인간의 장내 상피 세포와 BALB / C 마우스 대 식세포를 사용하여 웬만한 지방산과 콜레라 독소 농도의 결정

이 실험 절차의 전반적인 목적은 세포 생존에 부정적인 영향을 주지 않는 허용 가능한 지방산 및 콜레라 독소 농도를 결정하는 것입니다. 이는 먼저 적절한 유형의 세포를 배양함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 배양된 세포를 테스트할 세 가지 지방산 또는 콜레라 독소의 다양한 농도와 함께 인큐베이션하는 것입니다.

24시간 후, MTT 분석을 통해 세포 생존율을 평가합니다. 최종적으로, MTT 분석의 분광 광도계 데이터는 생존율의 유의미한 감소 없이 세포를 처리할 수 있는 지방산과 콜레라 독신의 최적 농도를 보여줍니다. 백신 접종이 항상 성공적인 것은 아니기 때문에, 이 기술의 함의는 콜레라 감염 예방으로 확장됩니다.

Bowel C 마우스의 Mus musculus 대식세포를 모든 co toxin 측정에 사용하며, 더 큰 규모의 지방산 농도 측정에는 다음 두 가지 배지 중 하나에서 증식시킨 세포를 사용한다: 10% fetal bovine serum과 1% antibiotic antimycotic가 첨가된 L glutamine 함유 DMEM, 또는 10% fetal bovine serum, 5% L-glutamine, 1% antibiotic antimycotic가 첨가된 RPMI 1640 기본 배지이다. 본 프로토콜을 위해, bowel C 세포를 통기성 캡이 있는 75 cm² Corning 플라스크에서 37 °C, 95% 공기 및 5% carbon dioxide 조건으로 배양한다. 미세 규모의 지방산 농도 측정에는 10% FBS와 30 ng/mL가 첨가된 hypercare 배지를 사용하여 통기성 캡이 있는 75 cm² Corning 플라스크에서 증식시킨 인간 장 상피 세포를 사용한다.

제조사의 지침에 따라 항생제 및 항진균제 시약을 사용하지 않고 Human EGF를 37°C, 95% 공기 및 5% 이산화탄소 조건에서 배양합니다. 세포 종류에 따라 약 70% 합류도(confluency)에서 모든 세포를 1:3 비율로 계대 배양하며, 일반적으로 지방산 처리 전 2~5일마다 계대 배양을 수행합니다. 먼저 지방산을 준비합니다. 회사에서 제공한 유리 앰플에서 올레산(oleic acid), 리놀레산(linoleic acid) 및 리놀렌산(linolenic acid)을 멸균된 유리 바이알로 옮깁니다. 그다음, 각 지방산을 별도의 멸균된 에펜도르프 튜브(eppendorf tube)로 옮깁니다.

각 지방산을 100% Ethanol에 1:6 비율로 희석하여 용해한 후, RPMI 1640 불완전 배지를 추가하여 최종 농도가 10 µg/µL가 되도록 합니다. 각 용액을 볼텍싱한 다음 유리 바이알에 옮겨 -20 °C 냉동 보관 플레이트에 저장합니다.

96웰 조직 배양 플레이트의 웰당 2,500개의 인간 장 상피 세포를 분주하고, 각 웰의 총 부피가 200 µL가 되도록 적절한 완전 배지를 추가합니다. 세포를 37 °C, 95% 공기 및 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양합니다.

24시간의 증식 기간이 지난 후, 배지를 제거합니다. 양성 대조군으로서 테스트할 각 지방산을 적절한 농도로 웰에 첨가합니다. 음성 대조군으로는 완전 배지를 사용하여 세포를 배양하고, 70% ethanol을 사용하여 세포를 배양합니다.

그 후, 각 웰의 총 부피가 200 microliters가 되도록 완전 배지를 추가합니다. 세포 처리를 위한 콜레라 독소를 준비하기 위해, 콜레라 독소를 PBS에 1 mg/mL 농도로 녹입니다. MTT 분석을 시작하기 전, 처리된 플레이트를 24시간 동안 배양합니다.

용액을 크라이오 바이알에 분주하고 세포 처리 전까지 2~8°C에서 보관하십시오. 멸균된 PBS 또는 incomplete DMEM을 사용하여 독소를 1:100으로 희석하여 최종 작동 농도를 1 ng/µL plate로 맞춥니다. 96-웰 플레이트의 웰당 2,500개의 대식세포를 분주합니다.

