평평. cremaster 근육 조직을 확산하기 위해 조직의 가장자리에 네 6-0 Prolene으로 숙박 봉합을 배치하고 탄력있는 주름으로 수정합니다. 지금부터 연속적으로 1 ㎖ 주사기 (도 1)를 사용하여 인산염 완충 식염수 (PBS)로 조직을 적실. </li><li> 지금 15 분 동안 휴식을 준비 할 수 있습니다. 그 후 주입미세 혈관의 콘트라스트 향상을위한 좌측 대퇴 동맥을 통해 1 % 로다 민 - 덱스 트란의 0.05 ~ 0.1 ML. 어떤 케모카인이나 염증성 에이전트가 응용 프로그램에 대한 계획하는 경우, 당신은 지금 화제로 1 ML의 주사기를 사용하여 각각의 시약과 근육을 습하게한다. 대조 실험의 경우, PBS로 가습 계속. </li></ol> 2. 의 intravital 현미경 <ol><li> 가동 스테이지 상에 고정 된 마우스를 유지하고 에피 조명용 변성 및 CCD (전하 결합 소자) 비디오 카메라에 접속 형광 현미경으로 움직인다. 대퇴 동맥 카테터를 탈구하지 않도록 특별한주의를 기울입니다. </li><li> 침수 목표를 사용하여 실험을 실시하고 있습니다. </li><li> cremaster의 미세 혈관의 충분한 시각화 및 세포 주입하기 전에 목표를 조정 한 후, 확률 적으로 회사의 줄기 세포 부착 이후 분석을 위해 여섯 후 모세관 세정맥을 정의합니다. </li><li> 형광 표지 된 줄기 세포를 관리,대퇴 동맥 카테터를 이용하여 다섯 경기를 연속으로 주사의 총과 1 ML의 주사기와 주입 당 0.4 × 10 6 세포에 200 ㎕의 PBS에 용해. 에 앞서 첫 번째 주사로 세포 샘플을 흔들어. </li><li> 기록 줄기 세포함으로써 일반적인 세​​포와 함께 내피 안감을 따라 셀 속도의 50 % 이상 감소로 &quot;만들기&quot;를 정의, 세포 주입 후 즉시 롤링 &quot;스틱 및 해제&quot;운동을. 롤링 줄기 세포의 카운팅과 매 사출 다음 관찰 한 분 동안 미리 정의 세정맥 거리를 통과하는 모든 줄기 세포를 수행한다. 줄기 세포 말기의 양은 모두 전달 세포의 백분율로서 표현된다. 롤링 세포로 무작위 간단한 테 더링 현상을 보이는 세포를 계산하지 않습니다. </li><li> 마지막 셀 사출 카운트함으로써 단단히 부착 줄기 세포의 수를 결정하고 번째의 계산 내피 표면 관계로 양을 표현 다음전자 사전 정의 된 6 개의 작은 정맥 (직경 x 길이 x π) 부착 세포 / mm 2로. 어떤 세포의 움직임이 30 초 동안 감지 할 수 없을 때 회사 접착 간주됩니다. </li><li> 의 intravital 현미경을 완료 한 후 신중하게 cremaster 근육을 제거하고 나중에 분석 (면역 조직 화학이나 분자 생물학)에 대응하여 저장합니다. 자궁 전위에 의해 동물을 희생. 줄기 세포 압연 회사 내피 부착뿐만 아니라, 적혈구 속도 (mm / 초), 선박 길이 (μm의), 혈관 직경 (μm의), 벽의 공유 속도와 같은 미세 혈관 혈류 역학의 정량의 intravital 현미경 기록의 분석 (초 -1), 이미지 처리 소프트웨어를 이용하여 각 실험 조직 치료 멀게 조사자에 의해 오프라인으로 수행되어야한다. </li></ol>

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</ol>

이 원고를 실시 모든 동물 실험은 지역 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

<html> 의 intravital 형광 현미경 직접 시각화 및 줄기 세포 내피 세포 상호 작용의 정량 분석​​을 할 수 있습니다. 노광 및 미세 수술 기술의 intravital 시각화가 잘 백혈구 - 내피 세포 상호 작용 및 다양한 화학 성분에 대한 연구 중에 선택적 superfusion 간단한 기술에 의해 표적 조직에 적용 할 수있는 확립 된 이후 cremaster 근육 모델은 특히 유용하다. 인해 움직임 아티팩트 심한 화상 노이즈의 부재로,이 특정 모델이 좀더의 intravital-현미경 설정에 비해, 세포 - 세포 상호 작용의 시각화를위한 최적의 조건을 제공한다. 이 모델은 살아있는 유기체에서 개최하는 최초의 줄기 세포 모집에 필수적인 미세 환경 전제 조건을 공개 할 수 있습니다. 필요한 경우, 내생 백혈구는 유효성 검사를 위해 긍정적 인 컨트롤을 제공하고 줄기 세포 행동의 원리를 증명할 수 있습니다. jove_content는 &quot;&gt; 급성 동물 모델을...

