트립신 다이제스트 프로토콜 마우스 모델의 망막 혈관을 분석하는

이 절차의 전반적인 목표는 망막 혈관 네트워크를 분리하는 것입니다. 이것은 먼저 고립된 망막에 일련의 물 세척을 수행하여 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 망막의 크기에 따라 섭씨 37도의 트립신에서 약 1시간에서 1시간 30분 동안 망막을 소화합니다.

다음으로, 혈관 구조는 추가 물 세척 및 현미경 하의 해부를 통해 분리됩니다. 궁극적으로 미세 동맥류, 모세혈관 변성, 비정상적인 내피 세포 대 기생충 비율과 같은 병리학적 혈관 변화를 시각화할 수 있습니다. 따라서 망막 플랫 마운트를 준비하는 것과 같은 기존 방법에 비해 시도 및 소화의 주요 이점은 전체 혈관 네트워크를 매우 명확하게 강조 표시할 수 있다는 것입니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 기술적으로 어렵고 일관되게 수행하기 어렵기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 이 방법의 시각적 시연은 혈관 분리 단계를 단어만으로는 배우기 어렵기 때문에 매우 중요합니다. 이것은 당뇨병성 망막병증과 같은 일부 질병과 같은 망막 혈관 생물학 연구를 수행하는 모든 실험실에서 매우 유용한 도구이며, 이 기술이 제 실험실의 재능 있는 의대생인 Jonathan Chow가 될 것임을 보여줍니다.

적출된 마우스 눈과 10% 중성 완충 포르민을 24시간 동안 고정한 후 페트리 접시에 눈을 넣고 소량의 물로 덮습니다. 절개 가위를 사용하여 각막의 초기 절단을 조심스럽게 만들어 절개를 시작합니다. 그런 다음 곧은 집게로 절단 부위를 잡고 가위를 사용하여 각막과 공막을 제거하는 공막의 경계를 따라 자릅니다.

다음으로 가늘고 구부러진 집게와 직선 집게를 사용합니다. 공막과 맥락막을 망막에서 시신경 쪽으로 천천히 조심스럽게 벗겨냅니다. 그런 다음 수정체와 망막에서 여분의 홍채 및 파편을 제거하여 신경 망막층과 혈관을 분리하는 데 도움이 됩니다.

약 500 마이크로 리터의 45 마이크로 미터 여과 된 물을 24 웰 플레이트에 넣고 망막을 우물에 넣은 다음 실온에서 4-5 시간 동안 부드럽게 흔들어 30-60 분마다 물을 바꿉니다. 다음 날 실온에서 부드러운 흔들기로 밤새 망막을 물로 계속 씻으십시오.다음 날 실온에서 물을 제거하고 3% 트립신에서 현미경으로 우물에 이물질이 없는지 확인합니다. 혈관 구조가 달라붙지 않도록 섭씨 37도에서 1시간에서 1시간 30분 동안 부드럽게 흔들거나 흔들지 않고 조직을 배양하십시오.

조직이 분해의 징후를 보이기 시작하면 플레이트를 현미경 스테이지에 놓고 망막을 피하십시오. 트립신을 조심스럽게 제거하여 혈관 구조를 분리합니다. 먼저 집게를 사용하여 여과된 물을 망막에 추가합니다.

얇고 투명한 층으로 나타나는 내부 제한 멤브레인을 벗겨냅니다. 가벼운 교반으로 접시를 흔듭니다. 5분 후, 플레이트를 현미경 스테이지에 다시 놓고 조심스럽게 물을 교체하여 망막이 손상되지 않도록 하여 부착된 망막 조직에서 혈관 네트워크를 분리하는 데 도움을 줍니다.

마지막 세척 후 물에 잔해물이 거의 또는 전혀 남지 않을 때까지 방금 설명한 대로 망막을 세척합니다. 따라서 일반적으로 모든 비혈관 조직을 제거하는 것이 절차에서 가장 까다로운 부분입니다. 다음 기술은 순차적으로 또는 개별적으로 사용할 수 있습니다.혈관 네트워크의 격리를 용이하게 하기 위해 한 가지 중요한 팁은 망막을 조작하기 전에 모든 도구와 트립신을 담그는 것입니다.

