이분자 형광 보완의 유세포 분석 : 단백질 - 단백질 상호 작용을 연구하는 높은 처리량 정량 방법

본 실험 절차의 전반적인 목적은 ACAP LBC와 PDE4D3의 상호작용 부위를 매핑하는 것입니다. 이는 유세포 분석법을 이용하여 생분자 형광 상보성(Biomolecular Fluorescence Complementation, BiFC)의 평균 형광 강도를 측정함으로써 수행됩니다. 이를 위해 세포에 형광 리포터 단백질의 N-말단 또는 C-말단 부분에 융합된 ACAP LBC 및 PDE4D3 단편을 형질전환합니다.

그런 다음 단백질 단편들이 상호작용하는지 평가하기 위해 Venus 유세포 분석을 수행하여 형광을 확인합니다. 단백질 단편들이 상호작용하지 않으면 형광이 검출되지 않습니다. 상대적인 단백질 발현 수준을 결정하기 위해 보완적인 웨스턴 블롯 분석을 수행합니다.

단백질-단백질 상호작용의 강도는 YFP 평균 형광 강도를 단백질 발현 수준으로 정규화하여 계산합니다. 분석 결과, PDE 43의 ACAP LBC 결합은 PDE 43 내의 여러 영역, 주로 상위 보존 영역 1(UCR 1)을 통해 매개되는 것으로 나타났습니다. 공동 면역침전법(co-immunoprecipitation)이나 현미경을 이용한 BRET과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 상대적으로 간단하고 민감하며, 수많은 세포를 빠르게 스크리닝할 수 있다는 점입니다.

이 방법은 단백질-단백질 상호작용에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라, 신약 개발을 위해 단백질-단백질 상호작용을 조절하는 인자를 스크리닝하는 데에도 활용될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 연구자들은 선형 B 반응을 결정해야 하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 서로 다른 단백질 단편을 사용한 결과를 상호 비교하기 위해서는 구성물의 발현 수준이 유사해야 합니다.

여기서 설명하는 실험에서는, ACAP LBC 전체 길이에 융합된 YFP 유도체 Venus의 N-말단 단편과, 다음 중 하나에 융합된 Venus의 C-말단 단편(전장 PDE E 43, PDE E 43의 상류 보존 영역 1(UCR 1), 또는 PDE 43의 상류 보존 영역 2 및 촉매 영역(UCR 2 + CAT))을 세포에 공동 형질전환(cot transfection)합니다. 형질전환 전날, 6-웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 2 mL의 완전 성장 배지가 포함된 HEC 293 T 세포를 1.2 × 10⁵개씩 분주합니다. 대조군 3개 웰과 각 테스트 조건당 3개 웰을 분주합니다.

37°C, 5% 이산화탄소 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, BC 혈장 DNA 제작물과 마커로서 BS C 제작물과 함께 공동 형질전환될 CFP 벡터의 형질전환을 준비합니다. 각 조건에 따라 적절한 양의 DNA를 250 µL의 Optum M1 무혈청 배지에 첨가합니다.

멸균 튜브에 DNA 혼합물을 분주하며, 튜브 하나로 웰 3개를 트랜스펙션하기에 충분합니다. 그 다음, 희석된 DNA 혼합물 1 µg당 3 µL의 TransIT-L1 시약을 첨가하고 파이펫으로 부드럽게 섞어준 뒤 실온에서 30분간 인큐베이션합니다. 인큐베이션 후, 트랜스펙션 혼합물 250 µL를 세포에 한 방울씩 떨어뜨려 주고 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 24시간 동안 인큐베이션합니다.

형광 현미경(epi fluorescence microscope)으로 형광을 확인하여, BC 신호는 황색 형광을, 형광 전이 효율 보고는 CFP 형광을 나타내는지 확인합니다. 유세포 분석(flow cytometric analysis)을 위해 세포를 준비하려면, 먼저 2 mL의 ice cold PBS로 세포를 세척한 다음, 0.05% Trypsin 250 µL를 첨가하여 37 °C에서 2~5분 동안 배양하여 세포를 분리합니다. 그 후 현미경을 사용하여 세포가 분리되었는지 확인합니다.

세포가 탈락되면 1 mL의 DMEM을 사용하여 트립신을 중화합니다. 다음으로, 1 mL의 세포 현탁액을 마이크로 원심분리 튜브 하나에 옮기고, 0.25 mL의 세포 현탁액을 두 번째 마이크로 원심분리 튜브에 옮깁니다. 튜브를 500 xg에서 5분 동안 원심분리합니다.

250 µL의 시료는 유세포 분석을 위해 추가 처리됩니다. 1 mL의 시료는 원심분리 후 재현탁 단계와 병행하여 수행할 웨스턴 블롯 분석을 위해 얼음 위에 보관하십시오. 세포를 250 µL의 FACS 버퍼에 현탁하여 얼음 위에 둡니다. 유세포 분석을 즉시 수행하지 않을 경우, PBS 내의 1% 파라포름알데히드(Paraformaldehyde)로 세포를 고정할 수 있습니다. 유세포 분석은 488 nm, 405 nm 및 642 nm 고체 상태 레이저가 장착된 Beckman Coulter CytoFLEX를 사용하여 수행하며, 데이터 수집 및 분석에는 Summit 소프트웨어를 사용합니다. 표준 비드를 사용하여 유세포 분석기를 보정한 후, 선형 스케일에서 전방 산란광(FSC) 대 측방 산란광(SSC)을 도식화하고 살아있는 세포 집단을 게이팅합니다.

