Name: 의 검사 초파리 애벌레 기관 내 터미널 셀 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: 학습하세요 초파리 애벌레 기관 내 터미널 셀의 형태 분석 방법을. GFP 형광 표지와 열 고정을 활용한 빠른 현미경 관찰 기법으로 유전자 돌연변이가 세포 발달에 미치는 영향을 효율적으로 연구할 수 있습니다.

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우리는 원고에 대하여 코멘트를위한 질리안 스탠 필드 감사합니다. TAJ는 NIH의 NIGMS에서 유타 유전학 교육 그랜트 T32-GM007464의 대학에 의해 지원됩니다.

1. 모자이크 생성 <ol><li> 유전 크로스 W FRT 19A 욕조 : GAL80 FLP 122 / Y, BTL-GAL4, UAS - GFP (남성) X *는 검사 할 돌연변이를 나타냅니다 * FRT 19A / 발 (여성). 참고 :이 동물들이 적절하게 짝짓기를 할 수로, 사전 실험 적어도 하루를 건너 설정합니다. </li><li> 사전 평신도 : 전송 크로스 미디어에 배치 신선한 효모 붙여 넣기의 작은 얼룩을 가진 비행 식품 유리 병에. 25 ℃에서 1 시간 동안 누워 허용 </li><li> 레이아웃 : 사전 누워 병에서 전송 동물을 신선한 효모 붙여 넣기의 작은 얼룩과 신선한 유리 병. 25 ℃에서 6 시간 동안 누워 허용 </li><li> 이전 성인은 다시 저장 및 다음 실험에 사용하기 위해 병을 사전에 배치합니다. 즉시 열 충격 순환 물 목욕 38 ° C에서 45 분, 대한​​ 0-6 시간 이전 배아를 포함하는 평신도 병. 참고 : 음식의 표면은 모두를 확인하기 위해 물 수준 이하이어야한다배아는 적절한 충격을 열 수 있습니다. </li><li> 세 번째 instar의 유충이 방황하기 시작 때까지 4 ~ 5 일 25 ° C에서 열 충격 튜브를 품어. </li></ol> 2. 모자이크 동물을위한 화면 <ol><li> 미세 집게를 사용하여 부드럽게 병의 측면에서 방황하는 세 번째 instar의 유충을 선택하고 작은 플라스틱 접시에 냉장 100 % 글리세롤에 배치합니다. </li><li> 형광 광학 탑재 한 고배율 해부 현미경을 사용하여 유충을 검사합니다. 찬란 분류 기관 세포의 모자이크 식으로 애벌레를 식별합니다. 일반적으로이 10-20X 배율에서 수행 할 수 있습니다. </li></ol> 3. 열 고정 <ol><li> 미세 집게를 사용하여 조심스럽게 75x25x1 mm 흰색 유리 현미경 슬라이드에 신선한 100 % 글리세롤의 드롭 접시와 장소의 모자이크 동물을 선택하십시오. 참고 : 여러 동물 드롭 (그림 1A)에 배치 할 수 있습니다. 동물은 또한 직접 coverslip을에 글​​리세롤의 드롭 배치 할 수 있습니다동물이 매우 빠르게 열 것 이상 고정 될 수 있지만,주의, 고정 (단계 3.2) 동안주의해야합니다. </li><li> 동물까지 70 ° C 열 블록 위에 장소 유리 슬라이드은 커버 슬립 (그림 1B)에 대한 슬라이드, 10 초, 더 이상 20 초를 이동하지 중지합니다. 동물은 처음 몸부림되지만 중지하고 엄밀한 길게 한 번 죽은됩니다. 주 : 열까지 너무 긴 노출뿐만 아니라 GFP 신호가 희미하고 산만하게 같은 터미널 지점과 루멘 손상 될 수 있습니다. 최적의 효율성을 위해 그것을 현미경 같은 방에 열 블록을 가지고하는 것이 좋습니다. </li><li> 미세 집게를 사용하여 조심스럽게 방향을 슬라이드에있는 모든 애벌레는 다른 (그림 1C)에 평행되는 등 한 방향에있는 드롭의 모든 애벌레. </li><li> 부드럽게 애벌레의 상단 (또는 유리 슬라이드에 coverslip을 반전)에 18x18mm 마이크로 커버 유리를 배치하고 형성하는 거품을 (그림 1D)하지 마십시오. 참고 : coverslip을 정확하게 거짓말을하지 않을 수 있습니다유충에 평면이 문제가되지 않습니다. </li><li> 30 분 안에 이미지 유충. 열 고정 터미널 세포가 저하되고 GFP 신호가 매우 확산 될 것입니다. </li></ol> 4. 