OVO에서 CAM-분석

이 절차의 전반적인 목표는 육종, 세포 또는 이식 거동을 연구하기 위해 병아리 choal toic membrane 또는 CAM 분석을 수행하는 것입니다. 이것은 먼저 부화 3일째에 알 껍질에 창을 만들어 수행됩니다. 배양 9일째의 두 번째 단계에서는 종양 물질이 준비됩니다.

그런 다음 상피층을 제거한 후 종양을 CAM에 추가합니다.배양 16일째의 마지막 단계에서 CAM을 촬영하고 수확하여 조직학적 평가를 위해 포르말린에 고정합니다. 궁극적으로, 고전적인 h 및 d 조직학과 면역조직화학은 육종, 세포 증식 및 침습 혈관화, 숙주 반응을 입증하는 데 사용됩니다. 대부분의 모델과 같은 기존 방법의 이 기술의 주요 장점은 배우기가 간단하고 상대적으로 저렴하다는 것입니다.

또한 매우 짧은 기간에 무수한 전이 관련 활동을 연구할 수 있으며 윤리 위원회가 필요하지 않습니다. 이 방법은 종양 숙주 상호 작용이 종양 생존에 미치는 영향, 종양 미세환경의 재구성 및 기질 세포의 동원과 같은 육종 연구 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 의미는 환자 자신의 자료를 연구할 수 있기 때문에 육종에 대한 맞춤형 치료로 확장됩니다.

이 모든 새로운 기술은 SAR 신경 발생에 대한 새로운 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 일반적으로 종양 발생과 같은 다른 시스템에도 매우 적용할 수 있습니다. 먼저 멸균 메스를 사용하여 종양 샘플을 1입방 밀리미터 이하의 작은 조각으로 자르고 석회화된 모든 부위를 제거합니다.

그런 다음 샘플의 무게를 측정하고 2-4g의 조직을 해리관으로 옮깁니다. 2.5 밀리리터의 콜라겐 분해 효소 2 및 2.5 밀리리터의 DN a 용액으로 조직을 소화합니다. 조직을 처리한 후 해리 H 종양 프로토콜에 따라 생성된 현탁액을 150미크론 세포 스트레이너를 통해 여과합니다.

지금 100에서 500배 G와 같은 적합한 원심력에 현탁액을 4 섭씨 온도에 5 분 동안 원심 분리하십시오. 피펫으로 상층액을 조심스럽게 제거한 후, 펠릿을 10ml의 적혈구 용해로 배양하고 실온에서 간헐적으로 양이온으로 완충합니다. 10 분 후에, 현탁액을 다시 회전시킨 후에 반응을 멈추기 위하여 배양 배지의 25 밀리리터를 추가하십시오, 펠릿은 백색이어야 하고, 상등액을 버리고 세포에 매체의 5 밀리리터를 추가하고, 그 후에 70 미크론 세포 스트레이너를 통해서 현탁액을 거릅니다.

자동 세포 계수기를 사용하여 개발 시 밀리리터당 살아있는 세포의 수를 결정합니다. 3일차, 18게이지 바늘을 난자 끝에 삽입하고 알부민 2ml를 제거하여 OVO chorio all toic membrane 또는 cam의 수준을 낮춥니다. 이제 창을 절단하는 동안 쉘 입자가 캠으로 쏟아지는 것을 방지하기 위해 표시된 쉘 상단에 반투과성 접착 필름을 바르십시오.

그런 다음 계란 표면에 작은 올이 있는 도입 구멍을 만듭니다. 쉘을 여는 동안 캠을 손상시키지 않는 것이 절차에서 가장 까다로운 부분입니다. 우리는 날카로운 가위를 사용하여 한 손에는 계란을 수평으로 잡고 다른 손에는 계란을 유지합니다.

이제 멸균되고 뾰족한 수술용 가위를 사용하여 껍질에서 1cm 정사각형 창을 자릅니다. 맥동하는 심장과 배아의 인접한 혈관이 이제 난황 표면에서 볼 수 있어야 합니다. 수정되지 않은 난자나 죽은 배아를 제거합니다.

그런 다음 더 많은 반투과성 접착 필름으로 창을 밀봉하십시오. 종양 현탁액을 다시 회전시킨 후, 펠릿을 냉각된 세포외 기질 겔에 100 마이크로리터 당 6개의 세포에 10회 재현탁시킵니다. 이 용액을 녹는 얼음 위에 보관하십시오.

다음으로, 층류 하에서 한 쌍의 멸균 수술용 가위를 사용하여 반투과성 접착 필름의 일부를 절제합니다. 멸균 유리 막대로 캠을 가볍게 터치하여 상피 세포층을 제거합니다. 그런 다음 셀 ECM 겔 현탁액 4 25마이크로리터 방울을 캠에 추가하여 ECM 겔이 응용 프로그램 사이에 중합되도록 합니다.

이런 식으로 암세포를 포함하는 부착 플라크가 생성됩니다. 그런 다음 반투과성 접착 필름으로 쉘 창을 다시 밀봉합니다. 적절한 실험 배양 기간이 끝나면 수술용 가위를 사용하여 껍질 창을 확대하고 너무 낮게 자르지 않도록 합니다.

