Name: 근육 재생의 마우스 모델에서 유도 만능 줄기 세포 유래 메소안지오블라스트 와 같은 근생 성 전구의 이식 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: 학습하세요 iPSC 유래 근생성 전구세포의 근육 재생 마우스 모델 이식 방법을. 이 기술은 근영양증 치료를 위한 세포치료 전략 개발에 활용됩니다.

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저자는 줄리오 코스수, 마르티나 라가지와 도움이 되는 토론과 지원을 위한 전체 실험실, 그리고 제프 체임벌린에게 MyoD-ER 벡터를 친절하게 제공한 것에 대해 감사드립니다. 살아있는 동물과 관련된 모든 실험은 모든 관련 규제 및 기관 기관, 규정 및 지침에 따라 완료되었습니다. 저자 실험실에서 작업은 영국 의학 연구 위원회에 의해 지원됩니다, 유럽 지역 사회 7 프레임 워크 프로젝트 Optistem 및 바이오 디자인과 이탈리아 Duchenne 부모 프로젝트.

1. 근생 및 이식 잠재력 평가
<ol><li>
시험관 내: MyoD 유도 분화<ol>
<li>타목시펜 유도할 수 없는 MyoD-ER 렌티바이러스 벡터로 유도된 IDEMs의 안정적인 세포줄을 생성하여 감염의 복합성을 적시(MOI; 예를 들어, 1, 5 및 50) 1.1.9(MyHC)에 기재된 염색을 절차의 효율의 결과로 사용한다.</li>
		<li>3.5cm 접시에 1ml의 5ml의 트리겔을 코팅하고 37 °C에서 30 분 동안 배양하십시오.</li>
		<li>3.5cm 조직 배양접시에서 중간, 종자 1 x 105 MyoD-ER 변환 된 IDEM으로 접시를 두 번 세척하고 성장 배지에서 37 °C에서 배양하십시오.</li>
		<li>세포가 1~2일 만에 합류에 도달한 다음 1μM 4OH-타목시펜을 성장 배지(1st dose)에 추가할 것으로 예상합니다.</li>
		<li>24 시간 후, 1 μM 4OH-타목시펜 (2nd 및 마지막 복용량)으로 보충 된 분화 매체로 성장 배지를 교체하십시오.</li>
		<li>매체의 절반을 매일 신선한 분화 매체로 교체하십시오.</li>
		<li>매일 myotube 형성문화를 살펴본다.</li>
		<li>1 주일 후 (분화 매체에서 5 일), PBS로 부드럽게 접시를 씻어 RT에서 5 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드로 고정합니다.</li>
		<li>myosin 무거운 사슬에 대하여 항체로 염색하는 면역 형광을 수행 (MyHC) myotubes의 존재를 확인하기 위하여. 핵염료를 가진 카운터스테인(예 : Hoechst).</li>
	</ol>
</li>
</ol>분화의 효율은 MyHC 양성 세포 내부의 핵 백분율로 평가된다: 효율이 >50%인 경우 다음 단계로 진행한다.
<ol start="2"><li>
생체 내: 급성 근육 재생의 모델에 이식 근육 재생에 MyoD-ER IDEM의 생체 내 기여를 평가하기 위해, 세포는 이전에 조직 내부를 추적할 수 있게 해주는 녹색 형광성 단백질(GFP)에 대한 벡터 인코딩으로 표지된다. MyoD-ER GFP IDEM은 심근 절제술(예 : 심장 독소)으로 이전에 부상 성인 뮤린 근육으로 주입됩니다. 제노제닉(HIDEMs 등) 또는 유전자 조작/교정 세포에 대한 면역 거부를 피하기 위해서는 면역결핍또는 면역억제된 마우스를 사용해야 합니다.<ol>
<li>이식 일 전에 하룻밤 동안 1 μM 4OH-tamoxifen (수성 형태)를 추가 이식 및 퇴각 세포 24 시간 전에 10 mg / ml 타목 시펜 (liposoluble 형태)의 3.5 μl / g의 복막 주사로 동물을 후퇴.</li>
		<li>동물 시설에서 외과 적 절차를 조절하는 특정 지침에 따라 마우스에 마취 및 진통을 투여하십시오.</li>
		<li>100 μM 심장 독소의 25 μl을 주입 (CTX; 나야 mossambica mossambica에서; 주의: 잠재적으로 유해한 물질) 티비알리스 전방 (TA) 근육에.</li>
		<li>타목시펜과 CTX로 동물을 치료한 후 24시간, 트립시니화와 카운트에 의해 세포를 분리한다.</li>
		<li>5 분 동안 232 x g에서 세포를 원심 분리합니다.</li>
		<li>Ca2+및 Mg2+-free PBS, 원심분리기에서 세포 펠릿을 부드럽게 재연한 다음 Ca2+및 Mg2+-free PBS를 106 세포/30 μl의 최종 농도로 세척하여 각 주사의 최종 부피가 됩니다.</li>
		<li>29 G 또는 30 G 바늘을 사용하여 이전에 부상을 입은 근육에 세포 현탁액 30 μl을 주입하십시오. 근육에서 바늘을 제거 하는 동안 특정 관심을 지불 합니다. 바늘의 트랙을 통해 세포 현탁액을 흘리는 것을 피하면서 천천히 하십시오. 반대로 TA를 이식하고 대조군으로 사용하지 마십시오, Ca2 +의30 μl을 주입 - Mg   2+무료 PBS이식 하나의 조건을 복제.</li>
		<li>동물을 6일 추가로 치료하고진통제(예: 카프로펜)를 2일 더 투여한다.</li>
		<li>이식 후 14일 후에 근육을 제거합니다. 프로토콜 4 및 5에 상세한 대로 샘플을 처리하고 분석합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 근 이영양증의 마우스 모형에 있는 이식
이 이식 분석법은 근 이영양증의 마우스 모형에 있는 I뎀의 이식의 정도를 평가할 수 있습니다. 다음과 같이 취급되는 동물은 또한 질병 표현형의 기능적 개량에 대해 평가될 수 있다. 기능성 검사는 이식 후 2주에서 부터 수행될 수 있습니다. 이식을 향상시키기 위해 사전 이식 러닝 머신 운동을 수행하는 것을 고려 (프로토콜에 설명 된 대로 3) 및 / 또는 3 x(즉, 총 3 주사 / 근육)에 대한 3 주마다 연쇄 세포 주사를 수행.