기관 내 터미널 세포의 생체 내 이미징 <ol><li> 복합 입체 현미경의 무대에 슬라이드를 놓습니다. 배 목적은 동물의 등쪽 표면 (그림 1 층)에서 후부 앞쪽에에서 실행되는 두 개의 병렬 지느러미 줄기를 찾아 사용. 직접 두 개의 지느러미 줄기 사이에 두 개의 지느러미 터미널 세포를 찾습니다. 이 분석을위한 적절한 세그먼트를 식별하는 데 도움이됩니다. </li><li> 일단 지향, 이미지 원하는 단말기 세포에 동물을 돌립니다. 이 작업을 수행하려면 신중 집게 천천히 coverslip에 아래의 유충 (그림 1E 및 1G) 압연, 유충의 긴 축에 수직으로 가장자리에 coverslip을 밀어 넣습니다. </li><li> 해당 단말기 셀을 선택하면 일관성있는 결과를 위해 중요합니다과 돌연변이 사이의 비교. 체지방 지점 (FB) 단자 세포는 쉽게 정중선 외측 등쪽 트렁크에 인접 발견된다. 측면 그룹 G 단자 세포 (LG)를 쉽게 찾을 수 있습니다 및 복부 정중선 (그림 1H)의 바로 옆에 위치하고 있습니다. 참고 : 대부분의 전방 (TR1)과 후방 (TR10) 세그먼트의 단자 세포의 배열이 다른 세그먼트에서 분기됩니다. 우리는 세그먼트 TR2-TR9에서 터미널 세포를 분석합니다. 등의 단말기 세포는 다른 기관 단자 세포보다 더 많은 박힌 분기 패턴이 있습니다. 이 추가 비 셀 자율적 인 신호에 따라 달라질 수 있습니다, 분석에 포함할지 여부를 결정할 때 고려되어야한다. </li><li> 관심 단자 세포가 확인되면 원하는 배율을 사용하여 이미지를 캡처, 일반적으로 10 배 또는 20 배 (그림 2A) 최고입니다. 참고 : 변수 분기 패턴으로 인해, 많은 지점과 가능한 한 가지 팁을 포함 이미지를 캡처하려고. </li><li> 스테이지를 이동하지 않고, 형광을 끄고 동일한 셀 및 초점면 (그림 2B)의 시야 이미지를 캡처하는 투과광의 전원을 켭니다. 루멘은 멍하니 단자 세포 공간에 대조로 보여 질 것입니다. 단말기 세포의 가지와 루멘의 양을 계획하는 경우, 각 터미널 셀의 다중 초점면에 여러 이미지를 수집합니다. </li></ol> 5. ImageJ에 사용 터미널 세포 형태의 분석 및 정량화 <ol><li> ImageJ에 (사용하는 형광 및 명 시야 이미지를 열고 <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> ) NeuronJ 플러그인 ( <a href="http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/" target="_blank">http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/을</a> ). </li><li> &quot;추가 트레이싱&quot;도구를 사용하여 수동으로 전체 단말기 세포의 가지와 루멘을 추적. </li><li> &quot;라벨 경시&quot;도구를 사용하여, 이름 바꾸기 및 R추적 특정 지정 내의 각 행을 할당 할 ecolor. </li><li> &quot;파라미터 설정&quot;도구를 사용하여 6-10 픽셀의 선 폭을 조정 (복합 현미경에 연결된 디지털 카메라에서 얻은 512x512 크기 이미지. 높거나 낮은 해상도의 카메라를 들어, 픽셀 너비가 적절히 조정되어야한다), 모두를 사용하여 다른 기본 설정 및 &quot;OK&quot;를 선택합니다. 다음 이미지를 촬영하기 위해 &quot;스냅 샷 만들기&quot;도구를 사용하십시오. 선택한 원본에 나란히 표시 할 수 있습니다 추​​적의 스냅 샷을 얻기 위해 &quot;추적을 그립니다.&quot; </li><li> &quot;측정 표목&quot;도구를 선택하고 추적 유형 (측정 지점 단계 5.3에서 할당 된 특정 지정에 따라 예)를 선택합니다. 다음, &quot;실행&quot;을 클릭하여 &quot;추적 측정을 표시&quot;하고 &quot;지우기 이전 측정&quot;. 이 이름, 레이블, 길이 (픽셀), 이미지에 대한 다른 데이터를 포함하는 스프레드 시트를 생성합니다. 이 데이터는 또한 통계에 대한 Microsoft Excel 스프레드 시트로 저장할 수 있습니다분석. </li></ol>