본 문서의 목적은 주변의 골수 줄기 세포 이동의 직접 관찰 및 분석을위한 마우스 cremaster의 미세 혈관에 적용의 intravital 현미경의 기술 (IVM)를 설명하는 것입니다. 줄기 세포의 현재 개념 기반의 조직 및 장기 재생은 손상된 조직 1 골수 유래 줄기 세포의 원점을 포함한다. 성공적인 줄기 세포의 이동을위한 중요한 단계는 내피 마이그레이션 결국 장기 생착 2 다음에 부상 기관 내에서 지방의 내피 세포와 세포의 상호 작용을 줄기가 포함되어 있습니다. 이러한 줄기 세포의 intravital 분석 - 내피 세포 상호 작용은 생체 내에서 서로 다른 병태 생리 학적 설정에서 줄기 세포 기반 재생 반응의 정량화를위한 ​​이상적인 매개 변수를 형성한다. 게다가 생각할 보인다, 미래에 특정 줄기 세포 (P)의 이동성 용량의 intravital 분석표준화 된 미세 순환 환경 내 opulations는 이전에 추가 임상 시험에이 인구를 전진 적용 할 수 있습니다. 의 intravital 현미경 초기 염증 연구 3의 분야에서 생체 내에서 백혈구 - 내피 세포 상호 작용의 관찰 및 정량화를 위해 개발되었다. 의 intravital 현미경 연구의 첫 번째 성공 기록은 광학 현미경 4에서 개구리 &#39;방언과 mesenteries을 공부하고, 19 세기에 이미 Cohnheim에 의해보고되었다. 처음 사용 IVM은 엄청난 기술 개발과 오늘을받은 이후 특정 필수 구성 요소는 양적 IVM을 수행하기 위해 전제 조건을 형성 : (I) 조직 광 액세스를 허용 준비, (ⅱ) 현미경으로 검출 할 수있다 분자 프로브, (ⅲ ) 검출 시스템 및 화상 데이터로부터 그 파라미터를 추출 할 수있다 (iv) 컴퓨터 기반 분석 시스템에 연결된 현미경4를 설정합니다. 조직 준비의 다양한 mesenteries 및 마우스와 쥐 5, 마우스, 6, 햄스터, 토끼 귀 및 이름에 햄스터 뺨 주머니의 등쪽 피하 지방 챔버의 간을 포함 IVM의 연구에 도입되었습니다. 그러나, 준비 및 시각화가 잘 표준화 된 수술로 가능으로 다음에 우리의 intravital 관찰을위한 이상적인 조직을 나타내는 마우스 cremaster 근육에 초점을 맞출 것이다, 그리고 일반적으로 운동의 유물 아무런 문제가 발생하지 않습니다. 오픈 cremaster 근육 준비는 바에즈에 의해 1970 년대에 처음 실시와 동료 7되었다. 원래 쥐에 대해 기재된, 그것은 마우스 (8)에 성공적으로 채택되었다. 이전의 연구는 주로 혈관 벽 백혈구의 상호 작용에 초점을 맞추고 난 후에, 우리 자신의 그룹은 최근에를 증명하는 등의 마우스 cremaster 근육 준비를 도입직접 시각화 및 정의 미세 구 내에서 줄기 세포 - 내피 세포 상호 작용의 정량적 분석을위한 상상력 도구입니다. 각종 줄기 세포 모집단은 뮤린 C-KIT + 골수 줄기 세포 및 중간 엽 줄기 세포뿐만 아니라 인간의 CD (133) + 골수 줄기 세포 10-12 등이 모델을 이용하여 연구되었다. 기증자의 골수 및 시각화를위한 형광 표지로부터 세포 격리 다음, 줄기 세포를 선택적으로함으로써 원격 장기 내의 세포 포획을 회피 대퇴 동맥을 통해 동맥 주입을 이용하는 cremaster 미세 혈관에 적용된다. 잠재적으로 각각 설정 내의 로컬 줄기 세포의 이동을 매개 각종 케모카인이 국소 superfusion 간단한 기술에 의해 표적 조직에 적용 할 수 있기 때문에 한층 cremaster 근육 모델은 특히 유용하다.

