Name: 이분자 형광 보완의 유세포 분석 : 단백질 - 단백질 상호 작용을 연구하는 높은 처리량 정량 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: 배우세요 이분자 형광 보완과 유세포 분석을 결합한 고처리량 단백질 상호작용 정량법을. AKAP-Lbc와 PDE4D3 결합 영역을 신속하게 분석하는 이 기술은 살아있는 세포 내 단백질 기능 연구에 활용됩니다.

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우리는 중요한 실험 평가와 토론을 UIC에서 오브라이언 실험실 감사합니다. 임상 및 번역 과학 그랜트 UL1TR000050에 대한 UIC 센터 -이 작품은 번역 과학의 발전에 대한 GKC 및 국립 센터 미국 심장 협회 부여 11SDG5230003에 의해 지원되었다.

1. 세포 형질 <ol><li> 형질 전에 플레이트 세포는 하루 면역에 대한 적은 세포를 도금. <ol><li> 면역 경우 : 6 잘 플레이트, 코팅 유리 커버 전표에서 (1도 기준) 적어도 4 시간 동안 37 ° C에서 0.02 % 젤라틴으로, 중간에 한 번 씻고, 각 웰에 대한 접시, 1 × 10 5 HEK 293T 2 ㎖ 완전한 성장 배지에서 세포 [Dulbecco의 수정 이글의 미디어 (DMEM)에 10 % FBS]. </li><li> 유세포 및 서양 얼룩 분석을위한 : 판 1.2 5 HEK 293T 세포 / 잘 6 잘 플레이트 (24 - 웰 플레이트에 잘 당 0.5 ML 전체 성장 매체에서 0.3 X 10 5 HEK 293T 세포에 2 ㎖ 전체 성장 매체에서 x 10 ). </li></ol></li><li> 제조의 프로토콜에 따라 형질에 대한 DNA를 준비 Effectene는 (Qiagen의) 면역에 사용됩니다. 대중 교통 LT1 (마이 러스)는 유세포과 서양 얼룩 분석에 사용됩니다. 사용되는 DNA의 양이 아래에 나열되어 있습니다. <table border="1"><tbody><tr><tD&gt; </td><td> 24 - 웰 플레이트 (NG) </td><td> 6 잘 플레이트 (NG) </td></tr><tr><td> CFP - 벡터 </td><td> 10 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> VN N-AKAP-LBC </td><td> 200 </td><td> 1000 </td></tr><tr><td> VC N-PDE4D3-FL (전체 길이 PDE4D3) </td><td> 2.5, 5, 10, 20, 40, 80 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> VC N-PDE4D3-UCR1 (UCR1 도메인을 포함하는 PDE4D3 N-말단 단편) </td><td></td><td> 100 </td></tr><tr><td> VC N-PDE4D3-UCR2 + CAT (UCR2 및 촉매 도메인을 포함하는 PDE4D3 C-말단 단편) </td><td></td><td> 100 </td></tr></tbody></table> 형질 Effectene (6 자)를 사용하여 : <ol><li> 상온에서 5 분 동안 표시된 플라스미드 DNA의 양을 + 4 μL 향상제 100 μL 버퍼 EC로, 혼합 및 부화를 추가합니다. </li><li> 10 분 동안 5 μL Effectene, 혼합과 부화를 추가실내 온도. 추가 셀에 드롭 현명. </li></ol> : 대중 교통 LT1 (6-well/24-well)를 사용하여 형질 전환 <ol><li> 멸균 튜브 옵티-MEM I 혈청이없는 배지 250 μl/50 μL에 플라스미드 DNA의 지정된 금액을 추가합니다. </li><li> 희석 된 DNA 혼합물에 대중 교통 LT1 시약을 추가하고 섞어 부드럽게 피펫. (대중 교통 LT1 시약 : DNA 비율은 DNA 1 μg 당 대중 교통 LT1 시약 3 μL)입니다. </li><li> 실온에서 30 분 동안 배양 및 세포 드롭 현명한 추가 할 수 있습니다. </li></ol></li></ol> 2. 유동 세포 계측법, 서쪽 오점, 그리고 면역 형광에 대한 세포의 준비 <ol><li> 24 시간 게시물 형질 세포를 수확하기 전에 epifluorescence에 현미경으로 형광을 확인합니다. </li><li> 유세포 분석을위한 세포의 준비 : <ol><li> 24-well/6-well 플레이트 0.5 ML / 2 ML 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 씻으십시오. </li><li> 50 μl/250 μL 0.05 % 트립신을 사용하여 세포를 분리합니다. </li><li> 200 μL / 1 ML DMEM 매체와 트립신을 중화. </li><li> 공동5 분 500 XG에서 원심 분리하여 llect 250 μl의 세포 (모두 24 잘 6 잘 플레이트), 웨스턴 블롯 분석을위한 나머지 셀 (1 ML)을 사용합니다. </li><li> 250 μL FACS 버퍼에 세포를 resuspend을 [PBS + 0.5 % (W / V) BSA + 2 mM의 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)] 유세포 분석을위한 얼음, 저장. 