<ol><li>Manning, G., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+Drosophila+Tracheal+System%5BTitle%5D)+AND+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22%5BJournal%5D)">Development of the Drosophila Tracheal System.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , 609-685 (1993).</li>
<li>Jarecki, J., Johnson, E., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+regulation+of+airway+branching+in+Drosophila+is+mediated+by+branchless+FGF%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Oxygen regulation of airway branching in Drosophila is mediated by branchless FGF.</a> Cell. 99 (2), 211-220 (1999).</li>
<li>Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Social+interactions+among+epithelial+cells+during+tracheal+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Social interactions among epithelial cells during tracheal branching morphogenesis.</a> Nature. 441 (7094), 746-749 (2006).</li>
<li>Ruiz, O. E., Nikolova, L. S., Metzstein, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Zpr1+%28Zinc+Finger+Protein+1%29+Is+Required+Downstream+of+Both+EGFR+And+FGFR+Signaling+in+Tracheal+Subcellular+Lumen+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Drosophila Zpr1 (Zinc Finger Protein 1) Is Required Downstream of Both EGFR And FGFR Signaling in Tracheal Subcellular Lumen Formation.</a> PLoS ONE. 7 (9), e45649(2012).</li>
<li>Ghabrial, A. S., Levi, B. P., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+screen+for+tube+morphogenesis+and+branching+genes+in+the+Drosophila+tracheal+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A systematic screen for tube morphogenesis and branching genes in the Drosophila tracheal system.</a> PLoS Genetics. 7 (7), e1002087(2011).</li>
<li>Baer, M. M., Bilstein, A., Leptin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonal+genetic+screen+for+mutants+causing+defects+in+larval+tracheal+morphogenesis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A clonal genetic screen for mutants causing defects in larval tracheal morphogenesis in Drosophila.</a> Genetics. 176 (4), 2279-2291 (2007).</li>
<li>Schottenfeld-Roames, J., Ghabrial, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whacked+and+Rab35+polarize+dynein-motor-complex-dependent+seamless+tube+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Whacked and Rab35 polarize dynein-motor-complex-dependent seamless tube growth.</a> Nat. Cell Biol. 14 (4), 386-393 (2012).</li>
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<li>Centanin, L., Dekanty, A., Romero, N., Irisarri, M., Gorr, T. A., Wappner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+autonomy+of+HIF+effects+in+Drosophila%3A+tracheal+cells+sense+hypoxia+and+induce+terminal+branch+sprouting%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell autonomy of HIF effects in Drosophila: tracheal cells sense hypoxia and induce terminal branch sprouting.</a> Dev. Cell. 14 (4), 547-558 (2008).</li>
</ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 관심이 없다는 것을 선언합니다.