<table><tbody><tr><td>Carboxy-fluorescein diacetate succinimidylester (CFDA)</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA, USA</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine 6 G (1%)</td><td>Sigma-Aldrich, Munich, Germany</td><td>83697</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin (Ketanest)</td><td>Pfizer, Berlin, Germany</td><td>사용할 수</td><td></td>없음</tr><tr><td>Xylacin (Rompun)</td><td>Bayer, Leverkusen, Germany</td><td>사용할 수</td><td></td></tr> <tr><td>없음Dulbecco's Phosphate - buffered saline (PBS)</td><td>PAN Biotech, Aidenbach, Germany</td><td>P04-36500</td><td></td></tr></tbody></table>

주변 줄기 세포 이주의 분석을위한 마우스 cremaster 근육에있는 미세 혈관의의 intravital 현미경

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

회생 세포 치료의 맥락에서 혈관 세포 애플리케이션 프로토콜의 시대에서, 조직 nonmarrow 줄기 세포 이동의 기본 메커니즘은 완전히 명확하지 않았다. 우리는 여기에서 생체 내에서 주변의 골수 줄기 세포 이동의 분석을 위해 마우스 cremaster의 미세 혈관에 적용의 intravital 현미경의 기술을 설명합니다. M.의 cremaster의 현미경의 intravital 이전 혈관 내피 세포와 백혈구 작용의 직접적인 관찰에 염증 연구 분야에 도입되었다. 충분한 주변 줄기 및 전구 세포의 이동은 내피와 intravasculary 관리 줄기 세포의 상호 작용의 관찰과 정량 M.의 cremaster 모델을 적용하기 위해 생각할 수있다 안감 내피에 따라 확고한 접착 롤링 유사한 초기 단계를 포함하기 때문에. 각종 화학 성분을 선택적으로 표적 t에 적용될 수있는 바와 같이superfusion 간단한 기술에 의해 문제는 그것이 골수 변두리 살아있는 유기체에서 일어나는 초기 줄기 세포 모집위한 필수적인 전제 조건의 미세 환경을 확립하는 것이 가능하다.

일반적으로, 직접적으로 상호 작용이 cremaster 근육 미세 혈관 내에서 혈관 내피 세포와 줄기 또는 전구 세포를 주입하는 것은 드문 경우이며, 후 모세관 세정맥 (직경 : 30 ~ 80 μm의)에 독점적으로 발생합니다. 때문에 형광 라벨 압연에 단단히 부착 줄기 세포는 명확하게 (그림 2) 관찰 세정맥에서 내생 백혈구 순환에서 분리 정량화 할 수있다. 혈액 유속 및 벽 전단 속도로 나타내는 미세 순환 조건은 일반적으로 다른 케모카인 치료 (표 1)와 각 실험 그룹간에 큰 차이가 없다. 염증 반응의 다른 케모카인 또는 매개체로 cremaster 근육 조직의 국소 치료, 예를 들어, SDF-1α (간질 세포 유래 인자-1 알파) 또는 TNF-α (종양 괴사 인자 - 알파)는 특정 마일을 모방 할 수있다croenvironmental 조건. 이러한 조...

마우스 M.의 cremaster 미소 순환의 intravital 현미경은 독특하고 주변 골수 줄기 세포 이동의 분석을위한 생체 모델에서 잘 표준화을 제공합니다.

