약하게 산란 주제의 디지털 인라인 홀로그램 현미경 (DIHM)

다음 실험의 전반적인 목표는 헤엄치는 박테리아 세포 사슬의 기하학적 위치에서 3D 위치를 재구성하는 것입니다. 이는 먼저 박테리아 세포를 올바른 농도로 성장시켜 이미징에 적합한 샘플을 제공함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, LED 광원을 설정하고 정렬하여 홀로그램 이미지를 얻을 수 있습니다.

다음으로, 재구성 소프트웨어를 사용하여 박테리아 세포 사슬의 3D 좌표를 얻습니다. 그 결과, 홀로그램 이미징을 기반으로 박테리아 세포의 3D 위치와 구성을 재구성할 수 있는 능력을 보여줍니다. 컨포칼 현미경 검사와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 높은 프레임 속도에서 라벨이 없는 체적 이미징이 가능하다는 것입니다.

접종을 시작하려면 연쇄상구균 균주 V 4 0 5 1 1 97의 냉동 재고에서 얼음 결정이 포함된 10ml의 KTY 배지를 섭씨 35도 및 150RPM의 회전식 셰이커에서 하룻밤 동안 배양합니다. 성장하면 10ml의 신선한 KTY 배지에 포화 스타터 배양액에서 500마이크로리터를 접종합니다. 세포가 0.8에서 1.0의 600 나노 미터 파장에서 광학 밀도에 도달 할 때까지 섭씨 35도 및 150RPM에서 3.5 시간 동안 배양합니다.

이는 10의 8번째 셀에 밀리리터당 약 5배를 나타냅니다. 그런 다음 새로운 배지에서 세포를 1에서 400까지 희석하여 밀리리터당 약 100만 개의 세포의 최종 농도를 얻습니다. 다음으로, 주사기에 바셀린을 채우고 현미경 슬라이드에 1mm 높이의 그리스 고리를 만듭니다.

그런 다음 샘플 용액 한 방울을 중앙에 놓습니다. 샘플 위에 커버 유리를 부드럽게 놓고 유리를 가볍게 눌러 가장자리를 밀봉하여 액체가 슬라이드와 커버 유리 모두에 접촉하도록 합니다. 결과 샘플 챔버는 100-200 마이크로 미터 깊이로 끝나야합니다.

60 x 오일 이멀젼 렌즈를 회전시켜 제자리에 놓고 오일 한 방울을 추가합니다. 그런 다음 커버 유리가 아래를 향하도록 하여 샘플 챔버를 현미경 스테이지에 놓습니다. 유리 커버 슬립과 렌즈 사이에 기포가 생기지 않도록 하십시오.

샘플 챔버의 바닥 표면에 초점을 맞춘 다음 응축기의 초점을 맞춥니다. 그런 다음 표준 조명을 끄고 LED 헤드를 현미경의 콘덴서 조리개 뒤에 놓습니다. 콘덴서가 명시야 모드로 설정되어 있는지 확인하고 LED 전원 공급 장치를 최대 출력으로 설정합니다.

그런 다음 콘덴서 조리개를 최대한 닫고 조명이 대물 렌즈 조리개의 중앙에 올 때까지 마운트의 LED를 살짝 밉니다. 컴퓨터를 켠 다음 광 경로를 현미경의 카메라 포트로 리디렉션합니다. 이미지 획득 소프트웨어에서 프레임 속도를 초당 30프레임으로 조정하고 이미지 크기를 5 12 x 5 12 픽셀로 조정합니다.

이미지 강도 히스토그램을 확인하여 이미지의 어떤 부분도 포화되거나 노출이 부족하지 않은지 확인합니다. 프레임 노출 시간은 좋은 대비를 유지하면서 가능한 한 짧아야 합니다. 세포가 계면 가까이에서 모이면 박테리아 세포의 초점이 약간 흐려지도록 현미경의 초점을 다시 맞춥니다.

세포는 최적의 재구성을 위해 초점면에서 약 10-30미크론 떨어져 있어야 합니다. 다시 초점을 맞춘 후 일련의 비디오 프레임을 수집하고 압축되지 않은 VI 파일로 저장합니다. 그런 다음 무료로 다운로드할 수 있는 DIHM 소프트웨어를 실행하여 비디오 프레임을 숫자로 초점이 재조정된 이미지 스택으로 변환합니다.

재구성을 시작하기 위해 소프트웨어와 함께 예제 프레임이 제공됩니다. 관심 프레임과 배경을 별도의 이미지 파일로 상자에 입력합니다. 배경 이미지는 홀로그램이 없을 때 비디오의 배경을 상당히 나타내며 홀로그램 위치 파악 및 분석을 방해할 수 있는 고정 패턴 노이즈를 억제하는 데 사용됩니다.