웰 조직 배양 플레이트를 37 °C, 95% 공기 및 5% 이산화탄소 조건에서 24시간 동안 배양합니다. 24시간의 증식 기간이 지난 후, 배지를 제거하고 웰에 적절한 테스트 농도의 콜레라 독소를 첨가합니다. 지방산 처리와 마찬가지로, 모든 시료 및 처리군에 대해 완전 배지를 양성 대조군으로, 70% 에탄올을 음성 대조군으로 하여 세포를 배양합니다.

최소 3회 이상의 반복 실험을 수행하며, 양성 대조군의 경우 더 많은 횟수로 반복하십시오. 각 웰의 총 부피가 200 microliters가 되도록 완전 배지를 추가합니다. MTT assay를 시작하기 전, 콜레라 독신을 처리한 플레이트를 24시간 동안 배양하십시오.

세포를 지방산 또는 대조군으로 처리한 24시간 후, MTT 분석법으로 세포 생존율을 측정합니다. 테스트할 96웰 플레이트의 각 웰에서 용액을 제거하고, 200 µL의 신선한 완전 배지 용액으로 교체합니다.

갓 제조한 2.5 mg/mL MTT 용액 10 µL를 각 웰에 첨가합니다. 플레이트를 37 °C에서 3~4시간 동안 배양합니다. 3~4시간 후, 배양액을 제거하고 각 웰에 0.04 M 이소프로판올 염산 용액 100 µL를 첨가합니다.

플레이트를 실온에서 5분 동안 배양합니다. 다음으로, 각 웰의 용액을 원심분리관으로 옮겨 20,000 ×g에서 1분 동안 또는 펠렛이 형성될 때까지 원심분리합니다. 각 샘플을 20에서 40 µL씩 마이크로플레이트 리더로 옮긴 후, 분광광도계를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 측정합니다.

이 그림은 올레산(oleic acid), 리놀레산(linoleic acid) 및 리놀레산(linoleic acids)의 농도를 증가시키며 처리했을 때, 양성 대조군에 따른 대부분의 대식세포 생존율을 나타냅니다. 모든 지방산에 대해 100 nanograms per microliter 이상의 농도에서는 세포가 견디지 못함이 분명하게 나타납니다. 이 실험은 인간 상피세포를 사용하여, 100 nanograms per microliter보다 낮은 농도 범위에서 10 nanogram per microliter 간격으로 70 nanograms per microliter까지 반복 수행되었습니다.

이 그래프는 올레산의 각 농도에 따른 세포 생존율을 보여줍니다. 일원 분산 분석(One-way ANOVA) 결과, 하나 이상의 평균값이 통계적으로 유의미한 차이를 보이는 것으로 나타났습니다. 하지만 양성 대조군과 통계적으로 유의미한 평균값 차이를 보인 것은 고농도 처리군뿐이었습니다.

흥미롭게도, 관찰된 차이는 더 많은 변동성을 동반한 세포 생존율의 증가로 인해 발생했습니다. 리놀레산과 리놀레산에 대해서도 유사한 결과가 얻어졌습니다. 한 가지 방법은 다음과 같습니다.

Inova 분석 결과, 처리군 평균 중 어느 것도 양성 대조군의 평균과 통계적으로 유의미한 차이를 보이지 않았으나, 리놀레산 60 ng/µL와 같은 일부 고농도에서는 변동성이 증가하는 것으로 나타났습니다. 인간 장 상피 세포를 사용할 때 최적의 지방산 농도는 1~5 ng/µL 사이인 것으로 보입니다. 대부분의 대식세포 생존에 미치는 다양한 콜레라 독소 농도의 영향 또한 상대적으로 큰 증분으로 독소 수준을 설정하여 테스트하였습니다.

각 처리군에 따라 세포 생존율의 변동이 매우 컸기 때문에, 예상대로 세포 생존율이 감소하는 경향이 관찰되었습니다. 생존율의 큰 변동성으로 인해 양성 대조군의 평균과 모든 처리군 사이에 유의미한 차이가 나타나지 않았으며, 이에 따라 100 nanograms 이하의 독소 수준에 대한 추가 테스트를 진행하였습니다. 이 그래프는 더 낮은 독소 수준 처리군에 대한 세포 생존율을 보여줍니다.

거의 모든 독소 농도에서 세포 생존율의 변동성이 매우 높게 나타났으며, 처리에 따른 생존율의 약간의 증가가 관찰되었습니다. 이러한 증가는 양성 대조군의 평균과 비교했을 때 어떤 처리군에서도 통계적으로 유의미하지 않았습니다. 이러한 결과를 바탕으로.

Bowel C 마우스 대식세포를 배양한 후 사용할 때, 권장되는 콜레라 독소 농도는 처리당 30 nanograms 미만입니다. 이 기술은 콜레라 연구 분야의 연구자들이 지방산이 콜레라 감염에 대한 면역력을 강화할 수 있는지 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.