<ol><li>근육 이식<ol>
<li>이식 일 전에 하룻밤 동안 성장 배지에 1 μM 4OH-tamoxifen (수성 제형)를 추가 이식 및 퇴각 세포 24 전에 24 mg / ml 타목 시펜 (liposoluble 제제)의 3.5 μl/g의 복막 내 주입동물을 퇴각.</li>
		<li>트립시화에 의해 분리, 카운트 및 원심 분리 에 세포를 232 x g에 5 분.</li>
		<li>Ca2+및 Mg2+-free PBS, 원심분리기및 Ca2+의펠릿을 다시 중단한 다음 Mg2+-무료 PBS를 106 세포/30 μl의 농도로 세척합니다.</li>
		<li>진통제를 투여하고 동물의 피부를 소독 (선택 사항) 포비도 요오드 또는 클로르치신 기반 소독제로. 이것은 또한 티파리스 전방 (TA), 위장혈증 (GC), 및 사두근 페모리스 (QC; 특히 광대 스 부종)근육을 국소화하는 데 도움이됩니다.</li>
		<li>29 G 또는 30 G 바늘을 가진 주사기를 사용하여 근육에 세포 현탁액 의 30 μl을 주입하십시오. TA의 경우, 경골에 비해 15° 경사로 근접 힘줄(두개골 방향)을 삽입한 바늘 2mm 의 바늘을 삽입하고 바늘을 후퇴시키면서 천천히 세포 현탁액을 주입합니다(근육 내부에 있는 바늘의 2mm를 비우세요). GC 및 QC의 경우, 주요 차이점은 GC에 대한 아킬레스 건의 심오텐스 접합부 위에 바늘 2mm의 코도나디알 삽입과 함께, QC에 대한 단면 힘줄(대퇴골에 대하여 15° 경사)을 반복한다. 바늘의 트랙을 통해 세포 현탁액을 흘리지 않도록 근육에서 바늘을 제거하는 동안주의를 기울이라. 문제 해결: 이식이 낮은 경우 3 x 105 세포/10 μl을 가진 청소년(1-2주 전) 마우스7을 주입하는 것을 고려합니다(이 경우 타목시펜은 피하 투여되어야 한다는 점에 유의하십시오).</li>
	</ol></li>
	<li>동맥 내 이식 프로토콜의 이 부분은 미뎀과 HIDEM이 동맥 순환에서 전달되는 능력의 평가를 허용하고, 혈관 벽을 교차하고, 사출 부위로 하류근육의 골격 근 재생에 기여한다.<ol>
<li>상기 와 같이 피트리트는 2.1.1 단계에서 상술한 동물과 세포를 후퇴한다.</li>
		<li>40 μm 세포 스트레이너로 트립시화 및 필터에 의한 분리 (타목시펜에 하룻밤 노출이 인접한 세포에서 myotube의 융합 및 형성을 구동 할 수있는 가능성 드문 경우에 세포 서스펜션에서 클러스터를 제거하기 위해) 카운트 와 원심 분리 셀 232 x g에서 5 분</li>
		<li>Ca2 +- 및 Mg2 +-무료 PBS, 원심 분리기에서 펠릿을 다시 한 다음 Ca 2 + 및 Mg2+무료 PBS0.2 인터내셔널에서 셀 펠릿을 세척하십시오. 106 세포/50 μl의 최종 세포 농도에 헤파린 나트륨(선택 사항)의 단위. 10% 특허 청색 염료(최종 농도: 일반 식염수 또는 Ca2+에서1.25 mg/ml, Mg2+-free PBS)를 용액에 추가하여 세포 현탁액의 분포를 시각화합니다.</li>
		<li>특정 기관 동물 시설에서 외과 적 절차를 조절하는 지침에 따라 마우스에 마취 및 진통을 투여하십시오.</li>
		<li>잉구이날 영역(대퇴 또는 스카파의 삼각형이라고도)을 면도하고 포비도네 요오드 또는 클로르헤시딘 기반 소독제로 피부를 소독합니다.</li>
		<li>정맥, 동맥 및 신경 (신경은 동맥과 정맥내측에 측면으로 놓이면) : 5-7mm 절개를하고 대퇴 골번드를 국소화하십시오.</li>
		<li>번들을 집게하는 결합 근막을 부드럽게 제거합니다.</li>
		<li>대퇴 정맥과 신경을 동맥과 분리하여 집게의 끝(또는 30 G 바늘)을 부드럽게 도입하고 구멍을 점진적으로 확대합니다. 문제 해결: 대퇴 정맥은 깨지기 쉽습니다: 대퇴동맥에서 분리하는 동안 집게로 꼬집지 않도록 주의를 기울이세요. 출혈의 경우, 멸균 거즈로 혈액을 배출하고 혈종을 용이하게하기 위해 마이크로 소작을 사용합니다.</li>
