노화 암 세포를 정량화하는 민감한 방법

본 절차의 전반적인 목표는 세포 노화를 빠르고 민감하게 정량화하는 것입니다. 여기에서 우리는 잠재적인 화학요법 약물을 스크리닝하는 데 있어 이 방법의 유용성을 입증합니다. 먼저 세포 노화를 유도합니다.

항암제 doxorubicin을 암세포에 첨가합니다. 다음으로 세포 리소좀의 산성 pH를 중화시키기 위해 Bain A one을 처리합니다. 그 후, 세포 내로 흡수될 수 있는 세포 투과성 beta galacto 기질 C 12 FDG를 첨가합니다.

C 12 FDG가 가수분해되어 형광을 발합니다. beta GCSE는 노화 세포의 리소좀에 풍부하기 때문에, 노화 세포는 비노화 세포보다 더 강한 형광을 띠게 됩니다. 형광의 차이를 정량화하기 위해 세포를 유세포 분석기(flow Cytometer)로 분석하며, 결과 데이터 분석을 통해 서로 다른 처리 조건에 따른 노화 암세포의 백분율을 정량화할 수 있습니다.

beta-갈락토시다아제(beta galactose) 분석법과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 노화 세포를 신속하고 민감하게 정량화할 수 있다는 점입니다. 실제로, 일반적으로 사용되는 beta-갈락토시다아제 분석법을 이용해 노화 세포를 정량화하는 과정에서 어려움을 겪으면서 이 방법의 아이디어를 처음 얻게 되었습니다. 본 연구에서는 암세포의 노화를 검출하기 위해 이 기술을 사용하였으나, 정상 세포에도 동일하게 적용할 수 있습니다.

이 방법은 화학요법 약물이 암세포의 sse를 유도하여 악성도를 촉진했는지 여부와 같이 암 분야의 즉각적인 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 따라서 이 기술은 궁극적으로 암에 대한 새로운 치료법을 알리는 데 도움이 될 수 있습니다. 화학 흄 후드 내에서 C 12 FDG 분말을 DMSO에 녹여 최종 농도를 20 millimolar로 조절한 후, 0.5 milliliter einor 튜브에 소분하여 minus 80 degrees Celsius에서 보관하십시오.

DMSO는 적절한 안전 조건 하에서 사용해야 하며, CIN A 파우더를 DMSO에 녹여 최종 농도가 0.1 mM이 되도록 조제하십시오. 조제한 용액을 0.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 분주하여 -20 °C에서 보관하십시오.

참고로, CIN은 적절한 안전 예방 조치와 함께 사용해야 합니다. 이 절차는 부착성 세포 또는 비부착성 세포 모두를 사용하여 수행할 수 있습니다. 여기서는 인간 골수종 세포주 RPMI 8 2 2 6을 사용하여 절차를 시연합니다.

이 세포들은 부유 상태로 성장하므로, 실험 수행 24시간 전에 10% FBS와 1% 항생제가 포함된 배지에서 37 °C, 5% carbon dioxide 조건으로 RPMI 8 2 2 6 세포를 배양하십시오. 세포가 세포 증식 곡선의 로그 단계에 도달하도록 6-well plate에 세포를 분주합니다. 노화 세포의 비율을 결정하는 실험 시점에는 처리하지 않고 ST 염색을 하지 않은 세포, C 12 FDG로 염색한 미처리 세포, C 12 FTG로 염색한 처리 세포의 세 가지 세포 샘플이 필요합니다.

각 조건당 암세포의 유동 세포 분석 기반 노화 유도를 위해 최소 5 × 10⁵개의 세포가 필요합니다. 화학요법 약물인 doxorubicin을 첨가할 때, 약물 농도와 처리 시간은 세포 유형에 맞게 조정해야 합니다. 본 실험은 rpmi 8 2 2 6 세포를 대상으로 테스트되었습니다.

mL당 6개의 세포 중 10번째 세포를 15 nanomolar doxorubicin으로 48시간 동안 처리하여 노화를 유도할 수 있습니다. 37 °C 및 5% CO2 조건에서 배양하는 음성 대조군으로 처리하지 않은 샘플을 포함하는 것을 잊지 마십시오. 화학요법제 처리는 세포 apoptosis를 유발할 수 있습니다.

따라서 2일 후, 혈구계수기(hemocytometer)와 현미경을 사용하여 트라이판 블루(trypan blue) 배제법으로 세포 생존율을 확인합니다. 생존율이 70% 미만인 경우, 사멸 세포가 후속 분석에 영향을 주지 않도록 Milton E의 dead cell removal kit와 같은 적절한 키트를 사용하여 사멸 세포를 제거합니다. 그렇지 않은 경우, 세포를 300 g에서 5분 동안 원심분리하여 배양액을 제거합니다.

