Name: 문화의 차별화 된 인간 Neuroprogenitor 세포에서 신경 세포의 레이저 캡처 미세 절제 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: 배우세요 인간 신경전구세포를 확대 배양하여 신경영양인자로 분화시키고, 레이저 캡처 미세절제로 순수 신경세포를 분리하여 유전자 발현 분석을 수행하는 방법을 익히세요.

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이 작품은 (SP에) 재향 군인회에서 공로 검토 교부금 (NEUD-004-07F)에 의해 지원되었다.

1. 인간의 NPC의 확장 (그림 1) <ol><li> 냉동 태아의 뇌 (론자, 워커, MD, USA) 및 확산 보충제, EGF (10 NG / ML)를 포함 neurobasal 매체 neurosphere를 (그림 1A)로 T-75 플라스크 현탁 배양을에서 인간의 NPC의 주식을 회복 FGF (10 NG / ㎖). </li><li> 문화의 3 일 후에, 5 분 동안 500 rpm에서 15 ML 튜브와 원심 분리기에 neurosphere를 전송할 수 있습니다. </li><li> 세포 펠렛 위 ~ 100 ㎕의 매체를 남겨두고 뜨는을 취소하고 에펜 도르프 튜브에 전송할 수 있습니다. 100 μL의 세포 펠렛은 2 T-75 플라스크로 분할 충분하다. neuroprogenitor 세포 얇은 분할면 증식 실패로 이하, 플라스크의 수를 줄이는 경우. </li><li> 튜브의 바닥에 대하여 200 μL 팁을 유지하면서, 200 μL 팁 50X로 펠렛을 씹다. 똑같이 두 부분으로 세포 현탁액을 나누고 2 T-75 플라스크 (1-2 분할), 계속 하나에 추가차별화를위한 확장과 다른. </li><li> neurosphere를이 300 ~ 500 μM의 원래 크기에 도달 할 때까지 모든 4~5일 매체를 변경하여 확장 (첫 번째 플라스크)에 대한 neuroprogenitor 세포의 문화를 계속합니다. (500 rpm으로, 5 분) 원심 분리하여 매체를 변경, 기존의 매체를 폐기하고 새로운 매체를 추가 할 수 있습니다. </li></ol> 2. 신경 풍부한 문화에 인간의 NPC의 분화 (그림 2) <ol><li> 신경 세포의 풍부한 문화에 neuroprogenitor 세포의 분화를 들어, 각 웰에 500 μl를 추가하여 폴리-L-라이신 100 μg / ㎖로 24 - 웰 플레이트와 코트의 각 웰에 하나의 커버 슬립을 배치합니다. RT에서 30 분 동안 접시를 품어. </li><li> 폴리-L-라이신 솔루션을 기음과 멸균 물 접시를 씻어. </li><li> 다음, 코트는 5 ㎍ / ㎖의 마우스 라미닌 500 μL와 접시의 우물과는 30 분 동안 품어. 배양 한 다음, PBS로 우물을 씻어. </li><li> 사일 splitti 후세포 (단계 1.4) 겨, 24 웰 플레이트의 웰 당 ~ 500을 neurospheres의 밀도로 코팅 된 요리로 &#39;차별화&#39;라는 플라스크에있는 작은 neurosphere를 전송합니다. </li><li> neurosphere를이 접시에 부착하면 6 시간 후, 증식 배지를 제거하고 neurobasal 매체로 구성된 차별화 매체를 추가, B27 보충제, NGF (20 NG / ML), BDNF (10 NG / ML), DBC (100 ㎜), 및 레티노 산 (2 μM). </li></ol> 3. 차별화의 NPC의 면역 형광 염색법 (그림 3) <ol><li> 두 주 동안 신경 세포 분화 배지에서 neuroprogenitor 세포의 문화에 따라, 신경 세포의 풍부한 문화를 얻을 수있다. 한 번 PBS에 신경을 씻어 다음 30 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드로 수정합니다. 고정되면, PBS로 세포를 세 번 씻어. </li><li> 60 분 동안 RT에서 permeabilization 완충액 (5 %의 BSA와 PBS에서 0.2 % 트리톤 X-100)으로 세포를 배양한다. </li><li> 4 ° C의 난에서 요리를 O / N을 품어NA의 다음 PBS에서 3 % BSA의 클론 및 단클론 항체의 조합으로 통 : 노이 앤 (1:250) 및 synapsin (1:250), 콜린 에스 테라 아세틸 (1:500) 및 시납 (1:250), BDNF (1 : 500) 및 GAP43 (1:250), STAT3 (1:500) 및 GFAP (1:1,000). </li><li> PBS와 커버 슬립을 세 번 씻어 준 후 90 분 동안 실온의 어두운 곳에서 안티 - 토끼를 Cy3 및 안티 마우스 FITC 차 항체를 품어. 배양 한 다음, PBS로 커버 슬립을 세 번 씻는다. </li><li> 집게로 배양 접시에서 커버 슬립을 꺼내 설치 매체에 거꾸로 배치, 유리 슬라이드에 장착 매체의 10 μl를 놓습니다. 부드럽게, 초과 설치 매체를 닦아 매니큐어와 가장자리를 밀봉. </li><li> 형광 현미경의 면역 염색 신경을 검사합니다. </li></ol> 4. 뉴런의 레이저 캡처 미세 절제 (그림 4) <ol><li> PEN 막 슬라이드에 신경 세포의 풍부한 문화에 NPC의 차별화도 2에 대해 기술 된 절차에 따라 폴리-L-라이신 및 마우스 라미닌으로 코팅들. </li><li> RNase가없는 상태에서 이후의 모든 단계를 수행합니다. </li><li> 세포를 시각화하는 HistoGene 스테인 (악튜러스)를 사용하여 문화를 얼룩. </li><li> 베리타스 LCM 시스템 전체 슬라이드의 도로지도 이미지를 사용하여 성상 세포의없는 순수한 신경 세포 인구의 영역을 찾을 수 있습니다. 그리기 도구를 사용하여 신경을 표시합니다. </li><li> 이 단계 과정에서 컴퓨터 제어 정밀도 및 자동화를 사용하여 이러한 영역의 레이저 캡처를 수행한다. 첫째, IR (적외선)은 멤브레인 캡에 부착 얻기 위해 70 ㎿가 2,500 마이크로 초 펄스의 레이저 전원 설정으로 여러 장소에서 발생합니다. 다음으로, 표시 영역 (10)은 측정 값의 낮은 레벨 설정에서 UV 절삭 공구를 사용하여 절개된다. </li><li> 이러한 프로세스의 결합을 선택적으로 CapSure LCM 매크로 모자에 PEN 막에서 표시된 영역을 캡처합니다. 상기 캡을 들어 올릴 때, n 인 멤브레인eurons 캡을 준수합니다. </li><li> PicoPure RNA 분리 키트 (악튜러스)를 사용하여 LCM 샘플에서 총 RNA를 분리하고 DNA 분해 효소로 처리. </li><li> 키트의 지시에 따라 RiboAMP RNA 증폭 키트를 사용하여 격리 된 RNA를 증폭. </li><li> 인간의 신경 미세 섬유 중쇄 (hNFHc)을 감지하는의 TaqMan 프로브를 사용하여 실시간 RT-PCR 분석을 수행합니다. </li></ol> 약어 : AD, 알츠하이머 병, BDNF, 뇌 유래 신경 영양 인자, CREB, 사이 클릭 AMP 반응 요소 결합 단백질, DBC, Dibutyryl 사이 클릭 AMP, EGF, 표피 성장 인자, FGF, 섬유 아세포 성장 인자, GFAP, 아교 섬유 성 산성 단백질, LCM, 레이저 미세 절제를 캡처; NGF 신경 성장 인자; NPC, neuroprogenitor 셀; PEN, 폴리에틸렌 나 프탈레이트.