		<li>집게의 한 쪽 끝으로 동맥을 들어 올리고 다른 팁으로 동맥을 고정시하십시오.</li>
		<li>30G 바늘이 장착된 주사기로 동맥에 구멍을 뚫습니다. 약 5 μl/sec의 주입 속도로 클램프 영역의 셀 서스펜션 하류 50 μl을 주입하십시오. 문제 해결: 주사 전에 주사기의 세포를 조심스럽게 재중단: 주사기 내부의 세포 및 기포 형성의 침전을 피하는 것이 중요합니다. 대퇴동맥의 직경은 30G 바늘보다 약간 작습니다: 바늘을 삽입하는 동안 동맥을 트렁크리지 않도록 주의하십시오. 특허 블루 염료는 주입의 효과를 인식 할 수 있습니다 : 올바르게 주입하면 전체 사지가 빠르게 밝은 파란색으로 변합니다.</li>
		<li>천천히 사지의 혈류를 복원하기 위해 동맥에서 바늘과 집게를 제거합니다.</li>
		<li>필요에 따라 출혈 및/또는 소작을 피하기 위해 멸균 거즈로 압력을 가하십시오.</li>
		<li>상처를 봉합하고 마취에서 회복 될 때까지 동물을 모니터링합니다.</li>
		<li>3 일 동안 진통을 관리하고 매일 상처를 검사하십시오 (상처 감염의 경우 동물 시설 요원과 이에 대해 논의하고 필요에 따라 항생제를 투여하십시오).</li>
	</ol></li>
</ol>3. 이식 된 영양실조 동물에 대한 결과 조치 : 러닝 머신 테스트
세포 이식 후 2주부터 는 러닝머신 검사를 통해 처리된 마우스의 운동 용량의 기능적 개량화를 평가할 수 있다. 이 시험은 처리된 마우스의 운동 내성/지구력의 평가를 허용합니다. 마우스는 3 연속 기계 자극 (5 초마다 하나)의 시리즈 후 러닝 머신을 다시 참여하려고하지 않고, 5 초 이상 휴식 영역에 누워 있을 때 피로로 간주됩니다. 기준측정은 치료 약 1개월 전부터 시작되며, 각 실험된 동물의 개선을 평가하는 데 사용됩니다. 이 시험은 섬유 취약성, 힘 개선, 이식, 이식된 세포의 분화 및 이식된 근육의 형태학적 개량을 모니터링하기 위한 추가 적인 검사다음에 선행될 수 있다(토론 참조).
<ol><li>첫 번째 측정 전에 동물(일반적으로 3개의 그룹: 치료, 치료되지 않은 및 야생 유형/비 dystrophic 컨트롤)을 운동에 적응하십시오: 러닝머신을 10분 동안 6m/분의 속도로 설정합니다. 1주일 동안 격일로 절차를 반복합니다. 문제 해결: circadian 주기로 인해 편향을 피하기 위해 하루 중 같은 시간에 모든 측정값을 기록합니다.</li>
	<li>이전에 10 °의 경사로 설정 된 러닝 머신에 동물을 배치합니다.</li>
	<li>러닝머신을 켜면 6m/min의 시작 속도로 (동물이 운동을 시작할 의향이 없는 경우 부드러운 기계적 자극을 제공합니다).</li>
	<li>타이머를 시작하고 2 분마다 2 m / 분 속도를 늘립니다.</li>
	<li>동물이 러닝머신을 다시 교전하지 않고 5초 이상 휴식 지역에 놓이자마자 스틱으로 부드럽게 만져 운동의 재시작을 자극합니다(위 참조).</li>
	<li>각 동물의 성능(시간 및 거리)을 기록합니다.</li>
	<li>매주 또는 10일마다 측정값을 최소 3배 이상 반복합니다.</li>
	<li>이식 후 동일한 절차를 반복합니다.</li>
	<li>각 동물의 측정을 기준 성능과 비교하는 성능 데이터를 분석합니다. 그래프의 값을 기준선에 비해 평균 모터 용량의 백분율로 플롯하고 그룹을 비교하기 위해 적절한 사후 테스트 다음에 1-또는 양방향 ANOVA 테스트로 값을 분석하는 것이 좋습니다.</li>
</ol>문제 해결: 최소 5세, 유전자형 및 성냥이 일치하는 동물/그룹을 사용하고 이식 후 최소 3배 이상의 측정값을 반복합니다.