여기에 설명 된 열 고정 기술은 이미징 Drosophila의 애벌레 기관 단자 세포에 대한 신속하고 편리한 도구입니다. 여기, 우리는 분기와 야생형 세포의 내강 패턴을 조사하기 위해이 기술을 사용합니다. 숨 기관 특이 적 프로모터에 의해 구동 GFP를, 표현 기관 세포는 열 고정 후 유충의 표피를 통해 쉽게 시각화 할 수 있습니다. 뿐만 아니라 공기 채워진 루멘의 그 같은 개별 단말기 세포의 특정 분기 패턴을 신속하게 시각화하고이 방법을 사용하여 측정 할 수 있습니다. 이 기술은 첫 번째와 두 번째 모두 instar의 유충에서 수행 할 수 있습니다. 그러나 치료는 형광 단백질의 표현으로, 작은 동물을 고정에주의해야 쉽게 중단 될 수 있습니다. 여기에 표시된 방법으로, 우리는 하나의 기관 세포에서 발현 GFP 모자이크 동물의 분석을 설명합니다. 그러나 동일한 기술 numbe를 아래 기관 세포의 분석에 적용실험 조작의 연구. 예를 들어, 동물있는 ...

세포의 모양은 유기체 내의 개별 세포의 기능에 중요한뿐만 아니라, 세포 인 조직이나 기관의 일부로서 그 기능. 분기 및 튜브 형성 (lumenogenesis) : 우리는 세포 형태의 두 가지 보존 유형을 제어에 참여하는 분자 메커니즘을 조사하기 위해 초파리 기관 단자 세포, 곤충 호흡기 시스템의 구성 요소를 사용합니다. 터미널 세포는 분기 튜브 네트워크의 끝 위치되는 내부 조직 1에 산소를 전달하고 표적 조직 2에서 현지 산소 농도에 의해 제어되는 FGF 신호 전달 경로에 따라 정교한 지형 형태를 가지고하는 기능.에게 터미널 셀 분기 각 지점을 통해 실행 가스로 채워진 세포 내 루멘으로, 얇은 튜브입니다. 유전자 분석은 초파리에서 수행 할 수있는 용이성과 함께 단말기 세포의 독특한 세포 구조는,이 세포에게 훌륭한 모델 F을또는, 휴대 가지의 메커니즘을 조사 분기 및 세포 내 튜브를 형성합니다. 터미널 세포는 분기 세포 분화, 가지,과 성숙 2-4로 이어지는 신호 전달 경로의 일부를 이해하기위한 유용한 모델을 입증했다. 이 시스템은 공정한 사용하여, 세포 형태 형성의 돌연변이에 대한 앞으로 유전자 스크린은 세포의 모양 5,6를 제어 메커니즘에 대한 통찰력을 항복 수행되었다. 인테 매개 접착력을 가지 안정성 8을 위해 필요합니다; 예를 들어,이 화면은 특정 RabGAP가 루멘 형성과 포지셔닝 7 골격 극성 소포 인신 매매를 위해 필요하다는 것을 밝혀 그 상피 PAR 극성 단백질은 필요한 편광 막 인신 매매를 규제 분기 및 루멘 형성 9 모두. 단말기 세포에서 다른 연구는 비대칭 말라 축적과 미세 소관 조직 세포의 신장과 lumenogenesis 필요한 것으로 나타났습니다 <s&gt; 10 최대. 따라서, 다양한, 보존 세포 생물 학적 메커니즘 터미널 세포 형태 형성에 기여한다. 여기, 우리는 신속하게 터미널 휴대 분기 및 루멘 형성의 분석을위한 본래 제 령 초파리의 애벌레를 해결하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 첫 번째와 두 번째 모두 탈피 동물에서 수행 할 수 있습니다. 이 기술의 핵심 유전자 직접 그대로 동​​물의 애벌레 표피를 통해 형광 단백질 식으로 표시되어 단자 세포를 시각화 할 수있는 기능입니다. 이 절차와 같은 항체 염색으로 사후 고정 조작은, 세포를 관찰 할 필요가 없기 때문에, 그것은 잘 유전자 또는 약물 검사를 포함하여, 높은 처리량 분석에 적합합니다. 형광 단백질의 발현은 cytoplasmically 채워진 가지의 구조를 보여준다. 관 형성은 병렬 주변의 유체은 - 채우기와 대조 가스 채워진 루멘을 식별하는 브라이트 현미경을 사용하여 모니터링 할 수 있습니다ED 조직. 이 프로토콜에 포함 달리 레이블이 동물에 형광 단백질로 표시된 동형 접합체 돌연변이 단자 세포를 생산하는 MARCM 시스템 11에 따라 유전 모자이크를 생성하는 방법입니다. 단말기 세포는 비교적 늦게 개발에서의 복잡한 구조를 정교 때문에 이것은 필요하다, 유전 모자이크 이전에 개발에 다른 조직의 유전자 요구 사항을 우회 할 수 있습니다. . MARCM 클론을 생성하는 기관이 여기에 설명 숨 기관 - 특정 드라이버 (BTL) 12를 사용하여 표시하는 것은 초파리의 X 염색체를위한 프로토콜이며, 다른 염색체에 대해 유사한 절차가되는 염색체에 적합한 유전자 시약과 함께 사용할 수 있습니다 하였다. 여기에, 기관은 cytoplasmically 지역화 된 GFP의 발현에 의해 표시되지만, 절차는는 DsRed 다른 형광 단백질의 발현과 동일하게 작동합니다. 또한, 우리는 신경 가지 패턴 13 특성화 개발 방법에 따라 단말기 세포에서 분기 패턴과 루멘 형성을 정량화하는 방법을 포함했다. 정량적 데이터의이 종류는 안목 정확한 분기 또는 lumenogenesis 과정에서 유전자의 역할뿐만 아니라, 다른 돌연변이 9 사이의 직접 비교를 허용에 중요 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Student Dumont #5 펜치</td><td>파인 사이언티픽 도구</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Leica MZ16 해부 현미경(또는 동급)</td><td>Leica</td><td>MZ16</td><td></td></tr><tr><td>AxioImager M1 복합 현미경(또는 동급)</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>AxioCam MRm, A-PLAN 10X/0.25, EC PLAN-NEOFLUAR20X/0.5, 필터 세트 38HE</td></tr><tr><td>100% 글리세롤</td><td>BioExpress</td><td>M152-4L</td><td></td></tr><tr><td>플라이 스톡</td><td></td><td></td><td>유전자형 : w FRT19A 튜브 : GAL80 FLP122; Btl-GAL4, UAS-GFP y w FRT19A</td></tr><tr><td>플라이 스톡</td><td></td><td></td><td>유전자형: y w FRT19A</td></tr></tbody></table>