주변 줄기 세포 이주의 분석을위한 마우스 Cremaster 근육에있는 미세 혈관의의 intravital 현미경

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

이 실험 과정의 전반적인 목표는 생체 내(in vivo)에서 줄기세포와 혈관 내피세포의 상호작용을 시각화하는 것입니다. 이를 위해 먼저 진정 상태의 동물에게 대퇴 동맥 카테터를 삽입하여 동맥 내 접근 경로를 확보합니다. 두 번째 단계에서는 생체 내 형광 현미경 관찰을 위해 둔근을 외과적으로 준비합니다.다음으로, 관심 대상인 줄기세포군을 대퇴동맥 카테터를 통해 주입합니다. 최종적으로, 입양 전이된 줄기세포와 주 근육 미세순환 내피세포 간의 상호작용을 시각화하고 정량화할 수 있습니다. 이 방법은 치료 목적으로 적용된 줄기세포의 이동이 살아있는 생체 내에서 어떻게 조절되는가와 같이 재생 의학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다.미세수술을 시작하기 전, 0.9% sodium chloride가 담긴 1 mL 주사기에 카테터를 연결합니다. 그런 다음, 마취된 20~25 mg의 수컷 생쥐의 오른쪽 음낭 전면과 오른쪽 허벅지 및 서혜부를 부드럽게 제모합니다. 젖은 면봉으로 떨어진 털을 모두 제거한 후, 하단 플레이트와 뒷다리와 음낭을 들어 올리기 위해 하단 플레이트의 끝부분에 두 번째 플레이트가 설치된 맞춤형 플렉시글라스 관찰 스테이지 위에 생쥐의 복부가 위로 향하게 놓습니다.탄성 드레이프로 발을 고정한 후, 동물의 체온을 37 °C로 유지하기 위해 스테이지를 가열 패드 위에 놓습니다. 그런 다음 10~16배 배율에서 해부 현미경과 가위를 사용하여 무릎에서 서혜부까지 대퇴 혈관의 바로 앞쪽, 오른쪽 허벅지에 초기 절개를 가합니다. 대퇴동맥을 식별하고 주변 연부 조직으로부터 동맥을 분리하며 근위 방향으로 따라갑니다.그다음 전기 소작기를 사용하여 왼쪽 고환으로 이어지는 굵은 동맥 분지를 확인하고 절단합니다. 왼쪽 고환의 표면에 6-0 Prolene 유지 봉합사를 배치합니다. 이어서 허벅지 내측으로 주행하는 굵은 동맥 분지를 확인하고 전기 소작합니다.다음으로, 가볍게 견인하면서 오른쪽 허벅지의 원위부에서 대퇴동맥을 결찰하고, 동물의 중심에 최대한 가깝게 근위부 대퇴동맥 주변에 봉합사를 배치합니다. 이제 대퇴동맥 주변에 느슨하게 매듭을 만들되, 꽉 조이지는 마십시오. 그런 다음 봉합사를 가볍게 견인하여 동맥 꼬임(kinking)을 유도합니다.Kinking을 형성한 후, 마이크로 가위를 사용하여 대퇴정맥이 손상되지 않도록 각별히 주의하며 동맥의 크기를 조심스럽게 조절합니다. 다음으로, 이전에 준비한 마이크로카테터를 절개 부위에 삽입합니다. 카테터가 원활하게 통과할 수 있도록 kinking을 조심스럽게 풀어줍니다.카테터 내로 동맥혈 흐름이 즉시 보여야 합니다. 카테터를 이전의 꼬인 부분 너머로 몇 mm 정도 천천히 전진시킵니다. 그 다음, 준비된 결찰선을 묶어 카테터를 고정합니다.이제 염화나트륨으로 카테터를 부드럽게 세척한 다음, 용액을 흡인하여 카테터의 위치가 정확한지 확인합니다. 테이프를 사용하여 카테터를 수술대에 더욱 견고하게 고정하십시오. 카테터가 적절하게 고정되어 옆으로 옮겨지면, 오른쪽 음낭의 복측 상단 피부와 근막을 절개합니다.기구로 하부 조직을 건드리지 않도록 주의합니다. 절개 부위를 서혜부 주름까지 연장하고 음낭의 말단부까지 조심스럽게 절개합니다. 그런 다음 조직 자체를 건드리지 않으면서 음낭거근낭 위의 하부 연조직과 결합 조직을 조심스럽게 분리합니다.