이렇게 하면 조직이 장비에 부착되는 것을 방지할 수 있습니다. 200마이크로리터 마이크로 피펫 팁에 예약된 트립신을 코팅한 다음 물을 위아래로 조심스럽게 피펫으로 부어 망막 혈관 쪽으로 불어 부드럽게 교반합니다. 비혈관 조직이 여전히 내성 중심인 경우 트립신으로 코팅된 마이크로 피펫을 시신경에 대고 전체 혈관 네트워크를 위아래로 조심스럽게 피펫팅하여 비혈관 조직을 분해하는 데 도움을 줍니다.

드디어 괜찮습니다. 겸자를 사용하여 혈관 구조를 물 밖으로 부드럽게 들어 올려 부착된 비혈관 구성 요소를 제거할 수 있습니다. 최종 결과는 온전하고 파편이 없는 망막 혈관 구조 네트워크여야 합니다.

혈관 구조를 시각화하려면 먼저 깨끗한 슬라이드에 물 한 방울을 떨어뜨립니다. 그런 다음 소화된 용기를 내시경 점검 하에 물 속으로 옮깁니다. VA 플랩 마운트를 접거나 펼치면 용기가 접혀 시야가 나빠집니다.

염색되었을 때 조직이 접혀 있는 경우 물을 더 넣고 슬라이드를 부드럽게 흔들어 쉽게 펼칠 수 있습니다. 그런 다음 마이크로 피펫을 사용하여 여분의 물을 천천히 제거합니다. 성공적인 시술의 최종 결과물은 쥐 망막 혈관 구조의 전체 네트워크를 수평으로 장착하고 구조를 유지하고 hemat, toin 및 eoin으로 염색하는 것입니다.

여기에서 볼 수 있듯이, 이 이미지에서 볼 수 있듯이, 망막에서 내피 세포와 주피 세포 사이의 명확한 분화를 관찰할 수 있습니다. 흰색 화살표로 표시된 내피 세포의 핵은 타원형 또는 길쭉하며 완전히 혈관 벽 내에 있습니다. 검은색 화살표로 표시되는 기생충 핵은 작고 구형 염색이 조밀하며 일반적으로 모세혈관 벽을 따라 돌출된 위치를 가지고 있습니다.

트립신과 다이제스트는 당뇨병 동물 모델에서 혈관 병리학을 분석하는 데 사용되는 일반적인 절차입니다. 이 이미지는 제2형 당뇨병 모델인 DB DB 마우스에서 관찰된 흰색 화살표로 표시된 모세혈관 변성의 예를 보여줍니다. 이 절차는 마우스 망막에 최적화되어 있지만 쥐 망막에서도 유사한 결과를 얻을 수 있습니다.

이 이미지에서 볼 수 있듯이 쥐의 망막은 쥐의 망막보다 크며 플레이트가 24개가 아닌 12개가 필요하다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 쥐 망막의 혈관 구조 네트워크는 또한 쥐의 망막보다 덜 약합니다. 비혈관 조직을 가능한 한 많이 제거하는 것이 매우 중요합니다.

잔여물은 비특이적 염색으로 이어지고 혈관 구조를 제대로 시각화하지 못하게 됩니다. 예를 들어, 이 이미지에서는 비혈관 조직 전체의 제거에 실패한 것을 관찰할 수 있습니다. 마찬가지로, 혈관 구조의 시각화를 개선하기 위해 장착할 때 망막을 펼치는 것도 중요합니다.

이 이미지는 혈관 플랫 마운트의 성공적인 풀림을 보여줍니다. 기술적으로 어려운 이 절차를 마스터한 후. 트립 및 다이제스트는 전체 혈관 네트워크를 자세히 시각화할 수 있는 매우 유용한 방법이 될 수 있습니다.

쥐의 눈에서 이 기술을 개선함으로써 연구자들은 유전적으로 조작된 쥐를 활용하여 망막 혈관 구조를 제어하고 다양한 망막 질환의 병태 생리학을 이해할 수 있는 다양한 경로를 연구할 수 있습니다. 그 결과, 당뇨병성 망막병증과 같은 질병 병리학에 대한 이해를 높일 수 있습니다. DVDB 마우스와 같은 마우스 모델을 연구함으로써 궁극적으로 망막 혈관 구조를 표적으로 하는 새로운 잠재적 치료 개입을 찾을 수 있는 기회를 제공할 수 있습니다.