4. 이식된 근육의 세포 이식 및 분화 평가
이식 및 제어 근육은 적절한 시점에서 수확됩니다 (<2 단기 이식 분석을위한 일, 중기 2-3 주 및 장기 분석을위한 >1 개월). 이식된 세포가 GFP로 표지되는 경우에, 새로 고립된 근육에 있는 이식은 UV갖이 갖춰진 입체 현미경의 밑에 직접 형광에 의해 평가될 수 있습니다.
<ol><li>트라가찬스 잇몸에서 수직축을 따라 누워 오리엔테이션을 하고, 갓 분리된 근육(6% w/v)</li>
	<li>미리 냉각 된 isopentane에서 샘플을 탈수 1 분 동안 액체 질소에 2 분 이상 동결하고 저장을 위해 -80 ° C에 즉시 배치하십시오.</li>
	<li>극저온으로 샘플을 처리하여 편광 슬라이드에 7 μm 두께의 섹션을 얻습니다. 슬라이드의 대부분의 근육을 샘플링하여 30-40 섹션/슬라이드로 약 8-10 슬라이드를 수집합니다. 분자 생물학/생화학 작용을 수행하기 위해 1.5 ml 튜브로 일련의 섹션을 수집하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>실험 용 설정에 따라 다양한 면역 형광 염색으로 세포 이식을 평가하십시오. 예를 들어, Sgca-null/scid/bg 마우스에서 HIDEM 이식의 경우, 얼룩 섹션: a) 라빈 A/C에 대한 항체가 이식된 인간 세포 핵을 검출하는 경우; b) 근육의 전반적인 구조를 시각화하기 위해 라미닌에 대한 항체; 및 c) Sgca에 대한 항체는 영양실체 동물에 결석한 단백질의 기증자 유래 복원을 검출한다.</li>
	<li>정량화, 형광 현미경을 사용하여, 근육 섬유 내부 및 외부 근육 섹션당 기증자 핵의 수와 단면도당 기증자 유래 골격 근섬유의 수.</li>
</ol>5. 근육 조직 병리학
조직 병리학 적 분석은 이식 된 근육의 형태학적 구조의 평가를 허용합니다. 조직 구조의 건축적 개선은 세포 치료 접근법의 결과로 기대된다.
<ol><li>4°C에서 1시간 동안 4% 파라포름알데히드로 갓 분리된 근육을 수정합니다.</li>
	<li>오름차장저분(예: 7.5-15-30% w/v)으로 샘플을 탈수합니다.</li>
	<li>가장 높은 자당 용액에 하룻밤 근육을 둡니다.</li>
	<li>티슈 텍 OCT에 샘플을 포함, OCT가 고체 될 때까지 미리 냉각 된 isopentane에 배치 (샘플의 완전한 침지 방지), 적어도 2 분 동안 액체 질소에 동결하고 저장을위한 -80 ° C에 즉시 배치.</li>
	<li>상기와 같이 7 μm 두께의 단면을 얻기 위해 저온저온으로 샘플을 처리한다.</li>
	<li>표준 제조업체의 프로토콜에 따라 헤마톡시린과 에오신 또는 마슨의 트리크롬으로 섹션을 얼룩지게 합니다.</li>
</ol>헤마톡슬린과 에신 염색은 근육 재생의 특징을 계산할 수 있습니다. b) 단면 영역; c) 중앙 핵을 함유하는 근섬유의 개수. 마슨의 삼색은 이미지의 총 영역에서 골격 근섬유에 의해 점유 된 총 면적을 빼서 섬유색 지수를 계산하는 데 사용됩니다 : 결과 영역은 주로 근육의 결합 및 지방 침투를 반영합니다. 이미지에 대한 모든 분석은 측정 도구 및 셀 카운터 플러그인을 사용하여 ImageJ 소프트웨어(NIH)를 사용하여 수행될 수 있습니다.

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</ol>

F.S.T.는 국제 특허 출원을 출원했습니다(아니요. PCT/GB2013/050112) 이 문서에 설명 된 전략의 일부를 포함. 그는 자신의 연구를 위해 Promimetic 및 DWC 주식 회사에 의해 자금을 받았다.

iPSC는 자기 갱신 잠재력을 보존하면서 무기한 으로 확장될 수 있으므로 광범위한 세포계보(12)로분화하도록 지시될 수 있다. 이와 다른 이유로 iPSC 유래 줄기/전구 세포는 자가 유전자 및 세포 치료에 대한 유망한 원천으로간주됩니다(13)접근한다. 저자로부터 이전에 출판 된 작품은 백혈구 유래 MABs (IDEM)의 것과 유사한 표현형을 가진 iPSCs에서 마우스와 인간 근생 성 전조자의 생성과 근육 이영양증7의마우스 모델에서 근육 재생에 대한 효율적인 기여를보고했다.
IDEM 근생 전위를 최대화하기 위한 전제 조건은 세포내 근생인 묘드의 발현이다. 타목시펜유도할 수 없는 MyoD-ER 카세트와의 트랜스포션은 전체 배양에서의 활성화를 동기화하고 그 이후 생체 내에서 활성화할 수 있는 이점으로 표현식에대한 정확한 시간적 제어를 가능하게 했다. 근육당 세포의 단일 투여에 기초한 이식 전략(또는 대퇴동맥당)...