유동 세포 계측법 분석을 즉시하지 않을 경우 전지도 (PBS)에 1 % 파라 포름 알데히드에 고정 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 서양 얼룩 분석을위한 세포의 준비 : 유동 세포 계측법 분석을위한 세포의 준비와 병행 실시했다. <ol><li> 2 ML 얼음처럼 차가운 PBS와 1X 세포를 씻으, 세포 용해 버퍼 100 μL [10 MM 나트륨 인산염 완충액, pH가 6.95, 150 mM의 NaCl을 5 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 5 mM의 EGTA, 1 % 트리톤 X-100]을 추가하여 세포를 용해 . </li><li> 4에서 21,000 XG에서 10 분 동안 원심 분리하여 세포 파쇄물을 수집 ° C. </li><li> , 브래드 포드 단백질 분석에 의해 단백질 농도를 정량화 SDS-PAGE 레인 당 단백질의 동등한 양을로드하고 immunoblotting을위한 니트로 셀룰로오스로 전송할 수 있습니다. </li></OL&gt; </li><li> 면역에 대한 세포의 준비. <ol><li> 2 ML PBS로 3 배 세포를 씻어 상온에서 10 분 동안 3.7 % 파라 포름 알데히드 (PBS)에 1 ㎖의 세포를 수정 후, 5 분 동안 2 ML PBS로 3 배 씻는다. </li><li> 장착 매체를 사용하여 유리 슬라이드에 슬립 커버 장착합니다. 필요한 경우 매니큐어를 사용하여 coverslip에 가장자리를 밀봉. </li><li> 시험에 ° C 이전 4시에 슬라이드를 저장합니다. </li></ol></li></ol> 3. 유동 세포 계측법 및 면역 형광 현미경 <ol><li> 유동 세포 계측법은 베크 만 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 시안 488 nm의 장착 ADP, 405 nm의 및 642 nm의 고체 레이저를 사용하여 수행됩니다. 정상 회담 소프트웨어는 수집 및 분석에 사용됩니다. <ol><li> 표준 구슬을 사용하여 흐름 cytometer에를 보정합니다. </li><li> 게이트 라이브 셀 인구 리니어 스케일에 플롯 앞으로 분산 형 (FSC) / 옆으로 분산 (SSC). </li><li> 게이트 집계되지 않은 살아있는 세포 인구 플롯 전압 / FSC 펄스 폭. </li><li> 플롯 count/FL6 (CFP fluorescenc게이팅 비 집계 라이브 CFP-양성 세포에 대한 로그 스케일 E, 405 NM). </li><li> BiFC 강도에 대한 로그 스케일로 플롯 count/FL1 (YFP 형광, 488 nm의). </li><li> FSC, SSC, FL1과 FL6 사진 배율 튜브 (PMT) 각 신호에 대한 임계 값을 설정하는 전압을 조정, YFP - CFP 더블 부정적인 샘플을 실행합니다. </li><li> 실행 (두 YFP +와 CFP +)에 대한 샘플 향후 오프라인 보상을 양성 하나 </li><li> 분석을위한 최소 10,000 게이트 이벤트 (비 집계 라이브 CFP + 세포) 취득. </li></ol></li><li> . 면역 형광 현미경 자이스 혈구 LSM 510 공 촛점 현미경 참고를 사용하여 수행됩니다 : 그것은 모든 설정을 사이에 일관성 (예 : 줌, 핀홀, 검출기 이득 증폭기 오프셋, 프레임 크기, 스캔 속도, 스캔 평균 및 레이저 파워)를 유지하는 것이 중요합니다 모든 데이터의 적절한 비교를위한 샘플입니다. </li></ol> 4. 데이터 분석 (정상 소프트웨어를 사용하여 수행) <ol><li> acquisit에 대한 것과 비슷한 분석 프로토콜을 설정적절한 게이팅 이온 : 살아있는 세포에 대한 FSC / SSC 도트 플롯 문 1. 집계되지 않은 살아있는 세포에 대한 게이트 1 FSC / 펄스 폭 문 2. 비 집계 CFP + 라이브 세포 게이트 3 수 / CFP의 문 3. </li><li> YFP와 YFP +와 CFP + 싱글 양성 세포를 사용하여 CFP 신호를 보상한다. </li><li> CFP / YFP 양성 세포를 다시 확인 커트 오프 라인. </li><li> 수출 YFP는 CFP의 형광 강도 (MFI) + 데이터 플롯 Excel로 세포를 의미한다. </li><li> AKAP-LBC, PDE4D3의 발현에 YFP MFI을 정상화하고, 서양 얼룩에 의해 결정, α-tubulin에 컨트롤을로드. </li></ol>