그런 다음 출력 스택 매개 변수를 전역 설정 상자에 입력합니다. 먼저 시작 초점에서 첫 번째 프레임의 축 위치를 입력합니다. 그런 다음 재구성된 스택의 슬라이스 수를 number of steps에 입력하고, 마지막으로 스택의 각 슬라이스 사이의 실제 거리를 step size에 입력합니다.

예제 데이터를 사용하여 올바른 비율로 객체를 재구성하기 위해 스텝 크기를 측면 픽셀 간격과 동일하게 설정합니다. 이 값은 0.233마이크로미터여야 합니다. 다음으로 카메라의 조명, 파장, 중간 굴절률 및 측면 샘플링 주파수를 입력합니다.

미크론당 픽셀 상자에서 카메라의 측면 샘플링 주파수는 대물 렌즈 배율을 카메라 센서 픽셀 크기로 나누어 찾을 수 있습니다. 예제 데이터를 사용하면 숫자는 60 x 14마이크로미터로 나눈 값은 미크론당 4.29픽셀과 같습니다. 그런 다음 홀로그램에서 개체의 중심이 어두우면 대칭 이동 Z 그라데이션 단추를 누릅니다.

이렇게 하면 원본 샘플에서 초점면 아래의 물체를 추출하는 필터가 적용됩니다. 그런 다음 이미지에 대한 노이즈 픽셀 기여도를 억제하는 역할을 하는 대역 통과 필터를 켭니다. 생성 직후 각 이미지 슬라이스에 적용됩니다.

다음으로, 중간 출력 스위치가 켜진 상태에서 켜져 있는지 확인합니다. 이 스위치가 켜져 있으면 두 개의 비디오가 생성됩니다. 첫 번째 출력은 파일 이름이 stack a V로 끝나는 리포커스 스택입니다. 두 번째 스택은 파일 이름이 gradient a VI로 끝나는 실제 그래디언트 작업입니다. 이상적으로 이 두 번째 스택에는 어두운 배경에 대해 밝은 개체로 강조 표시된 관심 개체가 포함됩니다.

모든 매개변수를 설정한 후 메인 창에서 실행을 눌러 명령을 실행합니다. 선택한 프레임이 소프트웨어의 기본 상자에 나타납니다. 그런 다음 이미지 왼쪽의 도구 모음에 있는 돋보기 도구를 사용하여 확대 및 축소합니다.

사각형 도구를 사용하여 관심 영역 또는 ROI를 선택하고 사각형 내에서 가능한 한 많은 홀로그램 프린지를 캡처하여 재구성을 최적화합니다. 마지막으로 프로세스 버튼을 눌러 두 개의 개별 이미지 스택을 생성합니다. 이 웹 사이트에서 사용할 수 있는 이미지 J를 사용하여 결과 스택을 검사합니다.

관심 개체가 그라디언트 이미지 스택에서 명확하게 보이면 렌더링 섹션으로 진행하여 개체 좌표를 추출합니다. 렌더링을 시작하려면 특징 추출 버튼을 눌러 X, Y, Z 좌표 위치 기능을 활성화합니다. 그런 다음 출력 좌표 파일의 경로와 확장자를 입력하고 출력 좌표 스타일 상자에서 POV 광선 스타일을 선택합니다.

이로 인해 프로그램은이 웹 사이트에서 얻을 수있는 무료 POV 광선 추적 소프트웨어 패키지를 사용하여 시각화 할 수있는 개체 파일을 작성하고 이미지를 다시 처리하여 개체 좌표를 추출합니다. 이 프로그램은 출력 코드 상자의 파일 이름에 기록된 선택한 ROI의 일련의 X, Y, Z 좌표를 제공합니다. 객체 좌표 추출은 스택 생성보다 훨씬 더 오래 걸립니다.

재구성 코드와 함께 제공된 샘플 POV ray 파일이 출력 좌표 File과 동일한 폴더에 있는지 확인합니다. 샘플 점 pov 파일을 편집하고 줄에서 반전된 쉼표로 파일 이름을 바꿉니다. 재건 코드에 의해 생성된 데이터 파일의 이름과 함께 내 파일 NC를 포함합니다.

그런 다음 POV 광선에서 카메라 위치, 조명, 텍스처 및 렌더링 옵션을 사용자 정의합니다. 완료되면 실행 버튼을 클릭하여 비트맵 이미지를 렌더링합니다. 이것은 순간적으로 방향을 잡은 연쇄상구균 박테리아 사슬의 이미지입니다.

초점면으로 끝냅니다. 이 구성의 개체는 재구성하기 어렵고 일반적으로 초점 평면에 가까운 블롭을 생성합니다. 여기에 표시된 것은 체인이 광축을 따라 직접 향하지 않는 이 시리즈의 대부분의 프레임을 대표하는 적절하게 렌더링된 이미지입니다.

물체의 모양과 위치는 오른쪽 패널에서 볼 수 있듯이 렌더링에서 충실하게 재현됩니다. 이 기술을 마스터하면 몇 분 안에 완료할 수 있습니다.