문화의 차별화 된 인간 Neuroprogenitor 세포에서 신경 세포의 레이저 캡처 미세 절제

다음 실험의 전반적인 목표는 인간 신경세포 배양 모델을 개발하고, 신경세포 마커를 식별하며, 유전자 발현 분석을 위해 순수한 신경세포 집단을 분리하는 것입니다. 이를 위해 먼저 인간 신경 전구세포를 증식시켜 전구세포의 지속적인 공급원을 확보합니다. 두 번째 단계로, 부착 인자가 코팅된 디쉬에서 분화 보충제와 신경영양 성장 인자가 포함된 배지를 사용하여 신경 전구세포를 배양합니다.

다음으로, 분화된 신경 전구세포의 운명을 결정하기 위해 신경 마커에 대한 면역형광 염색을 수행합니다. 마지막으로, 뉴런 특이적 유전자 발현 분석을 용이하게 하기 위해 PEN 막 슬라이드 상에서 배양된 뉴런의 레이저 캡처 미세절단술을 수행합니다. 그 결과, 분화된 신경 전구세포가 주로 신경 세포의 성질을 띠고 있음을 확인하였습니다.

면역형광 염색 및 뉴런 포착을 기반으로 합니다. 레이저 캡처 미세 절단술을 통해 인간 신경 전구 세포를 확장하고 뉴런이 풍부한 배양물로 분화시킬 수 있습니다. 이러한 배양물에는 일부 글리아 세포가 포함되어 있으므로, 인비트로(in vitro) 연구를 위해 레이저 캡처 미세 절단술을 사용하여 순수한 뉴런 집단을 분리할 수 있습니다.

이 절차의 시연은 현미경 핵심 시설의 선임 연구원인 Ron Bouchard가 맡게 됩니다. 이 절차를 시작하려면, 태아 뇌에서 분리된 인간 신경 전구세포의 동결 스톡을 37 °C로 빠르게 가온하여 해동한 후, 10 ng/mL의 EGF 및 FGF가 첨가되어 미리 가온된 15 mL의 신경 기저 배지가 담긴 T 75 플라스크에 추가하십시오. 세포를 3일 동안 배양한 후, 신경구(neurospheres)를 15 mL 튜브로 옮기고 1000 RPM에서 5분간 원심분리하여 펠릿화합니다. 원심분리 후 상층액을 제거하여 약 100 µL의 배지만 남기고, 세포 펠릿을 에펜도르프 튜브로 옮기십시오.

100 µL의 세포 펠렛이면 두 개의 T 75 플라스크로 나누어 배양하기에 충분합니다. 이보다 양이 적을 경우, 신경 전구세포의 증식이 원활하지 않을 수 있으므로 플라스크 수를 줄이십시오. 세포를 희소하게 분할한 경우에는 200 µL 팁을 튜브 바닥에 밀착시킨 상태로 50회 정도 파이펫팅하여 뉴로스피어를 단일 세포 현탁액으로 완전히 분해하십시오.

현미경을 사용하여 뉴로스피어(neurospheres)의 해리가 제대로 되었는지 시각적으로 확인하십시오. 다음으로, 세포 현탁액을 동일하게 나누어 두 개의 T 75 플라스크에 넣습니다. 하나는 지속적인 증식을 위해, 다른 하나는 분화를 위해 사용합니다.

그 후 플라스크를 배양합니다. 확장이 표시된 플라스크 내 신경 전구 세포의 배지를 원심분리를 통해 교체합니다. 기존 배지를 제거하고 새 배지를 첨가합니다.

뉴로스피어(neurosphere)가 원래 크기인 300에서 500 µm에 도달할 때까지 4~5일마다 배지를 교체합니다. 신경 전구 세포(neuro progenitor cell)를 뉴런이 풍부한 배양물로 분화시키려면, 24웰 플레이트의 각 웰에 커버슬립을 하나씩 넣고 100 µg/mL poly L lysine 500 µL를 각각 추가하여 코팅합니다. 플레이트를 상온에서 30분 동안 배양한 후, poly L lysine 용액을 흡입하여 제거합니다.

플레이트를 탈이온 멸균수로 헹구고 다시 흡입하여 제거합니다. 다음으로, 플레이트의 웰에 5 µg/mL 농도의 마우스 laminin 500 µL를 코팅하고 30분 동안 배양합니다. 배양 후, 웰을 PBS로 세척하고 다시 흡입하여 제거한 뒤 조직 배양 후드 내에서 건조시킵니다. 세포 분할 4일 후, 분화용으로 표시된 플라스크에서 작은 신경구(neurospheres)를 코팅된 24-웰 플레이트로 옮깁니다.

웰당 약 500개의 뉴로스피어(neurosphere) 밀도로 분주합니다. 6시간 동안 배양하여 뉴로스피어가 디쉬에 부착되면, 증식 배지를 제거하고 분화 배지를 첨가합니다. 분화 배지는 neurobasal medium, B27 supplement, NGF, BDNF, CNTF 및 레티노산(retinoic acid)으로 구성됩니다. 플레이트를 다시 인큐베이터에 넣습니다. 신경 분화 배지에서 신경 전구 세포를 2주 동안 배양하면, 뉴런이 풍부한 배양물을 얻을 수 있습니다.

뉴런을 PBS로 한 번 헹군 다음 4% paraform aldehyde로 30분 동안 고정합니다. 고정이 완료되면 세포를 PBS로 세 번 헹굽니다. 그 다음, 세포를 상온에서 permeable buffer와 함께 60분 동안 배양하여 면역 염색을 준비합니다.