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<li>Stumpf, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+the+size+of+the+human+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Estimating the size of the human interactome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6959-6964 (2008).</li>
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</ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

BiFC 단백질 - 단백질 상호 작용을 연구하는 간단하고 민감한 방법입니다. 이 방법은 새로운 단백질 - 단백질 상호 작용을 식별하는 데 사용할 수 없습니다, 그러나, 그것은 세포 내부의 단백질 - 단백질 상호 작용을 확인하고 기능적 특성을 연구하는 것이 특히 편리하다; 같은 단백질 - 단백질 상호 작용 사이트의 매핑 단백질 복합체의 세포 내, 등, 그리고 단백질 - 단백질 상호 작용을 조절 수있는 작은 분자 / 펩타이드의 선별합니다. VN 및 VC 조각이 아닌 형광 때문에, 배경 형광 따라서이 분석의 감도를 돕고, 낮은 것입니다. 시간이 VN-단백질 VC-단백질 상호 작용을 성숙 / 안정하는 데 필요한, ​​따라서 단백질 - 단백질 상호 작용을 시각화하는 지연이, 최적의 시간 점 따라서 경험적으로 결정해야 할 수도 있습니다. 그것은 VN-단백질 VC-단백질 상호 작용은 되돌릴 수 없습니다 것 또한 주목해야한다, 그러므로 유감스럽게도 현재의 금성 BiFC으로이 분석은 t 적합하지 않습니다 생성단백질 - 단백질 상호 작용의 오 ...