의 검사<em&gt; 초파리</em가벼운 현미경으로&gt; 애벌레 기관 내 터미널 셀

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

세포의 모양은 세포 기능에 중요합니다. 그러나 세포 형태의 중요성에도 불구하고, 약간은 개별 세포가 특정 모양을 생성하는 방법에 대해 잘 알려져 있습니다. 초파리 기관 단자 세포는 세포의 형태학 생성에 필요한 유전자의 역할을 확인하고 해명 할 수있는 강력한 유전 적 모델이되고있다. 터미널 세포 분지 관 네트워크의 구성 요소, 내부 조직에 산소를 공급하는 기능하는 기관 시스템입니다. 터미널 세포들은이 두 가지 세포 구조를 가지고 같은 세포 형태의 질문 조사를위한 훌륭한 모델입니다. 첫째, 단말기 세포는 복잡한 신경 세포와 유사한 정교한 지형 형태를 가지고, 둘째, 단말기 세포의 가지 얇은 튜브로 형성 막 결합 세포 내강을 포함하고 있습니다. 터미널 셀 지점 번호, 지점 조직과 개인의 지사 형태의 정량 분석​​은 특정 유전자 기계화의 역할에 대한 정보를 제공하는 데 사용할 수 있습니다분기 셀의 제작에 anisms. 이러한 세포의 관 형성 분석은 척추 동물의 혈관과 같은 다른 관 네트워크에 공통 tubulogenesis의 보존 메커니즘을 밝힐 수 있습니다. 여기에서 우리는 빠르게 이미지를 수정하는 데 사용할 수있는 기술을 설명하고, 초파리 유충에서 모두 분기 패턴과 단말기 세포의 관 형성을 분석합니다. 이 기술은 야생형과 돌연변이 동물, 또는 유전 모자이크의 터미널 세포를 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 이 때문에 프로토콜의 높은 효율, 그것은 또한뿐만 유전, RNAi의 기반 또는 초파리 기관 시스템의 마약 화면에 적합합니다.