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<li>Pugazhenthi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Varicella-zoster+virus+infection+of+differentiated+human+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Varicella-zoster virus infection of differentiated human neural stem cells.</a> J. Virol. 85, 6678-6686 (2011).</li>
<li>Kamme, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+microarray+analysis+in+hippocampus+CA1%3A+demonstration+and+validation+of+cellular+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Single-cell microarray analysis in hippocampus CA1: demonstration and validation of cellular heterogeneity.</a> J. Neurosci. 23, 3607-3615 (2003).</li>
</ol>

선언에 관심 없음 충돌.

우리는이 연구에서 자기 갱신 인간 neuroprogenitor 세포의 분화에 의해 신경 세포가 풍부한 세포 배양 모델과 레이저 캡처 미세 절제에 의해 신경 세포의 순수한 인구를 분리하는 방법을 설명합니다. 우리는 NGF, BDNF, DBC와의 NPC의 신경 세포 분화 레티노 산의 조합을 사용했습니다. DBC는 CREB, 신경 (12)를 강화하는 전사 인자를 활성화하는 데 사용됩니다. 레티노 익산은 세포주기의 종료를 유도하고 아교 인구 (13)를 감소시킨다. 이 연구에서 설명하는 방법은 우리의 이전 보고서 14에 수정을 포함합니다. 우리는 이전에 단일 세포 현탁액을 neurospheres triturating 후 코팅 접시에 시딩하는 단계를 사용했다. 이 저밀도 (그림 2E)의 영역에서 비효율적 인 신경 세포의 분화로 이어질 수 있습니다. 우리는 지금 차이점이 사이의 연락처를 확인하기 위해 나흘 오래 된 작은 neurosphere를 <str...

평생 신경은 측면 심실의 subventricular 영역과 성인 포유류의 뇌 (1)의 치아 이랑의 subgranular 층에서 발생하는 것으로 알려져 있습니다. Neuroprogenitor 세포 (NPC들)이이 지역에서 발생이 신경 세포, 성상 세포 및 희소 돌기 아교 세포 (2)로 분화 할 수있는 다 능성 세포입니다. NPC들 때문에 파킨슨 병, 근 위축성 측삭 경화증, 뇌졸중, 알츠하이머 병 (AD) 3 등 다양한 퇴행성 신경 질환을 가진 환자에 이식 할 잠재력의 관심을 생성했다. 의 NPC와 연구는 일반적으로 이식 각도에 집중했지만 신경 퇴행의 메커니즘을 결정하는 세포 배양 모델로서 NPC 유래 신경의 전위는 충분히 이용되지 않았다. 그렇지 않은으로 이전 연구는 일반적으로 각 실험에 대한 격리 할 필요가 쥐의 뇌 조직에서 분리 된 후 유사 분열 신경을 사용했습니다자기 갱신. SH-SY5Y 및 SK-N-MC 세포를 포함한 인간 신경 아세포종 세포주는 확장 될 수 있지만, 그들은 차 신경의 특성이 없다. 그들은 여러 계대 확장 될 수 있고, 차 뉴런 4,5의 특성과 함께 세포 집단을 생성하기 위해 구별 될 수 있기 때문에 인간의 NPC는 반면에, 양쪽의 이점을 제공한다. 현재의 연구에서, 우리는 인간 태아의 뇌에서 분리 된 시판의 NPC에서 일관성있는 신경 세포의 풍부한 인구를 얻기 위해 새로운 분화 프로토콜을 설명합니다. 이러한 문화가 glial 세포의 작은 퍼센트를 포함 않기 때문에, 우리는 분자 특성에 대한 신경 세포의 순수한 인구를 분리하기 위해 추가적인 방법이 필요합니다. 레이저 캡처의 microdissection (LCM)는 조직 절편에서 세포의 동종 집단을 선택적으로 유전자 발현 분석 (6)에 대해 포착 될 수있는 새로운 기술이다. 뇌는 신경 세포, 아교 및 다른 세포 타이로 구성된 이종 조직이다PES. LCM은 신경 세포 특이 유전자의 발현을 결정하는 데 사용되었다 70-10을 분석한다. 우리는 이전에 구체적으로 해마의 신경 세포 11 감소 사이 클릭 AMP 반응 요소 결합 단백질의 발현 (CREB)과 BDNF를 보여 AD (Tg2576) 마우스 뇌 섹션에서 해마의 뉴런의 LCM을 수행했습니다. 