650,000 단백질 - 단백질 상호 작용은 정상 세포의 기능 1,2을 유지하는 중요한 역할을 놀고, 인간 interactome에 존재하는 것으로 추정된다. 공동 immunoprecipitation의 외에 (CO-IP), 금 표준 (PCA) 세포 안쪽으로 단백질 - 단백질 상호 작용 검출의 감도를 개선하기 위해 개발되었습니다, 세포 파쇄물에서 여러 단백질 조각 보완 분석 실험 단백질 - 단백질 상호 작용을 연구한다. 기술은 포스터 공명 에너지 전달 (FRET), 생물 발광 공명 에너지 전달 (브렛) 및 이분자 형광 보완 (BiFC) 4,5 (가) 있습니다. 각각의 잠재적 인 상호 작용 단백질 파트너 (이 예에서 우리는 AKAP-LBC 및 PDE4D3 사용)에 융합되어, BiFC는 형광 단백질의 두 조각 (YFP 변형 여기에서 우리는 비너스를 사용한다)의 촉진 협회를 기반으로합니다. F로 시각화 할 수 있습니다 기능 형광 세포 결과 안에 관심의 두 단백질의 상호 작용라이브 또는 고정 세포 6,7,8 중 하나를 사용하여 luorescence 현미경. 다른 PCA는 비교 BiFC는 살아있는 세포에서 세포 지방화를 공부하는 잠재력에 민감하고 덜 기술적 도전이다. 이 기술의 주요 단점은 있지만 한 번 형성된 형광 단백질 복합체가 반전 될 수 있다는 것입니다. 따라서 동적 단백질 - 단백질 상호 작용을 연구하는 좋은 방법은 아닙니다. 본 논문에서, 우리는 금성의 형광 강도를 모니터링하여 AKAP-LBC와 PDE4D3의 상호 작용 사이트를 매핑하는 BiFC 사용합니다. (자동 높은 처리량 기계를 사용하여 수행되지 않은 경우) 시간과 노동 집약적 형광 현미경을 사용하여 기존 분석에 비해 유동 세포 계측법은 짧은 시간 9을 통해 이기종 인구 세포의 수천의 간단한 정량 분석을 제공합니다 10. 여기 유세포-BiFC 분석 및 공동 IP 전통의 나란히 비교를 실시함으로써, 우리는 보여 그 이methods는 비교 데이터를 제공하지만, 유세포 BiFC 분석은 시간을 덜 소모하고 그 세포가 제한 될 때 더 유용 할 수 있습니다 적은 재료를 사용하고 있습니다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>Dulbecco&#8217; s 수정된 독수리&#8217; s media (DMEM)</td><td>Invitrogen</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin-Streptomycin (pen/strep), 100x</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Flag 항체</td><td>Sigma</td><td>M2, F1804</td><td></td></tr><tr><td>Anti-HA 항체</td><td>Covance</td><td>16B12, MMS-101R</td><td></td></tr><tr><td>&#945;-tubulin</td><td>Sigma</td><td>DM1A, T9026</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFP 항체</td><td>Clontech</td><td>632569</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 플레이트, 6-웰 조직 배양 처리된</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130184</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293T 세포</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>Maxiprep 플라스미드 정제 키트, 고속</td><td>Qiagen</td><td>12663</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#8217; s 인산염 완충 식염수(DPBS), 멸균 1x</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v)</td><td>Gibco</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>폴리스티렌 원형 바닥 튜브</td><td>FACS 염색 BD Biosciences</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Fisher Scientific</td><td>S74337MF</td><td></td></tr><tr>DAPI <td>Invitrogen</td><td>P-36931</td><td>로 금 퇴색 방지 시약 연장</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost plus 현미경 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Fisherfinest 프리미엄 커버 유리</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5P</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>CO2 에어 재킷 인큐베이터</td><td>NuAIR DH 자동 흐름</td><td></td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경 LSM510 META</td><td>Carl Zeiss, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>전기영동 및 전송 장치</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cyan ADP 유세포 분석기</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

이분자 형광 보완의 유세포 분석 : 단백질 - 단백질 상호 작용을 연구하는 높은 처리량 정량 방법

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

세포 내부의 단백질 - 단백질 상호 작용을 연구하는 방법 중, 이분자 형광 보완 (BiFC)은 비교적 간단하고 민감합니다. BiFC는 형광 단백질의 두 가지 비 형광 조각을 (금성, 노란색 형광 단백질의 변형은, 여기에 사용되는)를 사용하여 형광의 생산을 기반으로합니다. 비 형광 비너스 조각은 (VN 및 VC) 때문에 VN-AKAP-LBC-VC-PDE4D3 상호 작용과 기능 형광 단백질의 형성에 형광 항복, 두 개의 상호 작용하는 단백질 (이 경우, AKAP-LBC 및 PDE4D3)에 융합 세포 내부. BiFC 단백질 복합체의 세포 내 형광 강도에 따라 단백질 상호 작용의 강도에 대한 정보를 제공합니다. 그러나 단백질 - 단백질 상호 작용의 강도를 정량화하기 위해 현미경을 사용하여 BiFC 분석은 시간과 단백질 발현 및 상호 작용의 이질성으로 인해 다소 주관적이다. 유세포 흐름을 결합하여BiFC 방법론과 분석은 형광 BiFC 단백질 - 단백질 상호 작용 신호는 정확하게 짧은 시간에 세포의 대량을 위해 측정 할 수 있습니다. 여기, 우리는 AKAP-LBC와의 상호 작용에 필요한 PDE4D3의 영역을 매핑하기 위해이 방법의 응용 프로그램을 보여줍니다. 이러한 높은 처리량 방법은 단백질 - 단백질 상호 작용을 조절 심사 요소에 적용 할 수 있습니다.

