문화의 차별화 된 인간 Neuroprogenitor 세포에서 신경 세포의 레이저 캡처 미세 절제

다음 실험의 전반적인 목표는 인간 신경 세포 배양 모델을 개발하고, 신경 세포 마커를 식별하고, 유전자 발현 분석을 위해 순수한 뉴런 집단을 분리하는 것입니다. 이는 먼저 인간 신경 전구 세포를 확장하여 전구 세포를 지속적으로 공급함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 신경전구세포는 부착 인자로 코팅된 접시에 분화 보충제와 신경영양 성장 인자의 존재 하에서 배양됩니다.

다음으로, 분화된 신경전구세포의 운명을 결정하기 위해 신경세포 마커에 대한 면역형광 염색을 수행합니다. 마지막으로, PEN 멤브레인 슬라이드에서 배양된 뉴런의 레이저 캡처 현미해부를 수행하여 뉴런 특이적 유전자 발현 분석을 용이하게 합니다. 분화된 신경전구세포(neuro progenitor cell)가 자연적으로 주로 신경세포(neuronal)임을 보여주는 결과가 얻어졌습니다.

면역형광 염색 및 뉴런 포획을 기반으로 합니다. 레이저 캡처 미세해부에 의해, 인간 신경전구세포는 뉴런이 풍부한 배양으로 확장되고 분화될 수 있습니다. 체외 연구의 경우, 이러한 배양물에는 일부 gal 세포가 있기 때문에 레이저 캡처 미세 해부를 사용하여 순수한 뉴런 집단을 분리할 수 있습니다.

이러한 절차를 시연하는 사람은 현미경 핵심 시설의 선임 연구원인 Ron Bouchard입니다. 이 절차를 시작하려면 태아의 뇌에서 분리된 인간 신경전구세포를 섭씨 37도까지 빠르게 데운 다음 15밀리리터의 예열 신경 기저 배지를 포함하는 T 75에 추가하고 밀리리터당 10나노그램, EG, F 및 FGF를 보충하여 냉동 저장고를 되살립니다. 세포를 3일 동안 배양한 후, 신경구를 15ml 튜브로 옮기고 원심분리 후 5분 동안 1000RPM에서 원심분리하여 펠릿화하고, 상등액을 버리고 약 100마이크로리터의 배지를 남기고 세포 펠릿을 einor 튜브로 옮깁니다.

100마이크로리터 셀 펠릿은 두 개의 T 75 플라스크로 분리하기에 충분합니다. 더 적으면 신경 전구 세포가 증식하지 못하므로 플라스크의 수를 줄이십시오. 얇게 쪼개진 경우, 200마이크로리터 팁을 튜브 바닥에 대고 유지하면서 위아래로 50회 피펫팅하여 신경구를 단일 세포 현탁액으로 철저히 분해합니다.

신경구의 분리를 확인하기 위해 현미경을 사용하여 진행 상황을 육안으로 확인합니다. 다음으로, 세포 현탁액을 균등하게 나누고 두 개의 T 75 플라스크에 추가합니다. 하나는 지속적인 확장을 위한 것이고 다른 하나는 차별화를 위한 것입니다.

그런 다음 플라스크를 배양하십시오. 원심분리에 의해 팽창하도록 표시된 플라스크에서 neuro progenitor 세포의 배지를 변경합니다. 그런 다음 이전 매체를 버리고 새 매체를 추가합니다.

신경구가 원래 크기인 300-500미크론에 도달할 때까지 4-5일마다 배지를 교체하십시오. 신경 전구 세포가 풍부한 배양으로 분화하기 시작하려면, 24웰 플레이트의 각 웰에 단일 커버 슬립을 배치하고 각각에 100마이크로그램당 100마이크로그램의 폴리L 라이신을 500마이크로리터씩 첨가하여 코팅합니다. 접시를 실온에서 30분 동안 잘 배양한 다음 폴리올 라이신 용액을 흡인합니다.

탈이온수 멸균수로 플레이트를 헹구고 다시 흡입합니다. 다음으로, 플레이트의 웰을 밀리리터당 5마이크로그램 500마이크로리터, 마우스 라미닌으로 코팅하고 배양 후 30분 동안 배양한 다음 PBS 흡인으로 웰을 다시 세척하고 조직 배양 후드에서 건조시킵니다. 세포를 분할한 후 4일 후, 분화를 위해 라벨링된 플라스크의 작은 신경구를 코팅된 24웰 플레이트로 옮깁니다.

신경구가 접시에 부착되면 6시간 동안 배양한 후 웰당 약 500개의 신경구의 밀도를 추가하고 증식 매체를 제거하고 분화를 추가합니다. 신경 기저 매체 B 27 보충제, N-G-F-B-D-N-F-D-B-C 및 레티노산으로 구성된 배지. 2주 동안 신경 분화 배지에서 신경 전구 세포를 배양한 후 플레이트를 인큐베이터로 되돌리면 뉴런이 풍부한 배양액이 얻어집니다.

PBS에서 뉴런을 한 번 헹구고 30분 동안 4% 파라폼 알데히드로 고정합니다. 고정되면 PBS로 세포를 세 번 헹굽니다. 그런 다음 실온에서 60분 동안 투과성 완충액으로 배양하여 면역 염색을 위해 세포를 준비합니다.