본 연구에서는 PEN 막 슬라이드에서 배양 된 신경 세포의 분리에 대한 인간의 NPC의 확장, 신경 세포의 분화, 신경 세포 마커에 대한 면역 형광 염색 및 LCM에 대한 절차를 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>신경전구세포(NPC) </td><td>Lonza</td><td>PT-2599</td><td></td></tr><tr><td>Neurocult NS-A 인간 기초 배지</td><td>줄기세포 기술</td><td>5750</td><td></td></tr><tr><td>Neurocult NS-A 증식 보충제</td><td>줄기세포 기술</td><td>5753</td><td></td></tr><tr><td>Neurocult NS-A 분화 보충제</td><td>줄기세포 기술</td><td>5754</td><td></td></tr><tr><td>B-27 보충제(50x) </td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>인간 표피 성장 인자</td><td>줄기 세포 기술</td><td>2633</td><td></td></tr><tr><td>섬유 아세포 성장 인자 </td><td>시그마</td><td>F0291</td><td></td></tr><tr><td>뇌 유래 신경 영양 인자 </td><td>세포 신호 전달</td><td>3897S</td><td></td></tr><tr><td>신경 성장 인자 </td><td>Invitrogen</td><td>13257-019</td><td></td></tr><tr><td>디 부티 릴 고리 형 AMP</td><td>시그마</td><td>D-0627</td><td></td></tr><tr><td>poly-L-lysine </td><td>Sigma</td><td>P-5899</td><td></td></tr><tr><td>마우스 라미닌 </td><td>Sigma</td><td>L-2020</td><td></td></tr><tr><td>레티노산</td><td>Sigma</td><td>R-2625</td><td></td></tr><tr><td>STAT3 항체</td><td>세포 신호</td><td>9132</td><td></td></tr><tr><td>GFAP 항체</td><td>세포 신호</td><td>3670</td><td></td></tr><tr><td>GAP43 항체</td><td>형질 도입 실험실</td><td>612262</td><td></td></tr><tr><td>BDNF 항체</td><td>Millipore</td><td>AB1534SP</td><td></td></tr><tr><td>Acetyl cholinesterase 항체 </td><td>Santz cruz</td><td>Sc-11409</td><td></td></tr><tr><td>Synaptophysin 항체</td><td>Abcam</td><td>ab18008-50</td><td></td></tr><tr><td>NeuN 항체</td><td>Chemicon</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>Synapsin 항체</td><td>Novus</td><td>NB300-104</td><td></td></tr><tr><td>Anti mouse FITC</td><td>Jackson Immuno</td><td>115-095-146</td><td></td></tr><tr><td></td><td>연구소</td><td></td><td></td></tr><tr><td>안티 토끼 Cy3</td><td>잭슨 면역</td><td>711-165-152</td><td></td></tr><tr><td></td><td>연구소</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>시그마</td><td>A1653</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 -X 100</td><td>아크로스</td><td>21568-2500</td><td></td></tr><tr><td>파라 포름 알데hye </td><td>피셔</td><td>4042</td><td></td></tr><tr><td>커버슬립 (빅 서클 커버 슬립)</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545-102</td><td></td></tr><tr><td>마운팅 미디엄 (Prolong Gold)</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>펜 멤브레인</td><td>Applied biosystems</td><td>LCM0521</td><td></td></tr><tr><td>Histogene LCM 동결 절제 염색 키트</td><td>Applied biosystems</td><td>KIT0401</td><td></td></tr><tr><td>RiboAmp RNA Amplification kit</td><td>Applied biosystems</td><td>KIT0201</td><td></td></tr><tr><td>Picopure RNA 분리 키트</td><td>Applied biosystems</td><td>KIT0202</td><td></td></tr><tr><td>CapsureMacro LCM caps</td><td>Applied biosystems</td><td>LCM0211</td><td></td></tr></tbody></table>