AKAP-LBC 및 PDE4D3 구조 (그림 1B)는 각각 VN 및 VC 조각에 융합되었다. AKAP-LBC 및 기능 YFP 형광 (그림 1A)의 PDE4D3 결과의 상호 작용. 여기에서 우리는 PDE4D3의지도 AKAP-LBC-결합 부위에 BiFC 메서드를 사용합니다. 상류 보전 지역 1 (UCR1), 상류 보전 지역이 (UCR2)와 촉매 영역 (CAT) PDE4D3의 바인딩 사이트를 선별​​ 사용 하였다 따라서 전체 길이 (FL), UCR1 및 UCR2 플러스 CAT, PDE4 가족 단백질 사이에 보존됩니다 AKAP-LBC합니다. 다른 강도 (그림 1C)와 함께 VN-AKAP-LBC 및 형광 HEK 293T 세포 결과에 VC-PDE4D3 - 단편 식입니다. BiFC는 UCR1과 UCR2 모두 + CAT AKAP-LBC와 PDE4D3의 상호 작용에 기여하는 것을 나타냅니다. AKAP-LBC-UCR1 상호 작용으로 인한 큰 형광 강도는 ...

이분자 형광 보완의 유세포 분석은 단백질 - 단백질 상호 작용을 연구하는 높은 처리량 정량 방법을 제공합니다. 이 방법은 매핑 단백질 결합 부위와 단백질 - 단백질 상호 작용을 조절하는 요인을 선별 적용 할 수 있습니다.

