노화 암 세포를 정량화하는 민감한 방법
2013년 8월 2일
노화가 방지하거나 종양 논란이 계속 추진할지 여부를 지정합니다. chemotherapeutical 마약 senesce하는 암 세포를 유도 할 수 있기 때문에, 노화를 연구하는 새로운 치료법을 제안 필수적이다. 그러나, 표준 및 널리 사용되는 β-갈 락토시다 분석은 주요 단점을 제공합니다. 우리는 여기에서 노화를 정량화 할 수있는 신속하고 민감한 유동 세포 계측법 기반 분석을 제안한다.
이 절차의 전반적인 목표는 빠르고 민감한 방식으로 세포 노화를 정량화하는 것입니다. 여기에서는 잠재적인 화학요법 약물을 스크리닝하는 데 이 방법의 유용성을 보여줍니다. 최초로 세포 노화를 유도합니다.
화학요법제인 독소루비신(doxorubicin)을 암세포에 첨가합니다. 다음으로, Bain A는 세포 리소좀의 산성 pH를 중화하기 위해 적용됩니다. 그런 다음 세포 흡수 시 세포 투과 베타 갈락토 기질 C 12 FDG가 추가됩니다.
C 12 FDG는 가수분해되고 형광을 발합니다. 베타 GCSE는 노화 세포의 리소좀(lysosome)이 풍부하기 때문에 비노화 세포보다 더 형광성이 됩니다. 형광의 차이를 정량화하기 위해 세포는 유세포 분석기에서 실행되며, 결과 데이터를 분석하여 다양한 치료 조건에서 노화 암 세포의 비율을 정량화할 수 있습니다.
베타 갈락토스와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 노화 세포의 빠르고 민감한 정량화를 용이하게 한다는 것입니다. 사실, 우리는 일반적으로 사용되는 베타 갈락토스 분석(beta galactose asay)을 사용하여 노화 세포를 정량화하는 데 어려움을 겪을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 추가합니다. 우리는 이 기술을 사용하여 암세포의 노화를 감지하지만 정상 세포에도 사용할 수 있습니다.
이 방법은 화학 요법 약물이 암세포를 악성 종양을 촉진할 수 있는지 여부와 같은 암 분야의 간단한 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 따라서 이 기술은 궁극적으로 암에 대한 새로운 치료법을 알리는 데 도움이 될 수 있습니다. 화학 흄 후드에서 작업하여 C 12 FDG 분말을 DMSO의 최종 농도 20 밀리 몰 분취액으로 0.5 밀리리터 에이너 튜브에 용해시키고 섭씨 영하 80도에서 보관했습니다.
DMSO는 적절한 안전 조건에서 사용해야 하며 용해도 해야 합니다. CIN : DMSO의 1 분말, 최종 농도 0.1. Millimolar Eloqua 용액을 0.5 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브에 넣고 섭씨 영하 20도에서 보관합니다.
CIN은 적절한 안전 예방 조치와 함께 사용해야 합니다. 이 절차는 부착 세포 또는 비부착 세포를 사용하여 수행할 수 있습니다. 여기에서는 인간 골수종 세포주 RPMI 8 2 2 6을 사용하여 절차를 시연합니다.
이 세포는 현탁액에서 성장하고, 실험을 수행하기 24시간 전에 섭씨 37도에서 10% FBS와 1% 항생제와 5% 이산화탄소를 포함하는 배지에서 RPMI 8, 2, 2, 6 세포를 배양하고, 세포를 6개의 웰 플레이트에 파종하여 세포 증식 곡선의 로그 단계에 있도록 합니다. 노화 세포의 비율을 결정하기 위한 실험 시 3개의 세포 샘플이 필요합니다. 처리되지 않은 세포와 ST가 아닌 염색된 세포, C12 FDG로 염색된 치료되지 않은 세포, C12 FTG로 염색된 처리된 세포.
각 조건에 대해 최소 5 곱하기 10에서 5 번째 세포가 암세포의 유세포 분석 유도 노화를 위해 필요합니다. 화학요법제인 독소루비신을 첨가하여 약물 농도와 치료 기간을 세포 유형에 맞게 조정해야 합니다. rpmi 8 2 2 6 셀에 대해 테스트했습니다.
노화는 밀리리터당 6개 세포 중 10분의 1을 15나노몰 독소루비신으로 48시간 동안 처리함으로써 유도될 수 있습니다. 처리되지 않은 샘플을 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 음성 대조군 배양물로 포함하는 것을 잊지 마십시오. 화학요법제의 치료는 세포사멸로 이어질 수 있습니다.
따라서 2일 후 혈류, 세포분석기 및 현미경을 사용하여 trian blue exclusion으로 세포 생존력을 확인합니다. 생존율의 비율이 70% 미만인 경우, Milton E의 사세포 제거 키트와 같은 적절한 키트를 사용하여 사세포를 제거하여 사세포가 후속 분석에서 편향되지 않도록 합니다. 그렇지 않으면 300GS에서 5분 동안 세포를 회전시켜 배양 배지를 제거합니다.