문화의 차별화 된 인간 neuroprogenitor 세포에서 신경 세포의 레이저 캡처 미세 절제

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

인간 태아의 뇌에서 분리 Neuroprogenitor 세포 (NPC들)는 표피 성장 인자 (EGF) 및 세포의 풍부한 공급을 제공하는 섬유 아세포 성장 인자 (FGF)의 존재하에 증식 조건 하에서 확장 하였다. 의 NPC는 신경 성장 인자 (NGF)의 새로운 조합의 존재하에 분화 된, 뇌 유래 신경 영양 인자 (BDNF), dibutyryl 캠프 (DBC) 및 폴리-L-라이신 및 마우스 라미닌 코팅 접시에 레티노 산은 신경 세포를 얻는 풍부한 문화. NPC들도 neurotrophins과의 부재, DBC 및 레티노 산 및 성상 세포가 풍부한 배양을 수득 모양체 신경 영양 인자 (CNTF)의 존재하에 분화되었다. 차별화의 NPC는 노이 앤, synapsin, 아세틸 콜린, 시납과 GAP43 등의 신경 세포 마커의 패널에 대한 면역 형광 염색을 특징으로했다. 아교 섬유 성 산성 단백질 (GFAP)와 STAT3, 성상 세포 마커는 차별화 된 NPC의 10 ~ 15 %가 검출되었다. 용이하게하기 위해셀 타입의 특정 분자 특성은 레이저 캡처 미세 절제는 폴리에틸렌 나 프탈레이트 (PEN) 막 슬라이드에서 배양 신경 세포를 분리 하였다. 이 연구에서 설명하는 방법은 신경 퇴행의 분자 메커니즘에 대한 우리의 이해를 사전에 가치있는 도구를 제공합니다.