중안지오블라스트(MABs)는 복막1-3의하위 집합에서 유래된 혈관 관련 근육 전구체이다. 위성 세포 와 같은 표준 근육 전조를 통해 MABs의 주요 장점은4 동맥 내 전달 될 때 혈관 벽을 교차하는 능력에 상주하므로 세포 치료 프로토콜에서 골격 근 재생에 기여합니다. 이 기능은 근육 이영양증1,5,6의뮤린 및 개 모델 모두에서 평가및 확인되었습니다. 이러한 전임상 연구는 듀첸 근 위축증을 가진 아이들에 있는 기증자 HLA 동일 MABs의 동맥 이식에 근거를 둔 첫번째 인맨 단계 I/II 임상 시험을 위한 기초를 건설했습니다 (EudraCT No. 2011-000176-33; 현재 밀라노의 산 라파엘레 병원에서 가고 있습니다). 세포 치료 접근의 주요 장애물 중 하나, 세포의 수십억 전신의 근육을 치료 하는 데 필요한, "약용 제품"의 제한 된 증식 잠재력 (세포). 더욱이 최근에는 사지 거들 근이영양증 2D(LGMD2D)에서 발생하기 때문에 일부 형태의 근이영양증에 의해 영향을 받는 환자로부터 MAB를 얻을 수 없다는 것이 입증되었습니다. 오마이걸 #608099)7.
이러한 한계를 극복하기 위해 인간 및 뮤린 iPSC로부터 MAB와 같은 줄기/전구 세포를 유도하기 위한 프로토콜이 최근에 수립되었다7. 이 절차는 혈관 유전자 서명 및 면역 페노타입을 가진 쉽게 확장 가능한 세포 인구를 생성합니다 성인 근육 유래 MABs와 매우 유사합니다. 근생 조절 요인 MyoD의 발현시, 뮤린과 인간 IDEM(각각 MIDEM 및 HIDEM)은 말단 골격 근 분화를 겪습니다. 이러한 목표를 달성하기 위해 IDEM은 구성적으로 또는 유도 할 수없는 방식으로 MyoD 식을 구동 할 수있는 벡터로 변환 할 수 있습니다8-10. 에스트로겐 수용체(MyoD-ER)와 융합된 MyoD cDNA를 함유한 렌즈바이러스 벡터가 사용되어 타목시펜(에스트로겐 유사체) 투여 시 핵 전좌를허용한다(11). 이 전략은 고효율7을가진 비대성 다중 핵처리된 심포우의 형성을 초래한다. 특히, IDEM은 비종양성이며 이식 시 숙주 근육을 이식하고 분화할 수 있으며 다른벡터(예: 렌즈바이러스 또는 인간 인공 염색체)를 사용하여 유전적으로 교정할 수 있으며, 미래의 자가 치료 전략을 위한 길을 열어주고 있습니다. IDEM의 파생, 특성화 및 이식은 상기 간행물7에기재되었다. 본 프로토콜 논문은 IDEM의 체외 근생 분화를 평가하기 위해 수행된 분석서와 근육 재생의 마우스 모델에서 이식의 효능을 테스트하기 위한 후속 결과 측정을 상세히 설명합니다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>MegaCell DMEM</td><td>시그마</td><td>M3942</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>시그마</td><td>D5671</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>시그마</td><td>I3390</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>호스 세럼</td><td>유로클론</td><td>ECS0090L</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>태아 소 세럼</td><td>Lonza</td><td>DE14801F</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>PBS 칼슘/마그네슘 프리</td><td>론자</td><td>BE17-516F</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>시그마</td><td>G7513</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>시그마</td><td>P0781</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올</td><td>Gibco</td><td>31350-010</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ITS (인슐린-트랜스페린-셀레늄)</td><td>Gibco</td><td>51500-056</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>비필수 아미노산 솔루션</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>페르-인-솔</td><td>미드 존슨</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>페를릭시트</td><td>아벤티스</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>올레산</td><td>시그마</td><td>01257-10 mg</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>리놀레산</td><td>시그마</td><td>L5900-10 mg</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>인간 bFGF</td><td>Gibco</td><td>AA 10-155</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>성장 요인 감소 Matrigel</td><td>Becton Dickinson</td><td>356230</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>트립신</td><td>시그마</td><td>T3924</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>나트륨 헤파린</td><td>Mayne Pharma</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Trypan 블루 솔루션</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td>HARMFUL</td></tr><tr><td>특허 블루 염료</td><td>Sigma</td><td>19, 821-8</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>시그마</td><td>E-4884</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>TAAB</td><td>P001</td><td>유해한</td></tr><tr><td>타목시펜</td><td>시그마</td><td>T5648</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>4-OH 타목시펜</td><td>시그마</td><td>H7904</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>pLv-CMV-MyoD-ER(T)</td><td>애드진</td><td>26809</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cardiotoxin</td><td>Sigma</td><td>C9759</td><td>유해한</td></tr><tr><td>포비돈 요오드</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tragachant 껌</td><td>MP Biomedicals</td><td>104792</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>이소펜탄</td><td>VWR</td><td>24,872,323</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>티슈텍 