그런 다음 100 anom 또는 cin을 함유 한 Prewarm fresh culture medium에서 상등액을 제거한 후, lysosomes의 산성 pH를 중화시키는 것은 섭씨 37 °C에서 1 시간 동안 배양하고 5 % 이산화탄소는 전쟁 전 신선한 배양에서 기질 C 12 FDG인 beta galacto를 용해시킵니다. 중간 내지 최종 농도는 2 밀리몰입니다. beil mycin으로 배양 후.
C 12 FDG를 세포에 직접 첨가하고 배지를 최종 농도 33까지 첨가합니다. 마이크로몰은 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 2시간 동안 배양합니다. 배양 후 세포를 섭씨 4도에서 5분 동안 300Gs로 원심분리합니다.
탈수 후 이전과 같이 PBS가 회전하면서 세포를 두 번 세척하고 두 번째 세척 후 상층액을 제거합니다. Resus는 세포 펠릿을 500마이크로리터의 저온 PBS에 현탁시킨 다음 co immuno 라벨링을 수행하여 노화 세포 집단을 추가로 특성화합니다. 유세포 분석에 대한 경험이 없는 경우 이 절차에서 가장 어려운 부분은 유세포 분석을 수행하는 것입니다.
성공을 보장하려면 적절한 제어 기능을 포함하고 필요에 따라 경험이 없는 사람의 도움을 받아야 합니다. 첫 번째 샘플을 실행하기 전에 전방 산란 채널 또는 FSC 대 측면 산란 채널 SSC를 표시하는 두 개의 매개변수 그래픽을 준비합니다. 그런 다음 레이블이 지정되지 않은 세포가 포함된 첫 번째 샘플을 실행합니다.
광전자 증배관 또는 PMT를 설정하고 시료 전처리 게이트 중에 나타날 수 있는 사체 세포 및 세포 파편을 제외한 관심 영역을 정의합니다. 이 관심 영역은 C, 12, FDG의 형광을 x축의 로그 스케일에서 FL 1로 표시하는 단일 매개변수 히스토그램과 Y축의 이벤트 수를 표시합니다. 총 이벤트 수는 분석된 셀의 수를 나타냅니다.
레이블이 지정되지 않은 셀이 x축의 로그 눈금에서 처음 10단위에 나타나도록 PMT를 설정합니다. 필요한 경우 흐름에서 라벨링되지 않은 세포를 실행하여 세포의 자가형광을 결정합니다. Cytometer는 FL을 표시하는 하나의 매개변수 히스토그램에서 처리되지 않은 세포가 포함된 두 번째 샘플을 실행하고 희미하게 레이블이 지정된 모집단 뒤에 커서를 놓습니다.
이 임계값은 희미하게 표지된 비노화 세포와 밝게 표지된 노화성 세포 사이의 구별을 허용합니다. 처리된 세포가 포함된 세 번째 샘플을 실행합니다. 밝게 라벨링된 노화 세포는 이전 단계에서 결정된 임계값 이상으로 나타납니다.
노화 세포의 백분율을 필요한 경우 밝은 사건의 수를 총 사건 수로 나누어 평가합니다. 베타 갈락토 타제(beta galacto tase)의 활성은 또한 화학요법 시술에 의해 유도된 노화를 평가하기 위해 평균 형광 강도를 사용하여 추정할 수 있습니다. 시판되는 다발성 골수종 세포주 R RRP I 8 2 2 6을 화학요법제인 독소루비신으로 2일 동안 처리하고 이 비디오에 설명된 대로 노화를 위한 분석법을 사용했으며, 이 히스토그램은 왼쪽에는 처리되지 않은 세포의 형광을, 오른쪽에는 처리된 세포의 형광을 보여줍니다.
노화 세포를 나타내는 밝게 표지된 세포 집단이 평행 V.In 영역에 나타나며, 동일한 세포 샘플이 베타 갈락토 SASE 분석을 사용하여 염색되었습니다. 이 대표적인 그림에서 완전히 푸른 세포와 부분적으로 푸른 세포는 진정한 푸른 노화 세포를 구별하는 데 어려움을 보여줍니다. 노화 세포의 비율 결정에서 C 12 FDG의 특이성을 설명하기 위해, 세포는 또한 다양한 농도의 독소루비신으로 처리되었습니다.
노화 세포의 비율은 밝은 사건의 수를 나누어 결정되었습니다. 총 이벤트 수당 노화 세포의 비율은 각각 5, 25 및 50 나노몰 독소루비신의 용량에 대해 0.8%15.78% 및 26.31%였습니다. 이는 C 12 FTG 라벨링이 노화 세포에 특이적임을 보여줍니다.