NPC가 확대 (그림 1) 이 neurosphere를 저작하여 단일 세포 현탁액으로 세분화 할 때, 피펫 팁은 현탁액 상하 피펫 일부 저항이 존재하도록 튜브의 바닥을 터치 할 필요가있다. 분쇄 횟수는 개인과 현미경으로 얻어진 세포 현탁액을 검사하여 시행 착오에 의해 결정되어야 사이에서 변화 할 것이다. 의 NPC가 밀착되면 증식이 빠른 속도로있을 것이기 때문에, 그것은 세포 현탁액의 충분한 밀도를 제공하는 것이 중요하다. NPC가 성장하지 않는 경우에, 세포 밀도는 플라스크의 수를 감소시킴으로써 증가되어야한다. 우리는 최대 15 구절에 대한 neurosphere를 확장 할 수있게되었습니다. 인간의 NPC의 따라서 풍부한 공급 인간 태아 조직의 사용을 줄이고, 생성 될 수있다. NPC들과 신경 세포의 지속적인 공급의 경우, 이후 3 ~ 4 구절 처음을 확장하는 것이 바람직하고, NPC들 중 절반을 neurospheres로 확장 될 수 있으며, 나머지 절...

인간 neuroprogenitor 세포 (NPC들)은 증식 조건 하에서 확장 하였다. 의 NPC는 neurotrophins과의 조합의 존재에 신경이 풍부한 문화로 분화되었다. 신경 세포 마커는 면역 형광 염색으로 검출되었다. 뉴런의 순수한 인구를 분리하기 위해,의 NPC는 PEN 막 슬라이드에 차별화 된 레이저 캡처 미세 절제를 행 하였다.