그 후, 근육을 약간 신장시키기 위해 고환거근(cremaster)의 원위단에 6-0 prolene 유지 봉합사를 배치합니다. 다음으로, 근육낭 아래의 나머지 연조직을 절제하기 위해 근육을 조심스럽게 가쪽 및 앞쪽으로 당깁니다. 결합 조직으로부터 완전히 분리한 후, 가위로 고환거근낭의 두측 가장자리를 절개하고 이 개구부에서 근육의 원위단까지 절개선을 확장합니다.고환과 음낭올림근을 연결하는 작은 혈관을 전기 소작한 후, 가위를 사용하여 근육과 고환 사이의 나머지 연결 부위를 절단합니다. 절개된 음낭올림근은 이제 스테이지 위에 평평하게 놓이게 됩니다. 이제 조직 가장자리에 6-0 prolene Stay 봉합사를 네 군데 배치하고 탄성 드레이프로 고정합니다.이 시점부터 고환올림근 조직을 펼치기 위해, 1 mL 시린지를 사용하여 PBS로 조직을 지속적으로 적셔 줍니다. 준비물이 15분 동안 안정된 후, 미세혈관의 대조도 향상을 위해 왼쪽 대퇴동맥을 통해 1% rhodine dextrin 0.05~0.1 mL를 주입합니다. 이제 마우스와 스테이지를 전하결합소자(CCD) 아래로 이동시킵니다.에피 조명(epi illumination) 방식으로 개조되어 비디오 카메라가 연결된 형광 현미경을 사용하여, 대퇴 동맥 카테터가 이탈되지 않도록 각별히 주의하며 관찰합니다. 수침 렌즈를 조정하여 chma 미세순환이 충분히 시각화되면, 이후 견고한 줄기세포 부착을 분석하기 위해 6개의 모세혈관 후 정맥(post capillary ES)을 무작위로 지정합니다. 다음으로 1 mL 주사기에 이전에 표지한 형광 공여 골수 줄기세포 200 µL를 채웁니다.주사기를 가볍게 두드려 세포 현탁액을 재현탁한 후, 대퇴 카테터를 통해 40 µL씩 총 5회 연속으로 세포를 주입합니다. 세포 주입 직후 줄기세포의 롤링(rolling) 현상을 기록합니다. 롤링은 전형적인 세포의 부착 및 분리 운동과 더불어, 혈관 내피층을 따라 이동하는 세포 속도가 50% 이상 감소하는 것으로 정의합니다.생체 내 현미경 관찰이 완료된 후, 거근(cremaster muscle)을 조심스럽게 제거하여 추후 분석을 위해 보관합니다. 일반적으로, 직접 주입된 줄기세포 또는 전구세포가 거근 미세혈관 내의 혈관 내피세포와 상호작용하는 것은 드문 일이며, 형광 표지로 인해 모세혈관 후단(post capillary beds)에서만 독점적으로 발생합니다. 검은색 화살표로 표시된 롤링 세포(rolling cells)와 흰색 화살표로 표시된 단단히 부착된 줄기세포는 혈관 내를 순환하는 내인성 백혈구와 명확하게 구분될 수 있습니다.혈류 속도와 벽 전단율로 나타나는 미세 순환 상태는 일반적으로 서로 다른 케모카인 처리를 거친 각 실험군 간에 유의미한 차이를 보이지 않습니다. 서로 다른 케모카인 또는 염증 반응 매개체로 ker 마스터 근육 조직을 국소 처리합니다. 예를 들어, stromal cell derived factor one alpha 또는 tumor necrosis factor alpha는 특정한 미세환경 조건을 모사할 수 있습니다.이러한 조건은 적용된 특정 케모카인이나 매개체, 그리고 주입된 줄기세포군에 따라 줄기세포와 혈관 내피세포 간의 상호작용을 다양한 정도로 증진시킵니다. 이 영상을 시청한 후에는 CreER 근육 미세혈관의 생체 내 현미경 관찰(intravital microscopy)을 통해 체내에서 줄기세포와 세포 간의 상호작용을 시각화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