다음으로, PBS의 3%BSA에 있는 다클론 및 단클론 항체를 웰에 추가합니다. 각각에 다른 항체 쌍을 추가하고 다음날 아침 셰이커에서 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 잘 배양합니다. 커버 슬립을 PBS로 3회 세척한 후 항토끼 P SI 3 및 항미 피지 2차 항체로 배양 후 90분 동안 실온에서 배양합니다.

PBS로 커버 슬립을 세 번 세척합니다. 그런 다음 10마이크로리터의 장착 매체를 유리 슬라이드에 놓습니다. 배양 접시에서 커버 슬립을 꺼내 장착 매체에 거꾸로 놓습니다.

여분의 장착 매체를 부드럽게 닦아내고 매니큐어로 가장자리를 밀봉합니다. 미세해부를 위해 세포를 준비하기 위해 먼저 신경전구세포를 PEN 막에서 뉴런이 풍부한 배양으로 분화합니다. 폴리 L 라이신과 라미닌으로 코팅된 슬라이드.

RNA가 없는 조건에서 모든 후속 단계를 수행합니다. 다음으로, histo gene stain을 사용하여 배양물을 염색하여 histo 유전자가 핵을 보라색으로 염색하고 세포질이 연한 분홍색으로 염색되는 것을 시각화하여 고유한 형태로 뉴런과 신경교세포를 쉽게 구별할 수 있습니다. 슬라이드를 75% 에탄올과 탈이온수 멸균수에 30초 동안 넣습니다.

그런 다음 슬라이드를 Kim 물티슈에 놓습니다. 200마이크로리터의 히스토 유전자를 추가하고 20초 동안 기다립니다. 그런 다음 탈이온수 멸균수, 75% 에탄올, 95% 에탄올 및 100% 에탄올에 각각 30초 동안 슬라이드를 순차적으로 놓습니다.

그런 다음 자일렌을 5분 동안 넣고 킴 와이프에 5분 동안 말리십시오. 그런 다음 일반 슬라이드 위에 PEN 멤브레인 슬라이드를 놓고 소프트웨어를 사용하여 Veritas 레이저 캡처 미세 해부 시스템 또는 LCM에 배치합니다. 로드맵 이미지를 사용하여 성상세포가 없는 순수 뉴런 집단 영역을 찾습니다.

그리기 도구를 사용하여 이러한 뉴런을 표시합니다. 다음으로, 2단계 공정에서 컴퓨터로 제어되는 정밀도와 자동화를 사용하여 이러한 영역의 레이저 캡처를 수행합니다. 먼저, IR은 70 밀리 와트의 레이저 출력 설정과 2, 500 마이크로 초의 펄스로 여러 지점에서 발사되어 멤브레인을 캡에 부착합니다.

다음으로, 10m볼트의 낮은 수준으로 설정된 UV 절단 도구를 사용하여 표시된 영역을 절제합니다. 이러한 프로세스의 조합은 캡처 LCM 매크로 캡에 표시된 영역을 선택적으로 캡처합니다. 최소 100개의 뉴런이 캡처되면 현미경을 사용하여 캡에서 멤브레인을 제거하고 튜브에 놓습니다.

P OPU RNA 분리 키트를 사용하여 LCM 샘플에서 총 RNA를 분리하고 DNA로 처리합니다. 그런 다음 키트의 지침에 따라 ribo amp RNA 증폭 키트를 사용하여 분리된 RNA를 증폭합니다. 마지막으로, TAC MAN 프로브를 사용하여 실시간 R-T-P-C-R 분석을 수행하여 인간 신경 필라멘트 중쇄를 검출합니다.

뉴런이 풍부한 배양은 분화 특이적 성장 인자와 함께 poly L lysine 및 라미네이트 코팅 표면을 사용하여 4일 된 신경구의 분화에 의해 얻어집니다. 2주 후, 여기에 표시된 뉴런이 풍부한 배양이 저밀도 영역에서 얻어집니다. 세포는 여기에서 볼 수 있는 것과 같은 성상세포로 분화할 수 있습니다.

성상세포 분화는 뉴런 분화에 사용되는 대신 성장 인자 CNTF를 사용하여 지시할 수도 있습니다. 뉴런 분화는 특정 뉴런 마커, 새로운 N 및 시냅신, 아세틸콜린에스테라제 및 시냅토피신, BDNF 및 GAAP 43 양성 염색에 대한 항체를 사용하여 식별할 수 있습니다. 또한 성상세포는 positive stat three 및 GAP 면역 염색을 통해 확인할 수 있습니다.

뉴런의 레이저 캡처 미미해부는 폴리 L, 라이신 및 라미닌 코팅된 PEN 멤브레인에서 분화된 세포에서 수행됩니다. 여기에 표시된 슬라이드는 히스토 염색으로 염색된 뉴런입니다. 세포를 시각화하기 위해 레이저를 사용하여 관심 세포의 윤곽을 그릴 수 있으며, 이 레이저는 PEN 멤브레인을 녹여 그 위에 놓인 캡처 캡에 달라붙게 합니다. 결국, DNA 또는 RNA 분석을 위해 수많은 세포의 윤곽을 잡고 동일한 캡에 캡처할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 레이저 캡처 현미해부를 사용하여 뉴런을 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.