문화의 차별화 된 인간 Neuroprogenitor 세포에서 신경 세포의 레이저 캡처 미세 절제

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

다음 실험의 전반적인 목표는 인간 신경세포 배양 모델을 개발하고, 신경세포 마커를 식별하며, 유전자 발현 분석을 위해 순수한 신경세포 집단을 분리하는 것입니다. 이를 위해 먼저 인간 신경 전구세포를 증식시켜 전구세포의 지속적인 공급원을 확보합니다. 두 번째 단계로, 부착 인자가 코팅된 디쉬에서 분화 보충제와 신경영양 성장 인자가 포함된 배지를 사용하여 신경 전구세포를 배양합니다.다음으로, 분화된 신경 전구세포의 운명을 결정하기 위해 신경 마커에 대한 면역형광 염색을 수행합니다. 마지막으로, 뉴런 특이적 유전자 발현 분석을 용이하게 하기 위해 PEN 막 슬라이드 상에서 배양된 뉴런의 레이저 캡처 미세절단술을 수행합니다. 그 결과, 분화된 신경 전구세포가 주로 신경 세포의 성질을 띠고 있음을 확인하였습니다.면역형광 염색 및 뉴런 포착을 기반으로 합니다. 레이저 캡처 미세 절단술을 통해 인간 신경 전구 세포를 확장하고 뉴런이 풍부한 배양물로 분화시킬 수 있습니다. 이러한 배양물에는 일부 글리아 세포가 포함되어 있으므로, 인비트로(in vitro) 연구를 위해 레이저 캡처 미세 절단술을 사용하여 순수한 뉴런 집단을 분리할 수 있습니다.이 절차의 시연은 현미경 핵심 시설의 선임 연구원인 Ron Bouchard가 맡게 됩니다. 이 절차를 시작하려면, 태아 뇌에서 분리된 인간 신경 전구세포의 동결 스톡을 37 °C로 빠르게 가온하여 해동한 후, 10 ng/mL의 EGF 및 FGF가 첨가되어 미리 가온된 15 mL의 신경 기저 배지가 담긴 T 75 플라스크에 추가하십시오. 세포를 3일 동안 배양한 후, 신경구(neurospheres)를 15 mL 튜브로 옮기고 1000 RPM에서 5분간 원심분리하여 펠릿화합니다. 원심분리 후 상층액을 제거하여 약 100 µL의 배지만 남기고, 세포 펠릿을 에펜도르프 튜브로 옮기십시오.100 µL의 세포 펠렛이면 두 개의 T 75 플라스크로 나누어 배양하기에 충분합니다. 이보다 양이 적을 경우, 신경 전구세포의 증식이 원활하지 않을 수 있으므로 플라스크 수를 줄이십시오. 세포를 희소하게 분할한 경우에는 200 µL 팁을 튜브 바닥에 밀착시킨 상태로 50회 정도 파이펫팅하여 뉴로스피어를 단일 세포 현탁액으로 완전히 분해하십시오.현미경을 사용하여 뉴로스피어(neurospheres)의 해리가 제대로 되었는지 시각적으로 확인하십시오. 다음으로, 세포 현탁액을 동일하게 나누어 두 개의 T 75 플라스크에 넣습니다. 하나는 지속적인 증식을 위해, 다른 하나는 분화를 위해 사용합니다.그 후 플라스크를 배양합니다. 확장이 표시된 플라스크 내 신경 전구 세포의 배지를 원심분리를 통해 교체합니다. 기존 배지를 제거하고 새 배지를 첨가합니다.뉴로스피어(neurosphere)가 원래 크기인 300에서 500 µm에 도달할 때까지 4~5일마다 배지를 교체합니다. 신경 전구 세포(neuro progenitor cell)를 뉴런이 풍부한 배양물로 분화시키려면, 24웰 플레이트의 각 웰에 커버슬립을 하나씩 넣고 100 µg/mL poly L lysine 500 µL를 각각 추가하여 코팅합니다. 플레이트를 상온에서 30분 동안 배양한 후, poly L lysine 용액을 흡입하여 제거합니다.플레이트를 탈이온 멸균수로 헹구고 다시 흡입하여 제거합니다. 다음으로, 플레이트의 웰에 5 µg/mL 농도의 마우스 laminin 500 µL를 코팅하고 30분 동안 배양합니다. 배양 후, 웰을 PBS로 세척하고 다시 흡입하여 제거한 뒤 조직 배양 후드 내에서 건조시킵니다. 세포 분할 4일 후, 분화용으로 표시된 플라스크에서 작은 신경구(neurospheres)를 코팅된 24-웰 플레이트로 옮깁니다.웰당 약 500개의 뉴로스피어(neurosphere) 밀도로 분주합니다. 6시간 동안 배양하여 뉴로스피어가 디쉬에 부착되면, 증식 배지를 제거하고 분화 배지를 첨가합니다. 분화 배지는 neurobasal medium, B27 supplement, NGF, BDNF, CNTF 및 레티노산(retinoic acid)으로 구성됩니다. 플레이트를 다시 인큐베이터에 넣습니다. 신경 분화 배지에서 신경 전구 세포를 2주 동안 배양하면, 뉴런이 풍부한 배양물을 얻을 수 있습니다.뉴런을 PBS로 한 번 헹군 다음 4% paraform aldehyde로 30분 동안 고정합니다. 고정이 완료되면 세포를 PBS로 세 번 헹굽니다. 그 다음, 세포를 상온에서 permeable buffer와 함께 60분 동안 배양하여 면역 염색을 준비합니다.다음으로, PBS 내 3% BSA에 희석된 다클론 및 단클론 항체를 웰에 첨가합니다. 각 웰에 서로 다른 항체 쌍을 넣고, 쉐이커를 사용하여 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 아침, 커버슬립을 PBS로 3회 세척한 후, 암실의 상온에서 anti-rabbit P SI 3 및 anti-US fitzy 2차 항체와 함께 90분 동안 배양합니다.