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

본 실험 절차의 전반적인 목적은 ACAP LBC와 PDE4D3의 상호작용 부위를 매핑하는 것입니다. 이는 유세포 분석법을 이용하여 생분자 형광 상보성(Biomolecular Fluorescence Complementation, BiFC)의 평균 형광 강도를 측정함으로써 수행됩니다. 이를 위해 세포에 형광 리포터 단백질의 N-말단 또는 C-말단 부분에 융합된 ACAP LBC 및 PDE4D3 단편을 형질전환합니다.그런 다음 단백질 단편들이 상호작용하는지 평가하기 위해 Venus 유세포 분석을 수행하여 형광을 확인합니다. 단백질 단편들이 상호작용하지 않으면 형광이 검출되지 않습니다. 상대적인 단백질 발현 수준을 결정하기 위해 보완적인 웨스턴 블롯 분석을 수행합니다.단백질-단백질 상호작용의 강도는 YFP 평균 형광 강도를 단백질 발현 수준으로 정규화하여 계산합니다. 분석 결과, PDE 43의 ACAP LBC 결합은 PDE 43 내의 여러 영역, 주로 상위 보존 영역 1(UCR 1)을 통해 매개되는 것으로 나타났습니다. 공동 면역침전법(co-immunoprecipitation)이나 현미경을 이용한 BRET과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 상대적으로 간단하고 민감하며, 수많은 세포를 빠르게 스크리닝할 수 있다는 점입니다.이 방법은 단백질-단백질 상호작용에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라, 신약 개발을 위해 단백질-단백질 상호작용을 조절하는 인자를 스크리닝하는 데에도 활용될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 연구자들은 선형 B 반응을 결정해야 하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 서로 다른 단백질 단편을 사용한 결과를 상호 비교하기 위해서는 구성물의 발현 수준이 유사해야 합니다.여기서 설명하는 실험에서는, ACAP LBC 전체 길이에 융합된 YFP 유도체 Venus의 N-말단 단편과, 다음 중 하나에 융합된 Venus의 C-말단 단편(전장 PDE E 43, PDE E 43의 상류 보존 영역 1(UCR 1), 또는 PDE 43의 상류 보존 영역 2 및 촉매 영역(UCR 2 + CAT))을 세포에 공동 형질전환(cot transfection)합니다. 형질전환 전날, 6-웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 2 mL의 완전 성장 배지가 포함된 HEC 293 T 세포를 1.2 × 10⁵개씩 분주합니다. 대조군 3개 웰과 각 테스트 조건당 3개 웰을 분주합니다.37°C, 5% 이산화탄소 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, BC 혈장 DNA 제작물과 마커로서 BS C 제작물과 함께 공동 형질전환될 CFP 벡터의 형질전환을 준비합니다. 각 조건에 따라 적절한 양의 DNA를 250 µL의 Optum M1 무혈청 배지에 첨가합니다.멸균 튜브에 DNA 혼합물을 분주하며, 튜브 하나로 웰 3개를 트랜스펙션하기에 충분합니다. 그 다음, 희석된 DNA 혼합물 1 µg당 3 µL의 TransIT-L1 시약을 첨가하고 파이펫으로 부드럽게 섞어준 뒤 실온에서 30분간 인큐베이션합니다. 인큐베이션 후, 트랜스펙션 혼합물 250 µL를 세포에 한 방울씩 떨어뜨려 주고 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 24시간 동안 인큐베이션합니다.형광 현미경(epi fluorescence microscope)으로 형광을 확인하여, BC 신호는 황색 형광을, 형광 전이 효율 보고는 CFP 형광을 나타내는지 확인합니다. 유세포 분석(flow cytometric analysis)을 위해 세포를 준비하려면, 먼저 2 mL의 ice cold PBS로 세포를 세척한 다음, 0.05% Trypsin 250 µL를 첨가하여 37 °C에서 2~5분 동안 배양하여 세포를 분리합니다. 그 후 현미경을 사용하여 세포가 분리되었는지 확인합니다.세포가 탈락되면 1 mL의 DMEM을 사용하여 트립신을 중화합니다. 다음으로, 1 mL의 세포 현탁액을 마이크로 원심분리 튜브 하나에 옮기고, 0.25 mL의 세포 현탁액을 두 번째 마이크로 원심분리 튜브에 옮깁니다. 튜브를 500 xg에서 5분 동안 원심분리합니다.250 µL의 시료는 유세포 분석을 위해 추가 처리됩니다. 1 mL의 시료는 원심분리 후 재현탁 단계와 병행하여 수행할 웨스턴 블롯 분석을 위해 얼음 위에 보관하십시오. 세포를 250 µL의 FACS 버퍼에 현탁하여 얼음 위에 둡니다. 유세포 분석을 즉시 수행하지 않을 경우, PBS 내의 1% 파라포름알데히드(Paraformaldehyde)로 세포를 고정할 수 있습니다. 유세포 분석은 488 nm, 405 nm 및 642 nm 고체 상태 레이저가 장착된 Beckman Coulter CytoFLEX를 사용하여 수행하며, 데이터 수집 및 분석에는 Summit 소프트웨어를 사용합니다. 