다음으로 응집되지 않은 살아있는 세포군에 대해 전압 펄스 너비 대비 SSC를 플롯하고 게이트를 설정하십시오. 그런 다음, 이 기기의 405 FL 6에서 로그 스케일로 측정된 CFP 형광 대비 FSC를 선형 스케일로 플롯하고, 응집되지 않은 살아있는 CFP 양성 세포에 게이트를 설정하십시오. 마지막으로, BC 강도를 시각화하기 위해 이 기기의 488 nm FL 1에서 로그 스케일로 측정된 YFP 형광 대비 FSC를 선형 스케일로 플롯하십시오.

다음으로, Y-F-P-C-F-P 이중 음성 샘플을 실행하고 F-S-C-S-S-C FL 1 및 FL 6 광전자 증배관(PMT) 전압을 조정하여 각 신호의 임계값을 설정합니다. 이어서, 향후 오프라인 보정을 위해 YFP 및 CFP 단일 양성 샘플을 모두 실행합니다. 이때 게이트된 이벤트(gated events)를 최소 10,000개 이상 획득해야 합니다.

마지막으로, 데이터 수집 절차에 따라 실험 샘플의 데이터를 수집합니다. 분석 프로토콜을 획득 설정에 맞춰 구성하며, 생존 세포를 확인하기 위해 FS CSC 도트 플롯에서 게이트 1을 설정합니다. 응집되지 않은 생존 세포를 위해 게이트 1의 FSC 펄스 도트 플롯에서 게이트 2를 설정하고, 응집되지 않은 ccfp 양성 생존 세포를 위해 게이트 2의 ccfp FSC 도트 플롯에서 게이트 3을 설정합니다.

YFP 및 CFP 단일 양성 세포를 사용하여 YFP CFP 도트 플롯에서 YFP 및 CCFP 신호를 보정한 후, CFP 및 YFP 양성 세포의 컷오프 라인을 결정합니다. CFP 양성 세포의 YFP 평균 형광 강도 또는 MFI를 데이터 플로팅을 위해 엑셀로 내보낸 다음, 엑셀에서 웨스턴 블로팅으로 결정한 ACAP LBC PDE E 43의 발현 수준과 로딩 컨트롤인 alpha tubulin에 대해 Y-F-P-M-F-I를 정규화하여 YFP 평균 형광 강도의 선형 범위를 결정합니다. HEC 2 93 세포에서 CFP를 VN ACAP L BBC 및 다양한 양의 VC PDE E 43과 함께 공동 형질전환하였으며, 이 비디오에서 설명한 바와 같이 바이플로우 사이토메트리를 사용하여 상호작용을 평가하였습니다. 이 플롯은 형질전환된 VC PDE E 43의 함수로서 VC PDE E 43 발현의 상대적 배수 변화를 보여줍니다.

파란색 사각형으로 표시된 CFP 양성 세포 내 Venus의 평균 형광 강도는 VCDE 43 발현과 상관관계가 있었으며, 빨간색 삼각형으로 표시된 웨스턴 블롯 이미지 분석으로 결정된 발현 수준과 일치했습니다. 초록색 사각형으로 표시된 샘플들 간에는 유사한 CFP 평균 형광 강도가 관찰되었으며, 이는 세포 간 변이를 제한하기 위한 음성 대조군으로 사용되었습니다. 이러한 결과는 BS e의 평균 형광 강도를 측정하여 ACAB LB C PDE 43 상호작용을 정량화하기 위한 유세포 분석법의 사용을 검증하는 동시에, PDE E 43 내 ACAP LBC 결합 부위를 매핑하기 위한 스크리닝에 사용되는 BIC 컨스트럭트의 적절한 양을 결정하며 PDE E 43 fl 전장 단백질과 ACAP LBC 상호작용의 BIC 분석을 수행하는 데 유효함을 보여줍니다.

여기에 표시된 것과 같이 이 방법을 사용하여 PDE 43의 UCR one 영역과 PDE 43의 UCR two 및 CAT 영역을 평가하였습니다. vn ACAP LBC 및 VC PDE 43 UCR two plus CAT의 발현은 VC PDE 43 FL 및 VC PDE 43 UCR one과 비교했을 때 더 낮은 BC 신호를 나타냈으며, 모든 flow 샘플에서 유사한 단백질 발현이 관찰되었고 평균 형광 값은 ACAP LBC PDE 43 및 alpha tubulin의 상대적 발현 수준으로 정규화되었습니다. 따라서 정규화된 B-C-M-F-I는 ACAP LBC PDE 43 FL과 ACAP LBC PDE 43 UCR R one 사이에는 형광 강도에 차이가 없으나, ACAP LBC PDE 43 UCR two plus CAT 상호작용의 경우 신호가 훨씬 낮음을 나타냅니다.

이러한 결과는 PDE 43에 ACAP LBC와 상호작용하는 여러 영역이 존재하며, PDE 43 UCR R one이 ACAP LBC와의 주요 상호작용 영역임을 시사합니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 BP C의 유세포 분석을 통해 단백질-단백질 상호작용을 연구하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 수행할 때, 유사한 단백질 발현과 선형 BP C 응답을 얻기 위해 사용되는 BP C 구조체의 정확한 양을 결정하는 것이 중요합니다. 이 절차 이후, PDE 40 D three 내의 어떤 아미노산이 관여하는지 확인하기 위해 펩타이드나 risk와 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

ACAP와 RBC의 상호작용입니다.