커버슬립을 PBS로 3회 세척합니다. 그 다음 유리 슬라이드 위에 마운팅 용액 10 µL를 떨어뜨립니다. 배양 접시에서 커버슬립을 꺼내 마운팅 용액 위에 뒤집어서 올립니다.남은 마운팅 매질을 부드럽게 닦아내고 가장자리를 매니큐어로 밀봉합니다. 마이크로디섹션을 위해 세포를 준비하려면, 먼저 PEN 막 위에서 신경 전구 세포를 뉴런이 풍부한 배양 상태로 분화시킵니다. 슬라이드는 poly L lysine과 laminin으로 코팅되어 있습니다.이후의 모든 단계는 RNA-free 조건에서 수행하십시오. 다음으로, 세포를 시각화하기 위해 histo gene stain을 사용하여 배양물을 염색합니다. histo gene stain은 핵을 보라색으로, 세포질을 연한 분홍색으로 염색하여 뉴런과 글리아 세포를 고유의 형태학적 특징으로 쉽게 구분할 수 있게 합니다. 슬라이드를 75% ethanol과 탈이온 멸균수에 30초 동안 담급니다.그 다음 슬라이드를 Kim wipe 위에 놓습니다. histo gene 200 µL를 첨가하고 20초 동안 기다립니다. 이어서 슬라이드를 탈이온 멸균수, 75% ethanol, 95% ethanol, 100% ethanol 순으로 각각 30초 동안 담급니다.그 다음 자일렌(xylene)에 5분 동안 담근 후, 킴와이프(Kim wipe) 위에서 5분간 건조합니다. 그런 다음 일반 슬라이드 위에 PEN 멤브레인 슬라이드를 덮고, 소프트웨어를 사용하여 Veritas 레이저 캡처 미세절단 시스템(laser capture micro dissection system) 또는 LCM에 넣습니다. 로드맵 이미지를 촬영하여 성상교세포가 없는 순수 신경세포 집단 영역을 찾습니다.그리기 도구를 사용하여 이 뉴런들을 표시하십시오. 다음으로, 컴퓨터 제어 정밀도와 자동화를 통해 2단계 과정으로 해당 영역의 레이저 캡처를 수행합니다. 먼저, 멤브레인을 캡에 부착하기 위해 레이저 출력 설정 70 milliwatts, 펄스 2, 500 microseconds로 여러 지점에 IR을 조사합니다.다음으로, 표시된 영역을 10 millivolts의 낮은 레벨 설정에서 UV 커팅 도구를 사용하여 절제합니다. 이러한 공정의 조합을 통해 표시된 영역이 LCM 매크로 캡에 선택적으로 포집됩니다. 최소 100개의 뉴런이 포집되면, 현미경을 사용하여 캡에서 막을 제거한 후 튜브에 넣습니다.P OPU RNA 분리 키트를 사용하여 LCM 샘플에서 총 RNA를 분리하고 DNase로 처리합니다. 그 다음, ribo amp RNA 증폭 키트의 지침에 따라 분리된 RNA를 증폭합니다. 마지막으로, TAC MAN 프로브를 이용한 실시간 R-T-P-C-R 분석을 수행하여 인간 neurofilament heavy chain을 검출합니다.poly L lysine 및 라미네이트 코팅 표면을 사용하고 분화 특이적 성장 인자를 함께 처리하여, 4일 된 신경구(neurosphere)를 분화시킴으로써 신경세포가 풍부한 배양물을 얻습니다. 2주 후, 이곳에 표시된 것과 같이 밀도가 낮은 영역에서 신경세포가 풍부한 배양물이 형성됩니다. 세포들은 이곳에서 보이는 것과 같은 성상교세포로 분화될 수 있습니다.뉴런 분화에 사용되는 성장 인자 대신 CNTF를 사용하여 성상교세포 분화를 유도할 수도 있습니다. 뉴런 분화는 특이적 뉴런 마커인 NeuN 및 synapsin, acetylcholinesterase 및 synaptophysin, 그리고 BDNF 및 GAP 43에 대한 항체를 사용하여 확인할 수 있습니다. 양성 염색 결과는 분화된 세포가 일차 뉴런의 특성을 가지고 있음을 입증합니다. 또한, stat3 및 GFAP 면역 염색의 양성 반응을 통해 성상교세포를 식별할 수 있습니다.뉴런의 레이저 캡처 미세해부(Laser capture microdissection)는 poly L lysine과 laminin이 코팅된 PEN 막 슬라이드 상에서 분화된 세포를 대상으로 수행됩니다. 여기에 표시된 것은 histo stain으로 염색된 뉴런입니다. 세포를 시각화한 후, 레이저를 사용하여 분석 대상 세포의 외곽선을 그리면 PEN 막이 녹으면서 그 위에 배치된 캡처 캡에 부착됩니다. 최종적으로 다수의 세포 외곽선을 지정하여 동일한 캡에 캡처함으로써 DNA 또는 RNA 분석을 진행할 수 있습니다.이 영상을 시청한 후에는 레이저 캡처 미세절단법(laser capture microdissection)을 사용하여 뉴런을 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

laser-capture-microdissection-neurons-from-differentiated-human

Research

연구

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Neuroscience

신경과학

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