결과는 그림 2에 표시됩니다. 그리고 각 분기를 통해 실행 가스로 채워진 세포 내 루멘 (브라이트 현미경으로 시각, B) 하나의 측면 그룹 (LG) 단자 셀은 광범위한 세포 내 분기를 (GFP로 시각화)를 보여줍니다. 이러한 이미지는 섹션 1과 2에 설명 된 MARCM 시스템을 사용하여 생성, 모자이크 L3 유충에서 수집, 열은 고정 군데과 같은 섹션 3 및 4에 설명 하였다. 패널 C &amp; D는 A &amp; B. 패널에 표시된 이미지의 각각 분기 기준으로 5 장에서 설명 NeuronJ 생성 된 추적 및 루멘을 보여 E &amp; F 애벌레 지방 몸 (FB) 지점의 위치를​​ 보여줍니다 섹션 3 및 4에 설명 된대로 영상을 준비했습니다. 이 예에서, 동물 모자이크 아니며, GFP는 전체 기관 시스템을 통해 표현되어 있습니다. 패널 G와 H는 너무 긴 시간 동안 고정 열였다 GFP - 라벨 터미널 셀의 예를 보여줍니다. GFP는 BRANCHE, (G) 확산이다들로 세분화하고 루멘의 부분은 가...

여기, 우리는 기관 단자 세포의 광학 현미경 분석에 대한 방법을 제시<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레. 이 방법은 전체 동물의 지사와 루멘 형태의 빠른 검사를 위해 허용하고 개별 돌연변이 또는 터미널 세포 발달에 영향을 미치는 돌연변이 화면의 분석에 유용 할 것입니다.

Cell shape is critical for cell function. However, despite the importance of cell morphology, little is known about how individual cells generate specific ...

