트립신 다이제스트 프로토콜 마우스 모델의 망막 혈관을 분석하는

본 실험 절차의 전반적인 목적은 망막 혈관 네트워크를 분리하는 것입니다. 우선 분리된 망막을 여러 번 물로 세척하여 이를 수행합니다. 두 번째 단계에서는 망막의 크기에 따라 37°C의 trypsin에서 약 1시간에서 1시간 30분 동안 소화시킵니다.

다음으로, 추가적인 수세와 현미경 하의 박리 과정을 통해 혈관계를 분리합니다. 최종적으로 미세동맥류, 모세혈관 퇴행 및 비정상적인 내피세포 대비 기생충 비율과 같은 병리적 혈관 변화를 시각화할 수 있습니다. 따라서 망막 평면 표본(retinal flat mount) 제작과 같은 기존 방법 대비 try and digest 방식의 주요 장점은 전체 혈관 네트워크를 매우 선명하게 확인할 수 있다는 점입니다.

일반적으로 이 방법은 기술적으로 까다롭고 일관되게 수행하기 어렵기 때문에, 처음 접하는 사람들은 어려움을 겪게 됩니다. 혈관 분리 단계는 말로만 배워서는 익히기 어렵기 때문에 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 이는 당뇨망막병증과 같은 일부 질환을 포함하여 망막 혈관 생물학 연구를 수행하는 모든 실험실에서 매우 가치 있는 도구이며, 본 기술의 시연은 저희 실험실의 유능한 의대생인 Jonathan Chow가 진행하겠습니다.

적출한 마우스의 안구를 10% 중성 완충 포르말린으로 24시간 동안 고정한 후, 안구를 페트리 접시에 넣고 소량의 물로 덮어줍니다. 해부 가위를 사용하여 각막에 조심스럽게 초기 절개를 하여 해부를 시작합니다. 그 다음, 직선 핀셋으로 절개 부위를 잡은 상태에서 가위를 이용해 각막과 공막의 경계를 따라 절개하여 각막을 제거합니다.

다음으로, 미세한 곡선형 및 직선형 핀셋을 사용합니다. 공막과 맥락막을 망막에서 천천히 조심스럽게 벗겨내어 시신경 방향으로 이동시킵니다. 그런 다음 신경 망막층을 혈관으로부터 분리하기 위해 수정체와 과잉 홍채 및 망막의 잔해물을 제거합니다.

24-웰 플레이트의 각 웰에 45 µm 필터링된 물을 약 500 µL씩 넣고 망막을 웰에 배치한 다음, 실온에서 4~5시간 동안 부드럽게 흔들어 줍니다. 이때 물은 30~60분마다 교체합니다. 실온에서 부드럽게 흔들어 주며 망막을 밤새 물로 계속 세척합니다. 다음 날, 물을 제거하고 3% trypsin을 첨가한 후, 현미경으로 관찰하여 웰 내에 잔해물이 없는지 확인합니다. 혈관이 부착되는 것을 방지하기 위해, 조직을 37 °C에서 1~1.5시간 동안 부드럽게 흔들거나 흔들지 않은 상태로 배양합니다.

조직이 붕괴되기 시작하면 플레이트를 현미경 스테이지 위에 올린 다음, 망막을 피해 조심스럽게 트립신을 제거하여 혈관계를 분리합니다. 먼저, 핀셋을 사용하여 망막에 여과수를 첨가합니다.

얇고 투명한 층으로 보이는 내경계막을 벗겨냅니다. 플레이트를 가볍게 흔들어 줍니다. 5분 후, 플레이트를 다시 현미경 스테이지 위에 놓고, 망막 조직에 부착된 혈관 네트워크를 분리하는 데 도움이 되도록 망막에 손상을 주지 않으면서 주의 깊게 물을 교체합니다.

마지막 세척 후 물에 잔해물이 거의 또는 전혀 남아 있지 않을 때까지 시연한 대로 망막을 세척합니다. 일반적으로 혈관이 없는 조직을 모두 제거하는 것이 이 절차에서 가장 까다로운 부분입니다. 혈관 네트워크의 분리를 용이하게 하기 위해, 망막을 조작하기 전 모든 도구와 trypsin을 담가두는 것이 중요한 팁이며, 다음의 기술들을 순차적으로 또는 개별적으로 사용할 수 있습니다.