OCT</td><td>사쿠라</td><td>4583</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>설탕</td><td>VWR</td><td>27,480,294</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>편광 유리 슬라이드</td><td>Thermo</td><td>J1800AMNZ</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>에오신 Y</td><td>시그마</td><td>E4382</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>헤마톡실린</td><td>시그마</td><td>HHS32</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Masson's 트리크롬</td><td>Bio-Optica</td><td>04-010802</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>마우스 안티 미오신 중쇄 항체</td><td>DSHB</td><td>MF20</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>마우스 안티 라민 A/C 항체</td><td>Novocastra</td><td>NLC-LAM-A/C</td><td>&NBSP;</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>시그마 Fluka</td><td>B2261</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>토끼 안티 라미닌 항체</td><td>시그마</td><td>L9393</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">MATERIALS AND EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Adsorbable antibacterial suture 4-0</td><td>Ethicon</td><td>vcp310h</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>30 G 바늘 주사기</td><td>BD</td><td>324826</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>트레드밀</td><td>콜럼버스 악기</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>스테로현미경</td><td>니콘</td><td>SMZ800</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td>Leica</td><td>DMIL LED</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Isoflurane 유닛</td><td>Harvad 장치</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>광섬유</td><td>Euromecs (네덜란드)</td><td>EK1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>가열 패드</td><td>Vet Tech</td><td>C17A1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>메스</td><td>Swann-Morton</td><td>11REF050</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>수술용 집게</td><td>파인 사이언티픽 도구</td><td></td><td>5/45</td></tr><tr><td>고온 소작기</td><td>Bovie Medical</td><td>AA01</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">MEDIA COMPOSITION</td></tr><tr><td colspan="4">미디어 구성은 아래에 자세히 설명되어 있습니다. HIDEMs 성장 배지: <ul> <li>MegaCell Dulbecco의 변형 독수리 배지 (MegaCell DMEM)</li> <li>5% 소 태아 혈청 (FBS)</li> <li>2 mM 글루타민</li> <li>0.1 mM &beta;-mercaptoethanol</li> <li>1% 비필수 아미노산</li> <li>5 ng/ml 인간 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)</li> <li>100 IU ml 페니실린</li> <li>100 mg/ml 스트렙토마이신</li> </ul> 또는 위의 시약 중 일부를 사용할 수 없는 경우 HIDEM을 다음에서 성장시킬 수 있습니다. <ul> <li>Iscove의 변형 둘베코 배지(IMDM)</li> <li>10% FBS</li> <li>2 mM 글루타민</li> <li>0.1 mM &beta;-mercaptoethanol</li> <li>1% 비필수 아미노산(NEAA)</li> <li>1% ITS(인슐린/트랜스페린/셀레늄)</li> <li>5 ng/ml human bFGF</li> <li>100 IU ml 페니실린</li> <li>100 mg/ml 스트렙토마이신</li> <li>0.5 &mu; M 올레산 및 리놀레산</li> <li>1.5 &mu; M Fe2+ (Fer-In-Sol)</li> <li>0.12 &mu; M Fe3+ (Ferlixit)</li> </ul> MIDEM 성장 배지: <ul> <li>DMEM</li> <li>20% FBS</li> <li>2 mM 글루타민</li> <li>5 ng/ml 인간 bFGF</li> <li>100 IU ml 페니실린</li> <li>100 mg/ml 스트렙토마이신</ li> </ul> 분화 배지: <ul> <li>DMEM</li> <li>2% 호스 세럼(HS)</li> <li>100 IU ml 페니실린</li> <li>100 mg/ml 스트렙토마이신</li> <li>2 mM 글루타민</li> </ul> </td></tr><tr><td colspan="4">표 1. 시약, 재료, 장비 및 매체 목록.</td></tr></tbody></table>

근육 재생의 마우스 모델에서 유도 만능 줄기 세포 유래 메소안지오블라스트 와 같은 근생 성 전구의 이식

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

환자 유래 iPSC는 미래의 자가 세포 치료 프로토콜을 위한 세포의 귀중한 근원일 수 있었습니다. iPSC 유래 근생 줄기/전구세포는 pericyte 유래 메소포아세포(iPSC 유래 메산지오블라스트와 같은 줄기/선조 세포: IDEM)와 유사한 근간이 영양증의 다른 형태에 의해 영향을 받는 환자로부터 생성된 iPSC에서 확립될 수 있다. 환자 별 IDEM은 다른전략(예: 렌즈피바이러스 벡터, 인간 인공 염색체)으로 유전적으로 교정될 수 있으며 근추행성 조절기 MyoD의 과발현시 근생 분화 가능성을 향상시킬 수 있다. 이 근생 잠재력은 그 때 특정 분화 분석과 시험관 내 평가되고 면역 형광에 의해 분석됩니다. IDEM의 재생 잠재력은 급성 및 만성 근육 재생을 표시하는 두 개의 대표적인 마우스 모델에서 근육 내 및 동맥 이식시 생체 내에서더 평가됩니다. 숙주 골격 근육에 IDEM의 기여는 이식 된 마우스에서 다른 기능 테스트에 의해 확인됩니다. 특히, 동물의 운동 능력의 개량은 러닝머신 테스트와 함께 연구된다. 세포 이식 및 분화는 이식된 근육에 대한 다수의 조직학적 및 면역형분석서에 의해 평가된다. 전반적으로, 본 논문은 현재 IDEM의 분화 능력을 평가하기 위해 활용되고 있는 분석 및 도구를 설명하며, 이식 방법과 세포 이식의 효능을 분석하기 위한 후속 결과 측정에 초점을 맞추고 있다.