본 절차의 전체적인 목표는 기관 말단 세포의 분지 및 관 형태를 이미징하기 위해 온전한 초파리 유충을 빠르게 고정하는 것입니다. 이는 먼저 유전적 모자이크 동물에서 동형접합성 형광 단백질 표지 말단 세포를 생성함으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 모자이크 유충을 수집하고 열을 이용하여 고정하는 것입니다.세 번째 단계는 GFP 발현을 이용해 분지를 관찰하고 명시야 현미경을 이용해 관을 관찰함으로써, 고정된 동물 내 표지된 말단 세포를 이미징하는 것입니다. 마지막 단계는 말단 세포의 형태를 정량화하는 것입니다. 궁극적으로, 이 결과는 야생형과 돌연변이 말단 세포의 뚜렷한 세포 형태를 구별하고 분류하는 데 사용될 수 있습니다.화학적 고정과 같은 기존 기술과 비교했을 때 이 기술의 단순한 장점은 매우 신속하다는 것이며, 따라서 기관 말단 세포의 고속 처리 분석에 사용할 수 있다는 점입니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자는 L3 유충을 선택하고 형태를 보존하기 위해 빠르게 고정하는 과정에서 주의와 세심함이 필요하므로 어려움을 겪을 수 있습니다. 모자이크 초파리를 만들기 위해.조사 대상 돌연변이를 보유한 암컷을 사용하여 Mark M 기법을 적용합니다. 신선한 효모 페이스트를 도포한 산란 전 바이알(pre lay vial)에 교배 쌍을 설정하고, 25 °C에서 한 시간 동안 파리가 알을 낳도록 합니다. 그 후, 파리를 산란 전 바이알에서 신선한 효모 페이스트가 들어 있는 새 바이알로 옮기고 25 °C에서 6시간 동안 산란하도록 합니다.6시간 후, 성충을 보관 및 후속 실험에 즉시 사용할 수 있도록 다시 산란 전 바이알(pre lay vials)로 옮깁니다. 수집된 산란 바이알을 순환 수조에서 38 °C로 45분 동안 열 충격 처리하며, 모든 배아가 적절하게 열 충격 처리될 수 있도록 먹이 표면이 수위보다 낮게 위치해야 합니다. 이제 열 충격 처리된 바이알을 25 °C에서 3령 유충이 될 때까지 4~5일 동안 배양합니다.미세 핀셋을 사용하여 유충의 이동을 유도합니다. 바이알 벽면에서 이동 중인 3령 유충을 조심스럽게 집어 소형 플라스틱 플레이트에 담긴 냉각된 100% glycerol에 옮깁니다. 형광 광학 장치가 장착된 고배율 해부 현미경을 사용하여 10배 또는 20배 배율로 유충을 관찰합니다.형광 표지된 기관 세포가 모자이크 형태로 발현된 유충을 식별합니다. 그런 다음 미세 핀셋을 사용하여 해당 개체들을 조심스럽게 집어 흰색 유리 현미경 슬라이드 위의 신선한 100% glycerol 한 방울에 놓습니다. 현미경과 같은 공간에 있는 경우, 한 방울에 여러 마리의 개체를 놓을 수 있습니다.동물이 막 움직임을 멈출 때까지 유리 슬라이드를 70 °C 가열 블록 위에 놓으십시오. 이 과정은 20초 이내에 완료됩니다. 처음에는 동물이 꿈틀거리지만, 점차 뻣뻣해지며 길게 늘어납니다. 일단 사멸한 후 장시간 노출되면 말단 가지뿐만 아니라 루멘(lumen)까지 열 손상이 발생합니다.GFP 신호가 희미해지고 확산됩니다. 과도한 고정은 세포를 손상시켜 분석 결과를 오도하거나 분석을 어렵게 만들 수 있으므로 열 고정 시간 조절이 매우 중요합니다. 따라서 시료를 히트 블록에 넣고 세포의 움직임이 막 멈출 때까지만 고정하며, 그 이상으로 고정해서는 안 됩니다.이제 미세 핀셋을 사용하여 고정된 모든 유충이 서로 평행하도록 조심스럽게 정렬합니다. 그 다음 유충 위에 마이크로 커버 글라스를 살며시 덮고 기포가 생기지 않도록 주의합니다. 커버 슬립이 완전히 평평하지 않을 수 있으나, 이는 문제가 되지 않습니다.다음 30분 이내에 유충을 촬영하십시오. 열 고정된 말단 세포는 빠르게 분해되어 GFP 신호가 매우 확산되기 때문입니다. 그 다음, 슬라이드를 복합 실체 현미경의 재물대 위에 놓으십시오.5배율 대물렌즈를 사용하여 동물의 등쪽 표면에서 전방에서 후방으로 뻗어 있는 두 개의 평행한 등쪽 신경줄(dorsal trunks)을 찾으십시오. 다음으로, 두 등쪽 신경줄 바로 사이에 위치한 두 개의 등쪽 말단 세포(dorsal terminal cells)를 찾으십시오. 이를 통해 분석에 적합한 마디를 식별할 수 있습니다.