이렇게 하면 조직이 장비에 부착되는 것을 방지하는 데 도움이 됩니다. 200 µL 마이크로 피펫 팁에 준비된 trypsin을 코팅한 후, 망막 혈관 옆에서 혈관 방향으로 물을 조심스럽게 위아래로 피펫팅하여 가볍게 흔들어 줍니다. 비혈관성 조직이 여전히 중앙에 남아 있다면, 시신경 부위에 trypsin이 코팅된 마이크로 피펫 팁을 대고 전체 혈관 네트워크를 조심스럽게 위아래로 피펫팅하여 비혈관성 조직의 분해를 돕습니다.

마지막으로, 미세 핀셋을 사용하여 혈관계를 물 밖으로 부드럽게 들어 올려 부착된 비혈관 성분들을 제거할 수 있습니다. 최종 결과물은 파편이 없는 온전한 망막 혈관 네트워크여야 합니다.

혈관 구조를 시각화하려면, 먼저 깨끗한 슬라이드 위에 물 한 방울을 떨어뜨립니다. 그런 다음 현미경으로 확인하면서 소화된 혈관을 물 속으로 옮깁니다. VA 플랩 마운트(flap mount)가 접혀 있거나 펴져 있을 수 있는데, 혈관이 접혀 있으면 시인성이 떨어집니다.

염색 시 조직이 접혀 있다면, 물을 추가로 넣고 슬라이드를 부드럽게 흔들어 펼쳐지도록 유도하십시오. 그런 다음 마이크로 파이펫을 사용하여 여분의 물을 천천히 제거합니다. 절차가 성공적으로 완료되면 마우스 망막 혈관 네트워크 전체가 평평하게 고정되며, 구조가 유지된 상태로 hematoxylin과 eosin으로 염색된 결과물을 얻을 수 있습니다.

여기에 표시된 이미지에서 볼 수 있듯이, 망막 내에서 혈관내피세포와 혈관주위세포 간의 명확한 구분이 관찰됩니다. 흰색 화살표로 표시된 혈관내피세포의 핵은 타원형 또는 길쭉한 형태이며 혈관벽 내에 완전히 위치합니다. 검은색 화살표로 표시된 기생충 핵은 크기가 작고 구형이며 진하게 염색되고, 일반적으로 모세혈관벽을 따라 돌출된 위치에 있습니다.

트립신 소화(Trypsin and digest)는 당뇨병 동물 모델에서 혈관 병리를 분석하는 데 사용되는 일반적인 절차입니다. 이 이미지는 제2형 당뇨병 모델인 DB DB 마우스에서 관찰된 모세혈관 퇴행의 예시를 흰색 화살표로 나타내고 있습니다. 이 절차는 마우스 망막에 최적화되었으나, 랫드 망막에서도 유사한 결과를 얻을 수 있습니다.

이 이미지들에서 볼 수 있듯이 쥐(rat)의 망막은 생쥐(mouse)의 망막보다 크기 때문에 24웰 플레이트가 아닌 12웰 플레이트가 필요하다는 점에 유의하십시오. 또한 쥐 망막의 혈관망은 생쥐의 혈관망보다 덜 취약합니다. 비혈관성 조직을 최대한 많이 제거하는 것이 매우 중요합니다.

잔여물이 남으면 비특이적 염색이 일어나 혈관의 시각화가 제대로 이루어지지 않습니다. 예를 들어, 이 이미지에서는 비혈관 조직이 완전히 제거되지 않은 실패 사례를 확인할 수 있습니다. 마찬가지로, 혈관의 시각화를 개선하기 위해서는 마운팅 시 망막이 펴져 있도록 하는 것이 중요합니다.

이 이미지는 혈관 평면 표본 제작(vascular flat mount) 과정에서 펼치기에 실패한 사례를 보여줍니다. 이 기술적으로 까다로운 절차를 숙달하면, 절단 및 소화법(Trips and digests)은 전체 혈관 네트워크를 상세하게 시각화할 수 있는 매우 가치 있는 방법이 될 수 있습니다.

마우스 안구에서 이 기술을 개선함으로써, 연구자들은 유전자 조작 마우스를 활용하여 망막 혈관계를 조절하는 다양한 경로를 연구하고, 다양한 망막 질환의 병태생리를 이해할 수 있습니다. 이를 통해 당뇨망막병증과 같은 질병의 병리를 더 깊이 이해할 수 있습니다. DVDB 마우스와 같은 마우스 모델을 연구함으로써, 궁극적으로 망막 혈관계를 표적으로 하는 새로운 잠재적 치료적 개입 방법을 찾을 수 있는 기회를 얻게 됩니다.