그 후 상층액을 제거하고, 리소좀의 산성 pH를 중화하기 위해 100 nM cin, A one이 포함된 신선한 배양액을 예열하여 첨가한 뒤 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 1시간 동안 배양합니다. 베타 갈락토시idase 기질인 C 12 FDG를 예열된 신선한 배양액에 녹여 최종 농도가 2 mM이 되도록 합니다. beil mycin으로 배양한 후에 진행합니다.

C 12 FDG를 세포와 배지에 직접 첨가하여 최종 농도가 33 µM이 되게 한 후, 37 °C, 5% CO2 조건에서 2시간 동안 배양하십시오. 배양이 끝나면 세포를 4 °C에서 300 ×g로 5분 동안 원심분리하십시오.

원심분리 후, PBS로 세포를 두 번 세척하며, 이전과 동일하게 매회 원심분리하고 두 번째 세척 후 상층액을 제거합니다. 세포 펠렛을 500 µL의 차가운 PBS에 재현탁한 다음, 노화 세포 집단을 추가로 특성 분석하기 위해 공동 면역 표지(co immuno labeling)를 수행합니다. 유세포 분석 경험이 없다면, 이 절차에서 가장 어려운 부분은 유세포 분석을 수행하는 단계가 될 것입니다.

성공적인 실험을 위해 적절한 대조군을 반드시 포함하고, 필요한 경우 숙련자의 도움을 받으십시오. 첫 번째 시료를 분석하기 전, 전방 산란 채널(FSC) 대 측방 산란 채널(SSC)을 표시하는 2-파라미터 그래프를 준비하십시오. 그 다음, 표지되지 않은 세포가 포함된 첫 번째 시료를 분석하십시오.

광전자 증배관(PMT)을 설정하고, 시료 준비 게이트 동안 나타났을 수 있는 사멸 세포와 세포 파편을 제외한 관심 영역(ROI)을 정의합니다. 이 관심 영역은 x축의 로그 스케일에 C 12 FDG의 형광을 FL 1로 표시하고 y축에 이벤트 수를 표시하는 단일 파라미터 히스토그램으로 나타납니다. 전체 이벤트 수는 분석된 세포의 수를 나타냅니다.

미표지 세포가 x축 로그 스케일의 첫 번째 decade에 나타나도록 PMT를 설정하십시오. 필요한 경우, 미표지 세포를 유세포 분석기로 분석하여 세포의 자가형광을 결정하십시오. FL1을 표시하는 단일 파라미터 히스토그램에서 처리되지 않은 세포가 포함된 두 번째 샘플을 분석하고, 희미하게 표지된 세포 집단 뒤에 커서를 놓으십시오.

이 임계값은 약하게 표지된 비노화 세포와 강하게 표지된 노화 세포를 구분할 수 있게 합니다. 처리된 세포가 포함된 세 번째 샘플을 분석하십시오. 강하게 표지된 노화 세포는 이전 단계에서 결정한 임계값보다 높게 나타납니다.

필요한 경우, 전체 이벤트 수 대비 밝은 이벤트 수의 비율을 계산하여 노화 세포의 백분율을 평가하십시오. 화학요법 절차에 의해 유도된 노화를 평가하기 위해 평균 형광 강도를 이용하여 beta galactosidase의 활성을 추정할 수도 있습니다. 상용화된 다발성 골수종 세포주 R RRP I 8 2 2 6에 화학요법 약물인 doxorubicin을 이틀 동안 처리한 후, 이 비디오에서 설명한 대로 노화 분석을 수행하였습니다. 이 히스토그램은 왼쪽의 미처리 세포와 오른쪽의 처리된 세포의 형광을 보여줍니다.

노화 세포를 나타내는 밝게 라벨링된 세포 집단이 V 영역에 나타납니다. 이와 병행하여, 동일한 세포 샘플을 beta galactosidase 분석법을 사용하여 염색하였습니다. 이 대표 사진에서는 완전히 파란색인 세포와 부분적으로 파란색인 세포가 나타나 있어, 진정으로 파란색인 노화 세포를 구별하는 것의 어려움을 보여줍니다. 노화 세포 백분율 결정에 있어 C 12 FDG의 특이성을 설명하기 위해, 세포에 다양한 농도의 doxorubicin을 처리하였습니다.

노화 세포의 백분율은 밝은 이벤트 수를 전체 이벤트 수로 나누어 결정했습니다. doxorubicin의 농도가 5, 25, 50 nanomolar일 때 노화 세포의 백분율은 각각 0.8%, 15.78%, 26.31%였습니다. 이는 C 12 FTG 라벨링이 노화 세포에 특이적임을 입증합니다.

이 영상을 시청한 후, 여러분은 면역 라벨링과 같은 방법론적 절차를 통해 노화 세포를 특성화하고, 유세포 분석법으로 노화 세포의 양을 정량화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. DMSO나 암세포를 다루는 작업은 매우 위험할 수 있다는 점을 잊지 마십시오. 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 주의를 기울여야 합니다.