세미 그대로의 레이저 조명과 신경 활동의 Optogenetic 섭동

본 프로토콜에서는 먼저 적절한 유전자형의 유충에게 모든 trans A TR이 포함된 E 기반 먹이를 공급합니다. 각 유충을 고정한 뒤 일반 식염수 내에서 해부하고, 일반 식염수를 2mM calcium ringer 용액으로 교체한 후 해부된 LABA 표본을 현미경 스테이지 위에 올립니다. 해부된 LABA의 움직임은 CCD 카메라로 비디오 녹화합니다. 신경계를 국소적으로 조사함으로써, 동일한 활성 표본의 움직임을 모니터링하는 동시에 특정 타이밍에 일부 뉴런 집단의 신경 활동을 섭동시킬 수 있습니다.

안녕하세요, Dr. A 연구실의 Tega입니다. 안녕하세요, 저도 Dr. A 연구실의 Oph 레벨에 있는 Kosaka입니다.

운동 능력은 운동 회로를 연구하기 위한 유용한 모델 시스템입니다. 본 프로토콜의 고도로 발달된 유전적 기술을 통해, 운동 상태를 모니터링하면서 운동 뉴런을 광유전학적으로 조절할 수 있습니다. 공초점 현미경의 레이저를 사용하여 특정 뉴런 집합을 자극함으로써, 뉴런의 시공간적 섭동에 따른 운동 반응을 분석할 수 있습니다.

그럼 시작하겠습니다. 표준 생먹이가 포함된 플라스틱 바이알에서 K64 US CHR2 또는 K64 US NPHR 초파리 라인을 유지하십시오. 적절한 농도의 yeast-based TL 용액을 첨가하고 잘 섞어줍니다. 사과 주스 한천 배지에 yeast-based 용액을 펴 바릅니다.

바이알에서 SLA의 두 번째 또는 세 번째 집락을 채취합니다. TR이 포함된 효모 배지 플레이트에 집락을 접종합니다. TR을 암조건으로 유지하기 위해 플레이트를 알루미늄 호일로 덮습니다. 25 °C에서 적절한 기간 동안 집락을 배양합니다.

이 장치는 동일한 온전한 실험실의 시각화를 위한 CCD 카메라입니다. SEMA 분리 장치를 사용하여 CCD 카메라를 일반적인 공초점 현미경에 부착하십시오. A TRA 로비를 수거하여 물로 헹굽니다.

체내의 잔류 먹이를 제거하기 위해, 유충을 C 가드 냉각 접시의 등쪽이 아래로 향하게 놓습니다. 머리와 꼬리 부분을 곤충 핀으로 고정합니다. 칼슘 없는 생리식염수를 첨가합니다.

마이크로 가위를 사용하여 꼬리 근처에 작은 절개를 만듭니다. 등쪽 정중선을 따라 세로로 절개합니다. 이때 복측 신경핵과 말초 신경이 손상되지 않도록 주의하십시오.

해부된 체벽의 각 모서리를 핀으로 고정한 후 머리 부분에 작은 측면 절개를 가합니다. 뇌와 복측 신경삭을 제외한 내부 장기를 제거합니다. 일반 생리식염수를 2 million model 칼슘 링거 용액으로 교체합니다.

공초점 현미경에 고배율 건식 대물렌즈를 장착하고, 현미경 스테이지 위에 실험 준비물을 놓습니다. 공초점 현미경의 적색 레이저를 사용하여 해부된 준비물의 투과 영상을 얻고 복측 신경삭의 위치를 확인합니다. 투과 영상에서 관심 영역(ROI)을 지정하며, 특정 관심 영역을 결정할 때는 확대 모드를 사용하는 것이 유용합니다.

현미경의 필터 세트를 변경하여 488 nanometer 또는 559 nanometer 광원으로 조명합니다. 할로겐 램프로 표본을 조명하여 체벽을 시각화합니다. 공초점 현미경에 연결된 CCD 카메라로 표본을 관찰합니다.

체벽의 움직임을 회상하고, CCD 카메라로 동일한 온전한 표본 내의 연동 운동을 모니터링하면서 신경 활동을 일시적으로 조작하기 위해 레이저 빔을 전부 전환합니다. 본 실험에서는 CHL 2를 운동 신경세포에 발현시킵니다. 복측 신경삭의 한두 세그먼트를 조사하면 해당 세그먼트의 운동 신경세포가 활성화되며, 이는 다시 해당 체벽 세그먼트의 근육 수축을 유도하여 복측 신경의 다른 세그먼트를 자극합니다.

추위는 다른 신체 마디의 수축을 유도합니다. 복측 신경삭의 몇몇 마디를 황색 레이저로 자극했을 때 운동 뉴런에서 NPHL이 발현되었습니다. 전파되는 파동은 체벽의 해당 마디에서 정지되었습니다.

레이저 제거를 중단했을 때, 멈췄던 세그먼트에서 파동이 다시 시작되었습니다. 이 프로토콜은 운동 중인 동일한 비활성 원형 레벨에서 레이저를 이용해 신경 활동의 광유전학적 섭동을 수행하는 절차를 설명합니다. 충분한 자극을 얻기 위해서는 이 해부 과정 동안 복측 신경삭과 말초 신경이 손상되지 않아야 합니다.

공초점 현미경에서의 조명 강도는 레이저 출력, 스캐닝 속도 또는 반복 횟수를 변경하여 조정해야 합니다. 이것으로 모든 프로토콜을 마칩니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에서 좋은 결과 얻으시길 바랍니다.