표준 비드를 사용하여 유세포 분석기를 보정한 후, 선형 스케일에서 전방 산란광(FSC) 대 측방 산란광(SSC)을 도식화하고 살아있는 세포 집단을 게이팅합니다.다음으로 응집되지 않은 살아있는 세포군에 대해 전압 펄스 너비 대비 SSC를 플롯하고 게이트를 설정하십시오. 그런 다음, 이 기기의 405 FL 6에서 로그 스케일로 측정된 CFP 형광 대비 FSC를 선형 스케일로 플롯하고, 응집되지 않은 살아있는 CFP 양성 세포에 게이트를 설정하십시오. 마지막으로, BC 강도를 시각화하기 위해 이 기기의 488 nm FL 1에서 로그 스케일로 측정된 YFP 형광 대비 FSC를 선형 스케일로 플롯하십시오.다음으로, Y-F-P-C-F-P 이중 음성 샘플을 실행하고 F-S-C-S-S-C FL 1 및 FL 6 광전자 증배관(PMT) 전압을 조정하여 각 신호의 임계값을 설정합니다. 이어서, 향후 오프라인 보정을 위해 YFP 및 CFP 단일 양성 샘플을 모두 실행합니다. 이때 게이트된 이벤트(gated events)를 최소 10,000개 이상 획득해야 합니다.마지막으로, 데이터 수집 절차에 따라 실험 샘플의 데이터를 수집합니다. 분석 프로토콜을 획득 설정에 맞춰 구성하며, 생존 세포를 확인하기 위해 FS CSC 도트 플롯에서 게이트 1을 설정합니다. 응집되지 않은 생존 세포를 위해 게이트 1의 FSC 펄스 도트 플롯에서 게이트 2를 설정하고, 응집되지 않은 ccfp 양성 생존 세포를 위해 게이트 2의 ccfp FSC 도트 플롯에서 게이트 3을 설정합니다.YFP 및 CFP 단일 양성 세포를 사용하여 YFP CFP 도트 플롯에서 YFP 및 CCFP 신호를 보정한 후, CFP 및 YFP 양성 세포의 컷오프 라인을 결정합니다. CFP 양성 세포의 YFP 평균 형광 강도 또는 MFI를 데이터 플로팅을 위해 엑셀로 내보낸 다음, 엑셀에서 웨스턴 블로팅으로 결정한 ACAP LBC PDE E 43의 발현 수준과 로딩 컨트롤인 alpha tubulin에 대해 Y-F-P-M-F-I를 정규화하여 YFP 평균 형광 강도의 선형 범위를 결정합니다. HEC 2 93 세포에서 CFP를 VN ACAP L BBC 및 다양한 양의 VC PDE E 43과 함께 공동 형질전환하였으며, 이 비디오에서 설명한 바와 같이 바이플로우 사이토메트리를 사용하여 상호작용을 평가하였습니다. 이 플롯은 형질전환된 VC PDE E 43의 함수로서 VC PDE E 43 발현의 상대적 배수 변화를 보여줍니다.파란색 사각형으로 표시된 CFP 양성 세포 내 Venus의 평균 형광 강도는 VCDE 43 발현과 상관관계가 있었으며, 빨간색 삼각형으로 표시된 웨스턴 블롯 이미지 분석으로 결정된 발현 수준과 일치했습니다. 초록색 사각형으로 표시된 샘플들 간에는 유사한 CFP 평균 형광 강도가 관찰되었으며, 이는 세포 간 변이를 제한하기 위한 음성 대조군으로 사용되었습니다. 이러한 결과는 BS e의 평균 형광 강도를 측정하여 ACAB LB C PDE 43 상호작용을 정량화하기 위한 유세포 분석법의 사용을 검증하는 동시에, PDE E 43 내 ACAP LBC 결합 부위를 매핑하기 위한 스크리닝에 사용되는 BIC 컨스트럭트의 적절한 양을 결정하며 PDE E 43 fl 전장 단백질과 ACAP LBC 상호작용의 BIC 분석을 수행하는 데 유효함을 보여줍니다.여기에 표시된 것과 같이 이 방법을 사용하여 PDE 43의 UCR one 영역과 PDE 43의 UCR two 및 CAT 영역을 평가하였습니다. vn ACAP LBC 및 VC PDE 43 UCR two plus CAT의 발현은 VC PDE 43 FL 및 VC PDE 43 UCR one과 비교했을 때 더 낮은 BC 신호를 나타냈으며, 모든 flow 샘플에서 유사한 단백질 발현이 관찰되었고 평균 형광 값은 ACAP LBC PDE 43 및 alpha tubulin의 상대적 발현 수준으로 정규화되었습니다. 따라서 정규화된 B-C-M-F-I는 ACAP LBC PDE 43 FL과 ACAP LBC PDE 43 UCR R one 사이에는 형광 강도에 차이가 없으나, ACAP LBC PDE 43 UCR two plus CAT 상호작용의 경우 신호가 훨씬 낮음을 나타냅니다.이러한 결과는 PDE 43에 ACAP LBC와 상호작용하는 여러 영역이 존재하며, PDE 43 UCR R one이 ACAP LBC와의 주요 상호작용 영역임을 시사합니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 BP C의 유세포 분석을 통해 단백질-단백질 상호작용을 연구하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 수행할 때, 유사한 단백질 발현과 선형 BP C 응답을 얻기 위해 사용되는 BP C 구조체의 정확한 양을 결정하는 것이 중요합니다. 이 절차 이후, PDE 40 D three 내의 어떤 아미노산이 관여하는지 확인하기 위해 펩타이드나 risk와 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.ACAP와 RBC의 상호작용입니다.