방향을 잡은 후, 포셉으로 커버슬립의 가장자리를 조심스럽게 밀어 동물을 회전시켜 원하는 말단 세포를 촬영합니다. 동물의 장축에 수직 방향으로 밀면 유충이 천천히 회전합니다. 일관된 결과와 돌연변이체 간의 비교를 위해서는 적절한 말단 세포를 선택하는 것이 매우 중요합니다.지방체 분지 말단 세포는 등쪽 주간에 인접하여 정중선 가측에서 쉽게 찾을 수 있습니다. 가측 G군 말단 세포 역시 쉽게 찾을 수 있으며, 가장 앞쪽 및 뒤쪽 마디의 복측 정중선 바로 가측에 위치합니다. 말단 세포의 배열은 다른 마디들과는 다릅니다.해당 분절들은 조사하지 않아야 하며, 대신 세포와 분절에 집중해야 합니다. TR 2에서 9까지의 등쪽 말단 세포는 다른 기관 말단 세포보다 더 정형화된 분지 패턴을 보입니다. 이는 추가적인 비세포 자율적 신호에 의해 결정될 수 있으며, 분석에 이들을 포함시킬지 여부를 결정할 때 이를 고려해야 합니다.관심 있는 말단 세포를 확인한 후, 분지 패턴이 다양하므로 10배 또는 20배 배율을 사용하여 이미지를 캡처하십시오. 스테이지를 이동하지 않고 가능한 한 많은 분지와 분지 팁이 포함되도록 이미지를 캡처하십시오. 형광 조명을 끄고 투과광을 켭니다.동일한 세포와 초점 평면의 명시야 이미지를 캡처하기 위해, 말단 세포 공간 내의 루멘은 어둡게 대비될 것입니다. 말단 세포의 분지와 루멘을 정량화하려면 각 말단 세포의 여러 초점 평면에서 다수의 이미지를 수집하십시오. 일부 세포는 충분한 데이터를 수집하기 위해 단일 이미지만 필요하지만, 다른 세포들은 서로 다른 초점 평면에서 최대 3개의 개별 이미지가 필요할 수 있습니다.모든 분지를 캡처하려면, neuron J 플러그인이 설치된 Image J에서 형광 말단 명시야 이미지를 엽니다. add tracings 도구를 사용하여 전체 말단 세포의 분지와 루멘을 수동으로 추적합니다. label tracings 도구를 사용하여 이름을 변경하고 색상을 다시 지정함으로써 추적 내의 각 선에 5 12 by 5 12 픽셀 이미지에 대한 특정 명칭을 부여합니다. set parameters 도구를 사용하여 선 너비를 6에서 10 픽셀로 조정합니다.고해상도 또는 저해상도 이미지에 맞게 크기를 조정하십시오. 다른 설정은 기본값으로 두고 확인을 누릅니다. 그런 다음 스냅샷 생성 도구를 사용하십시오.이미지를 캡처하려면 draw Trace를 선택하여 원본 이미지와 나란히 표시할 수 있는 트레이스 스냅샷을 얻으십시오. measure tracings 도구를 선택하고 해당 트레이스를 선택하십시오. 특정 지정 사항에 따라 측정할 분지(branch)를 입력하십시오.다음으로, display tracing measurements를 선택합니다. 그런 다음 이전 측정값을 지우고 run을 클릭합니다. 이렇게 하면 통계 분석을 위해 저장될 이미지의 이름, 레이블, 픽셀 단위의 길이 및 기타 데이터가 포함된 스프레드시트가 생성됩니다.GFP로 시각화된 Mosaic L3 유충의 변이된 기관 세포를 분석하기 위해 위에서 설명한 프로토콜을 따랐습니다. LG로 표시된 단일 외측 그룹 말단 세포는 명시야 상에서 광범위한 세포 내 분지를 보입니다. Neuron J를 통해 각 분지를 관통하는 가스로 채워진 세포 내 루멘이 확인됩니다. 분지와 루멘의 추적선이 각각 작성되었습니다. 이 비모자이크 동물에서는 FB로 표시된 지방체 말단 세포가 식별됩니다.GFP가 기관계 전체에 걸쳐 발현됨을 확인하십시오. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 발달 후 온전한 동물 내에서 기관 말단 세포를 빠르게 고정하고 정량 분석을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 기술은 연구자들이 기관 말단 세포를 세포 형태 형성의 양상을 이해하기 위한 핵심 모델로 사용할 수 있는 길을 열어주었습니다.

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연구

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Biology

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