엑기스의 관찰을위한 새로운 다양한 방법을 제시합니다. 이것은 장기 관찰에 적합 간주하고, pharmacophysiological 또는 분자 생물 학적 중재와 함께입니다.

내부 핵심 현미경에 의해 골격근의 생체내 미세 순환 측정

pial 엑기스의 시간적 및 공간적 hemodynamic 및 염증성 이벤트를 따라 Intravital 현미경.

휴일 두개골 윈도우를 사용하여 마우스 뇌 엑기스의 Intravital 현미경

조직 준비는 시각화와 생활 엑기스의 실험 조작에 대해 설명합니다. anesthetized 남성 생쥐에서 얇고 높은 vascularized cremaster 근육이 arterioles, 모세 혈관 및 venules 포함한 microvascular 네트워크를 공부 intravital 현미경을위한 준비가되어 있습니다. 이 준비는 즉시 쥐와 햄스터에 대한 적응이다.

엑기스의 Intravital 이미징을위한 마우스 Cremaster 근육 준비

Microiontophoresis은 micropipette의 내부와 외부 사이의 전기 잠재력의 차이에 대한 응답으로 micropipette에서 이온의 움직임을 알아볼 수 있습니다. 생물 학적 활성 분자는이를 통해 전류에 비례하여 전달됩니다. 우리는 엑기스에서 내피 의존 vasodilation 공부를 미세 조작과 함께 아세틸콜린의 microiontophoresis을 설명합니다.

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우리는 생체내에서 호중구 chemoattractant의 근원에 대한 응답으로 호중구 모집 중에 동적으로 호중구 - 내피 세포 상호 작용을 측정하기위한 brightfield intravital 현미경의 프로토콜을 설명합니다. 호중구 intraluminal 크롤링, 마우스 cremaster 근육 조직에 transendothelial 마이 그 레이션 및 chemotaxis 시간은 타락한 동영상 사진 및 ImageJ와 추적과 시각입니다.

추적 호중구 Intraluminal 크롤링, Intravital 비디오 현미경에 의한 조직의 Transendothelial 마이 그 레이션 및 Chemotaxis

cremasteric microcirculation의 postcapillary venules 디지털 intravital epifluorescence 현미경은 백혈구 - 내피 상호 작용에 대한 통찰력을 얻을 수있는 편리한...

쥐 Cremaster 근육의 국소 빈혈 reperfusion의 - 상해에서 백혈구 - 내피 상호 작용의 실시간 디지털 이미징 (IRI)

여기 혈관 염증 및 라이브 쥐 혈전 형성되는 동안 활성화 내피에 heterotypic 혈소판 호중구 상호 작용을 시각화하는 형광 intravital 현미경의 실험 기술을보고합니다. 이 현미경 기술은 혈관 질환의 분자 메커니즘을 연구 할 수 있고 pathophysiological 조건에 따라 pharmacologic 요원을 테스트 할 가치가 있습니다.

라이브 마우스의 혈관 염증과 혈전 형성하는 동안 활성화 내피에 Heterotypic 혈소판 - 호중구 상호 작용의 실시간 영상

마우스의 장간막 정맥에 대한 이 단순화된 생체 내 현미경 검사는 백혈구-내피 및 혈소판-백혈구 상호 작용을 관찰하기 위해 다양한 염증 모델에 사용할 수 있습니다.

마우스의 Mesenterial 혈관에서의 생체 내에 현미경 백혈구 - 내피 세포와 혈소판 - 백혈구 상호 작용

Monocytes는 주변 동맥 질병의 맥락에서 arteriogenesis의 중요 한 중개자. 지하실 막 같은 매트릭스 및 intravital 현미경 검사 법을 사용 하 여,이 프로토콜 대 퇴 동맥 결 찰 murine 모델에 monocyte 주입 후 monocyte 유도 및 종양 관련 신생을 조사 합니다.

Intravital 현미경 Monocyte 유도 및 주변 동맥 질병의 Murine 모델에서 종양 관련 신생의

여기에서, 우리는 마우스 cremaster 근육의 포스트 모세관 정맥에 intravital 현미경 검사법을 수행하는 방법을 보여줍니다. 일반적으로 염증과 패혈증의 다른 모델, 특히 케모카인과 사이토 카인에 의해 유도 된 모델에 적용, 우리는 과장 된 근육 백혈구 침투를 포함하는 muscolopathies의 연구에서 그 관련성을 강조.

Intravital 현미경 검사법에 의해 평가된 마우스에 있는 Cremaster 근육의 백혈구 침투

백혈구와 혈소판의 모집은 동맥 형성 동안 측부 동맥의 효과적인 성장에 필요한 필수 구성 요소를 구성합니다. 다광자 현미경은 동맥 형성 중 백혈구 모집 및 유출을 연구하기 위해 생체 내에서 높은 시공간 분해능과 더 적은 광독성으로 세포 역학을 추적하는 효율적인 도구입니다.

쥐 뒷다리 모델에서 동맥 형성 중 백혈구 모집을 모니터링하기 위한 다광자 생체 내 이미징

배우세요 마우스 크리마스터 근육 미세혈관에서 생체 내 현미경법을 이용한 줄기 세포-내피 세포 상호작용 분석 방법을. 이 기술은 재생의학 연구에서 줄기 세포 이주 메커니즘을 실시간으로 정량화하는 데 활용됩니다.

주변 줄기 세포 이주의 분석을위한 마우스 Cremaster 근육에있는 미세 혈관의의 intravital 현미경

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