다음으로, PBS 내 3% BSA에 희석된 다클론 및 단클론 항체를 웰에 첨가합니다. 각 웰에 서로 다른 항체 쌍을 넣고, 쉐이커를 사용하여 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 아침, 커버슬립을 PBS로 3회 세척한 후, 암실의 상온에서 anti-rabbit P SI 3 및 anti-US fitzy 2차 항체와 함께 90분 동안 배양합니다.

커버슬립을 PBS로 3회 세척합니다. 그 다음 유리 슬라이드 위에 마운팅 용액 10 µL를 떨어뜨립니다. 배양 접시에서 커버슬립을 꺼내 마운팅 용액 위에 뒤집어서 올립니다.

남은 마운팅 매질을 부드럽게 닦아내고 가장자리를 매니큐어로 밀봉합니다. 마이크로디섹션을 위해 세포를 준비하려면, 먼저 PEN 막 위에서 신경 전구 세포를 뉴런이 풍부한 배양 상태로 분화시킵니다. 슬라이드는 poly L lysine과 laminin으로 코팅되어 있습니다.

이후의 모든 단계는 RNA-free 조건에서 수행하십시오. 다음으로, 세포를 시각화하기 위해 histo gene stain을 사용하여 배양물을 염색합니다. histo gene stain은 핵을 보라색으로, 세포질을 연한 분홍색으로 염색하여 뉴런과 글리아 세포를 고유의 형태학적 특징으로 쉽게 구분할 수 있게 합니다. 슬라이드를 75% ethanol과 탈이온 멸균수에 30초 동안 담급니다.

그 다음 슬라이드를 Kim wipe 위에 놓습니다. histo gene 200 µL를 첨가하고 20초 동안 기다립니다. 이어서 슬라이드를 탈이온 멸균수, 75% ethanol, 95% ethanol, 100% ethanol 순으로 각각 30초 동안 담급니다.

그 다음 자일렌(xylene)에 5분 동안 담근 후, 킴와이프(Kim wipe) 위에서 5분간 건조합니다. 그런 다음 일반 슬라이드 위에 PEN 멤브레인 슬라이드를 덮고, 소프트웨어를 사용하여 Veritas 레이저 캡처 미세절단 시스템(laser capture micro dissection system) 또는 LCM에 넣습니다. 로드맵 이미지를 촬영하여 성상교세포가 없는 순수 신경세포 집단 영역을 찾습니다.

그리기 도구를 사용하여 이 뉴런들을 표시하십시오. 다음으로, 컴퓨터 제어 정밀도와 자동화를 통해 2단계 과정으로 해당 영역의 레이저 캡처를 수행합니다. 먼저, 멤브레인을 캡에 부착하기 위해 레이저 출력 설정 70 milliwatts, 펄스 2, 500 microseconds로 여러 지점에 IR을 조사합니다.

다음으로, 표시된 영역을 10 millivolts의 낮은 레벨 설정에서 UV 커팅 도구를 사용하여 절제합니다. 이러한 공정의 조합을 통해 표시된 영역이 LCM 매크로 캡에 선택적으로 포집됩니다. 최소 100개의 뉴런이 포집되면, 현미경을 사용하여 캡에서 막을 제거한 후 튜브에 넣습니다.

P OPU RNA 분리 키트를 사용하여 LCM 샘플에서 총 RNA를 분리하고 DNase로 처리합니다. 그 다음, ribo amp RNA 증폭 키트의 지침에 따라 분리된 RNA를 증폭합니다. 마지막으로, TAC MAN 프로브를 이용한 실시간 R-T-P-C-R 분석을 수행하여 인간 neurofilament heavy chain을 검출합니다.

poly L lysine 및 라미네이트 코팅 표면을 사용하고 분화 특이적 성장 인자를 함께 처리하여, 4일 된 신경구(neurosphere)를 분화시킴으로써 신경세포가 풍부한 배양물을 얻습니다. 2주 후, 이곳에 표시된 것과 같이 밀도가 낮은 영역에서 신경세포가 풍부한 배양물이 형성됩니다. 세포들은 이곳에서 보이는 것과 같은 성상교세포로 분화될 수 있습니다.

뉴런 분화에 사용되는 성장 인자 대신 CNTF를 사용하여 성상교세포 분화를 유도할 수도 있습니다. 뉴런 분화는 특이적 뉴런 마커인 NeuN 및 synapsin, acetylcholinesterase 및 synaptophysin, 그리고 BDNF 및 GAP 43에 대한 항체를 사용하여 확인할 수 있습니다. 양성 염색 결과는 분화된 세포가 일차 뉴런의 특성을 가지고 있음을 입증합니다. 또한, stat3 및 GFAP 면역 염색의 양성 반응을 통해 성상교세포를 식별할 수 있습니다.

뉴런의 레이저 캡처 미세해부(Laser capture microdissection)는 poly L lysine과 laminin이 코팅된 PEN 막 슬라이드 상에서 분화된 세포를 대상으로 수행됩니다. 여기에 표시된 것은 histo stain으로 염색된 뉴런입니다. 세포를 시각화한 후, 레이저를 사용하여 분석 대상 세포의 외곽선을 그리면 PEN 막이 녹으면서 그 위에 배치된 캡처 캡에 부착됩니다. 최종적으로 다수의 세포 외곽선을 지정하여 동일한 캡에 캡처함으로써 DNA 또는 RNA 분석을 진행할 수 있습니다.

이 영상을 시청한 후에는 레이저 캡처 미세절단법(laser capture microdissection)을 사용하여 뉴런을 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.