다음으로, 피펫을 사용하여 300-500마이크로리터의 PBS를 접종된 물질이 포함된 CAM 섹션에 추가합니다. 그런 다음 실체 형광 현미경을 통해 캠을 촬영합니다. 그런 다음 멸균 가위를 사용하여 껍질에 대한 경계의 멤브레인을 자르고 수확한 캠을 PBS 또는 완충된 포름알데히드로 채워진 멸균 페트리 접시에 넣습니다.

그런 다음 캠의 위쪽과 아래쪽을 모두 사진으로 찍고, 보이는 대로 필터가 있거나 없는 경우 모두 사진을 찍습니다. 이 첫 번째 그림에서 종양 이식편은 캠에 부착됩니다. 여기서, 건조되고 약간 융기된 플라크를 나타내는 환자 물질의 단일 세포 현탁액이 이 두 이미지에서 관찰될 수 있습니다.

후 발생하는 멤브레인의 현저한 주름이 표시됩니다. SAO 2 라인은 7 일째부터 표면의 뚜렷한 증가와 함께 CAM 위에 퍼지는 플라크를 형성합니다. 접종 후에도 GFP 신호는 생존 가능한 세포를 나타내는 강하게 유지됩니다.

SW 1 3 53 세포를 포함하는 이러한 플라크는 표면의 감소를 보이며 수축된 캠을 갖는 경향이 있어 주름진 막이 생깁니다. 7일째부터 수확한 후 출혈이 자주 관찰됩니다. DSR 신호는 많은 세포 분열 후 형광 프로브가 희석됨에 따라 감소할 뿐만 아니라 출혈이 발생하는 경우에도 감소합니다.

대부분의 경우, CAM의 혈관 반응은 새로운 구불구불한 혈관이 샘플에 들어갈 때 관찰됩니다. 예를 들어, 화살촉으로 표시된 분기와 별표로 표시된 문합에서 화살표로 표시된 출혈도 플라크 전체에서 관찰 할 수 있습니다. SAO의 두 셀이 캠의 혈관과 평행하게 이동하는 것을 주목하십시오.

이 혈관 반응은 캠을 절제한 후 시각화할 수 있으며, 아래쪽 view는 이식편 또는 플라크를 둘러싼 구불구불한 혈관을 보여줍니다. CAM의 혈관 반응은 종양 이식 그룹과 단세포 현탁 그룹에서 관찰됩니다. 조직학적 증거에 따르면 SAO인 두 개의 세포는 세포외 기질 겔의 전체 부피에 걸쳐 단일 세포 모양을 유지하여 플라크의 두께와 직경을 증가시킵니다.

종양 세포는 여기에서 화살표로 표시된 것처럼 캠의 중배엽 층을 침범하여 캠의 내배엽과 진피층 사이의 거리를 여는 지퍼처럼 확대합니다. 이중 화살표로 표시된 바와 같이, SW 1 3 5 3 세포와 환자의 의식 육종의 단일 세포 현탁액의 성장 패턴은 세포외 기질 겔의 광활한 부분에 있는 세포 섬과 더 밀집되어 있습니다. 화살표에서 알 수 있듯이, 이소성 성장 부위를 견디지 않고 원래 육종 종양의 필수 특징과 면역조직화학적 특성이 캠에서 유지되는 것을 발견했습니다.

또한, 화살촉에서 알 수 있듯이 짙은 분홍색의 푸른 핵이 있는 병아리 적혈구의 출현으로 입증된 바와 같이 종양 이식편이 재생되었으며, 혈관에서 발견된 KI 67 양성 세포와 KI 67 음성 세포의 세포 계수는 두 세포주 모두에 대해 4일째부터 총 세포 수가 꾸준히 증가함을 보여줍니다. 이날 이후에는 접종 후 7일 동안 총 세포 수가 안정적으로 유지되고 KI 67 양성 세포 수와 총 세포 수가 감소하기 시작합니다. 캠 가까이에서 더 많은 비율의 KI 67 양성 세포가 관찰되고 플라크 표면에서 더 많은 비율의 KI 67 음성 세포가 관찰됩니다.

마스터가 되면 cam SA 기술을 사용하여 적절하게 수행되면 3일에 걸쳐 14시간 동안 50배를 분석할 수 있습니다. 추가 h 및 e 염색 및 평가를 수행할 수 있으며 이 절차에 따라 10개 조건당 3시간이 필요합니다. 독감으로 표지된 암세포의 유출 또는 화와 같은 추가 문제를 해결하기 위해 라이프스타일 이미징과 같은 추가 방법을 수행할 수 있습니다.

따라서 이 새로운 기술의 개발을 통해 전임상 테스트 분야의 연구원들은 육종 환자의 새로운 예후 및 치료 요인을 탐구할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 cmaa 에 종양 물질을 적용하는 방법과 미시적 및 미시적 관찰 결과를 변환하여 종양 숙주 상호 작용에 대한 더 나은 이해를 얻는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.