이 동영상을 시청한 후에는 노화 세포를 특성화하기 위해 면역 라벨링과 같은 방법을 수행하는 이 절차에 따라 유세포 분석을 통해 노화 세포를 시리즈화하거나 정렬하지 않을 수 있는 정량화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. DMSO 또는 암세포를 다루는 작업은 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 이 절차를 수행하는 동안 항상 예방 조치를 취해야 합니다.
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개요
이 연구는 세포 노화를 정량화하기 위한 신속하고 민감한 유세포 분석법을 제시하며, 표준 β-갈락토시다제 분석법의 한계를 해결합니다. 이 방법은 암세포에서 노화를 유도하기 위해 화학 요법 약물인 독소루비신을 사용하여 시연됩니다.
주요 연구 요소
과학 분야
- 세포 생물학
- 암 연구
- 약리학
배경
- 종양 형성에서 노화의 역할은 논란의 여지가 있습니다.
- 화학 요법 약물은 암세포에서 노화를 유도할 수 있습니다.
- 현재 노화를 측정하는 분석법에는 중요한 단점이 있습니다.
- 유세포 분석은 보다 정확한 정량화를 위한 잠재적 솔루션을 제공합니다.
연구 목적
- 세포 노화를 정량화하기 위한 새로운 분석법을 개발합니다.
- 화학 요법 약물이 노화를 유도하는 효과를 평가합니다.
- 기존 방법보다 더 민감하고 신속한 대체 방법을 제공합니다.
사용된 방법
- 독소루비신을 사용한 세포 노화의 유도.
- Bain A를 사용한 세포 리소좀의 산성 pH 중화.
- 세포 섭취 측정을 위한 베타 갈락토 기질 C 12 FDG의 사용.
- 노화를 정량화하기 위한 유세포 분석.
주요 결과
- 새로운 분석법은 암세포에서 노화를 효과적으로 정량화합니다.
- 독소루비신은 연구에서 입증된 바와 같이 노화를 성공적으로 유도합니다.
- 유세포 분석은 전통적인 방법에 비해 신속하고 민감한 결과를 제공합니다.
- 이 방법은 다른 잠재적인 화학 요법 제제를 스크리닝하는 데 적용할 수 있습니다.
결론
- 유세포 분석법은 노화를 연구하기 위한 유망한 도구입니다.
- 이 방법은 새로운 암 치료법의 개발을 강화할 수 있습니다.
- 다양한 상황에서의 응용을 탐구하기 위해 추가 연구가 필요합니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Quantifying senescent cancer cells is critical for evaluating chemotherapeutic efficacy and understanding treatment-induced phenotypic shifts that may influence tumor progression or therapeutic resistance. This flow cytometry-based method provides a rapid, sensitive readout to support target validation and mechanistic de-risking in oncology drug discovery. By enabling high-throughput assessment of senescence induction, it informs go/no-go decisions and portfolio prioritization in preclinical development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying senescence as a functional readout of chemotherapeutic mechanism of action.
- Operational Value: Enables rapid screening of compound libraries to identify senescence-inducing agents with improved predictive confidence.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by distinguishing senescence from apoptosis or proliferation in treated cancer cell populations.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence data to establish dose-response relationships for senescence-inducing compounds.
- Operational Value: Delivers reproducible, high-sensitivity measurements compatible with flow cytometry platforms for scalable assay implementation.
- Scientific Value: Permits multiplexing with immunolabeling to correlate senescence with specific cellular markers or pathways.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links in vitro senescence induction to potential in vivo treatment outcomes, supporting translational biomarker alignment.
- Operational Value: Facilitates longitudinal monitoring of senescence dynamics across treatment durations and dosing regimens.
- Scientific Value: Enables risk-adjusted advancement decisions by quantifying the proportion of senescent cells under varying therapeutic conditions.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the oncology discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy assessment, providing a quantitative senescence readout that informs mechanistic understanding and compound selection.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring senescence induction as a downstream effect of chemotherapeutic exposure.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs for evaluating compound libraries in a standardized, sensitive format.
- Analytics: Provides fluorescence-based readouts and percentage calculations enabling statistical comparison of treatment conditions.
- Translational Research: Connects cellular senescence data to potential therapeutic outcomes, supporting biomarker-driven decision making.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable flow cytometry workflow applicable across cancer models and therapeutic modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in phenotypic responses to treatment.
- Operational Value: Enhances reproducibility and throughput compared to traditional β-galactosidase assays, accelerating screening timelines.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early identification of senescence-inducing compounds, reducing late-stage attrition risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of drug candidates based on quantifiable senescence induction profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry setup, compensation, and gating strategies for accurate fluorescence quantification.
- Dependent on access to flow cytometers with appropriate fluorescence detection channels and software for histogram analysis.
- Necessitates standardized cell preparation and staining protocols to ensure assay consistency across experiments and users.
- Involves optimization of drug concentration and exposure time for senescence induction across different cancer cell lines.
- Requires inclusion of viability controls to exclude apoptotic or necrotic cells that may confound senescence measurements.