보고된 대표적인 결과는 그림 1의워크플로우에 묘사된 시험관 내/생체 내 어비보 어서션의 주요 결과를 따릅니다. 48 시간 후 4OH-타목시펜 투여 후 MyoD 양성 핵은 문화권에서 MyoD-ER 변환 된 IDEM 내에서 식별 할 수 있습니다(도 2A). 그런 다음 세포가 융합되어 다핵된 심포우(그림2B)로분화한다. 급성 근육 손상의 뮤린 모델로 근육내 이식시, I뎀은 조직 재생에기여(도 3). 근육 이영양증의 뮤린 모델에 대한 유전자 및 세포 치료 설정에서 IDEM의 효능은 러닝머신 운동 내성 시험에 의해 평가되었다: 도 4는 야생형 MIDEM을 Sgca-null/scid/베이지 마우스로 이식한 후 얻은 결과를 나타내며, 처리된마우스7에서운동 용량의 개량화를 나타낸다. 이식된 근육의 Ex vivo 분석은 숙주 조직으로 IDEM의...

유도된 만능 줄기 세포 (iPSC)유래 한 근생 선조는 근 이영양증을 치료하는 세포 치료 전략에 대한 유망한 후보입니다. 이 프로토콜은 급성 및 만성 근육 재생의 마우스 모델에서 iPSC 유래 메소포아세포(근육 선조의 일종)의 이식 및 분화를 평가하는 데 필요한 이식 및 기능측정을 설명합니다.

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

이 절차의 전반적인 목표는 급성 및 만성 근육 재생 마우스 모델에서 유도만능줄기세포 유래 근육 전구세포의 근원성 잠재력을 평가하는 것입니다. 이는 먼저 인비트로(in vitro)에서 세포의 근원성 잠재력을 평가함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 근육 내 주사를 통해 세포를 이식하는 것입니다.또는, 미세수술 절차를 통해 대퇴동맥에 세포를 주입합니다. 마지막 단계는 처리된 동물의 근이영양증 표현형에 대한 기능적 개선을 평가하는 것입니다. 최종적으로, 면역형광 및 조직학 분석을 사용하여 공여 세포의 숙주 근육 내 생착과 기능적 기여도를 확인합니다.이 방법은 세포 치료법 연구와 같이 골격근 재생 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 함의는 근이영양증 치료까지 확장되며, IPS 세포 유래 전구세포를 이용한 자가 세포 치료 전략의 길을 열어줄 수 있습니다. 이 방법은 줄기세포 기반 치료에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라, 분자의 근육 내 또는 관절 내 전달 및 그에 따른 근육 기능과 형태학적 영향 분석과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다.우선, 조직 생검을 통한 획득 가능성이나 증식 잠재력과 같은 성체 줄기세포의 일부 한계점을 극복하는 방법으로 iPSL 배양이 활용될 수 있다는 점을 깨달았을 때 이 방법의 아이디어를 처음 얻게 되었습니다. 먼저, 근분화 조절 인자인 myo D를 과발현시키는 타모キシ펜(tamoxifen) 유도 벡터가 형질전환된 안정적인 세포주를 생성하십시오. 1% Matrigel로 코팅하고 배지로 세척한 플레이트에 형질전환된 세포를 분주하고, 성장 배지가 담긴 37 °C 인큐베이터에서 배양하십시오. 세포는 1~2일 이내에 합류(confluence) 상태에 도달해야 합니다.준비가 되면, 성장 배지에 1 µM의 hydroxy tamoxifen을 첨가합니다. 24시간 후, 성장 배지를 1 µM의 hydroxy tamoxifen이 보충된 분화 배지로 교체합니다.매일 배양물을 관찰하여 근관(myotube) 형성을 확인하고, 배양물이 준비되면 이틀에 한 번씩 배지의 절반을 신선한 분화 배지로 교체하십시오. 이렇게 준비된 배양물은 이식 분석(transplantation assays)에 사용됩니다.본 과정에서는 근육 내 이식의 생착 정도를 결정하기 위해 디스트로피 및 면역 결핍 마우스를 사용합니다. 이식 24시간 전에 타모キシ펜을 주입하여 동물을 전처리하십시오. 세포 또한 전날 밤 배양액에 타모キシ펜을 첨가하여 전처리해야 합니다.이식 당일, 트립신으로 분리한 세포를 계수하고 원심분리한 후, PBS로 한 번 세척하고 칼슘과 마그네슘이 없는 PBS에 10⁶ cells/30 µL 농도로 부유시킵니다. 