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Research

연구

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Biology

생물학

단백질의 subcellular 지방화는 세포 신호의 spatio - 시간적 규정을 결정 중요합니다. 여기, 우리는 세포에있는 단백질의 공간적 상호 작용을 모니터링을위한 간단한 방법으로 bimolecular 형광 complementation (BiFC)를 설명합니다.

Bimolecular 형광 Complementation

우리는 공장에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 테스트하는 기술을 개발했습니다. 노란색 형광 단백질 (YFP은) 2 비 중복 조각으로 분할합니다. 각 조각은 융합 단백질의 표현을 활성화, 게이트웨이 시스템을 통해 관심의 유전자에 프레임에 복제됩니다. 심리 단백질이 상호 작용을 때 YFP 신호의 Reconstitution에만 발생합니다.

게이트웨이 가능 Bimolecular의 형광 Complementation (BiFC) 시스템을 사용하여 공장에서 단백질 상호 작용의 검출

이 비디오에서는 형태 특이적 단일 도메인 항체를 사용하여 특정 단백질 이량체를 검출하고 분리하는 BiCAP(bimolecular complementation affinity purification)을 시연했습니다.

Bimolecular Complementation Affinity Purification - 두 개의 상호 작용하는 단백질을 분리합니다.

생체 내에서 단백질 복합체의 형성은 이분자 형광 보완하여 시각하실 수 있습니다. 상호 작용 파트너는 형광 태그의 보완적인 부분에 융합 일시적으로 담배 잎으로 표현, 두 단백질의 근접에 따라 재구성 형광 신호의 결과로되어있다.

담배 원형질체 및 잎에 이분자 형광 보완에 의해 시각 단백질 - 단백질 상호 작용

우리는 단일 T 림프구에서 힘 조절 단일 수용체-리간드 결합 역학과 칼슘 신호의 실시간 이미징을 동시에 측정하는 기술을 설명합니다.

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속됨 부정맥은 종종 하나 이상의 이온 채널의 표면에 전달 변경 돌연변이에 의해 야기된다. 여기서는 TSA-201 세포에서 발현 된 재조합 이온 채널의 상대적 총 세포 표면 단백질 발현의 정량 분석을 제공하기 위해 유세포 적응.

유동 세포 계측법을 사용하여 재조합 이온 채널의 상대 셀 표면 및 전체 식의 결정

이 원고는 분자 보완성 친 화력 정화 (BiCAP)에 대 한 프로토콜을 설명합니다. 이 새로운 방법은 경쟁 바인딩 파트너와 함께 형성 된 복합물 뿐만 아니라 유엔 complexed 개별 단백질을 제외 하는 동안 특정 격리 및 어떤 두 상호 작용 단백질의 다운스트림 proteomic 특성화를 촉진 한다.

해 다중 단백질 신호 복합물 분자 보완성 친 화력 정화 (BiCAP)에 의해

이 프로토콜 중재-셀 상호 작용, 즉 단백질 세포 접합, 살아있는 세포에 직접에 단백질 간의 상호 작용을 조사 하는 형광 변동 분광학 기반 방식을 설명 합니다. 우리 악기 교정, 데이터 수집 및 분석, 보정 가능한 인 위 소스에 자세한 지침을 제공 합니다.

셀 연락처에서 단백질 단백질 상호 작용의 형광 변동 분광학 분석 결과

본 문서는 S. 세레비시아 및 HEK293T 세포 모두에서 단백질 자가 조립을 정량화하는 FRET 기반 유동 세포 분석 프로토콜에 대해 설명합니다.

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여기에서, 우리는 세포 또는 마이크로베시클의 막과 단백질의 상호작용을 특성화하기 위한 일련의 방법을 기술한다.

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이 프로토콜은 질량 측광법과 새로운 미세유체역학 시스템을 결합하여 저친화성 단백질-단백질 상호 작용을 조사합니다. 이 접근법은 용액에서 고도로 농축된 복합체의 빠른 희석을 기반으로 하며, 이를 통해 저친화성 측정이 가능하고 질량 측광법의 적용 가능성이 넓어집니다.

Microfluidics와 질량 광도계를 결합하여 Micromolar 농도에서 단백질 복합체 형성 분석

배우세요 이분자 형광 보완과 유세포 분석을 결합한 고처리량 단백질 상호작용 정량법을. AKAP-Lbc와 PDE4D3 결합 영역을 신속하게 분석하는 이 기술은 살아있는 세포 내 단백질 기능 연구에 활용됩니다.

이분자 형광 보완의 유세포 분석 : 단백질 - 단백질 상호 작용을 연구하는 높은 처리량 정량 방법

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