동물을 마취하고 피부를 소독한 후, 전경골근(tibialis anterior muscle)의 위치를 찾습니다. 근위 건의 삽입 지점을 확인하고 바늘을 삽입합니다.이 지점에서 2 mm 아래에 팁을 위치시키십시오. 경골(tibia) 대비 15도 경사로 바늘을 5 mm 삽입하고, 바늘을 서서히 빼내면서 세포 현탁액을 천천히 주입하십시오. 바늘이 근육 내에 2 mm 남아 있을 때 주사기를 비우십시오.바늘의 경로를 통해 세포 현탁액이 유출되지 않도록 근육에서 바늘을 제거할 때 주의하십시오. 동일한 절차에 따라, 위장관 빈혈 주사는 아킬레스건과 대퇴사두근의 근건 접합부에서 2 mm 위에 수행합니다. 대퇴 주사는 동맥 내 이식을 위해 원위 건에서 2 mm 위에 수행합니다.앞서 설명한 대로 동물과 세포를 타목시펜으로 전처리합니다. 이식 준비가 되면, 원심분리 전 여과 과정을 거치는 것 외에는 이전과 동일한 방식으로 세포를 준비합니다. 펠렛을 칼슘과 마그네슘이 없는 PBS에 재현탁하고, 세포 현탁액의 분포를 시각화하기 위해 10% patent blue 염료를 첨가합니다.주사기 내의 세포를 조심스럽게 재현탁하고 주입 전 모든 기포를 제거하십시오. 마취 후, 표시된 대로 해당 부위를 제모하고 소독한 다음, 5~7mm 절개를 가하여 대퇴 신경다발을 찾습니다. 핀셋을 사용하여 다발을 덮고 있는 결합 근막을 부드럽게 제거하십시오. 다음으로, 핀셋 끝을 대퇴 정맥과 신경, 그리고 동맥 사이에 부드럽게 삽입하고 구멍을 점진적으로 넓혀가며 대퇴 정맥과 신경을 동맥으로부터 조심스럽게 분리하십시오.대퇴정맥은 취약합니다. 대퇴동맥에서 분리하는 동안 정맥이 집히지 않도록 주의하십시오. 분리가 완료되면, 포셉의 한쪽 끝으로 동맥을 들어 올리고 다른 쪽 끝으로 동맥을 클램프로 고정하십시오.30 G 바늘을 사용하여 동맥을 천자하고, 클램프 처리된 영역의 하류 쪽에 세포 현탁액 50 µL를 초당 약 5 µL의 주입 속도로 주입합니다. 바늘과 포셉을 동맥에서 천천히 제거하여 사지로의 혈류를 복구합니다. 출혈을 방지하기 위해 멸균 거즈로 압박하거나 필요에 따라 소작합니다.특허 청색 염료(patent blue dye)를 사용하면 주사가 정확한 위치에 이루어졌는지 즉시 확인할 수 있으며, 정확하게 주입되었다면 사지 전체가 빠르게 연한 파란색으로 변합니다. 상처 부위를 봉합하고 동물이 회복될 때까지 관찰하십시오. 3일 동안 진통제를 투여하고 매일 상처 부위를 검사하십시오. 처리된 마우스의 운동 능력 변화는 트레드밀 테스트를 통해 평가합니다. 기저치 측정은 처리 약 한 달 전부터 시작하며, 이는 테스트 대상 각 동물의 개선 정도를 평가하는 데 사용됩니다.첫 번째 단계는 테스트 전 동물을 운동에 적응시키는 것입니다. 이를 위해 트레드밀 속도를 6 m/min으로 설정하여 10분 동안 작동시킵니다. 이 절차를 일주일 동안 격일로 반복합니다.동물이 장치에 익숙해지면 경사도를 10도로 설정하고 동물을 트레드밀 레인에 배치합니다. 트레드밀을 분당 6m의 시작 속도로 작동시킵니다. 운동을 시작하지 않으려는 동물이 있다면 가볍게 밀어줍니다.다음으로, 동물이 휴식 구역에 5초 이상 머물면 즉시 타이머를 시작하고, 2분마다 속도를 2 m/min씩 증가시키십시오. 트레드밀에 다시 올라타도록 유도하지 말고, 막대기로 가볍게 건드려 운동을 다시 시작하도록 자극하십시오. 마우스가 트레드밀에 다시 올라타려는 시도 없이 휴식 구역에 5초 이상 머물면 피로한 상태로 간주합니다.5초 간격으로 3회 연속 기계적 자극을 가한 후, 각 동물의 수행 능력을 기록하고 이를 매주 또는 10일마다 최소 3회 반복 측정합니다. 이 과정은 세포 이식 2주 후부터 시작합니다. 테스트 완료 후 처리군 마우스에서도 동일한 절차를 반복합니다.성능 변화를 평가하기 위해 기저선(baseline)과 비교하십시오. 48-hydroxy tamoxifen 투여 48시간 후, 배양 중인 myo DER 형질전환 항목 내에서 myo de 양성 핵을 확인할 수 있습니다. 여기에서 보는 바와 같습니다.일주일 후, 세포들은 융합되어 다핵 근관(myotubes)으로 분화합니다. 급성 근육 손상 모사 모델의 근육 내로 이식했을 때, 이들은 트레드밀 결과로부터 조직 재생에 기여합니다. 운동 내성 검사 결과, 이식 후 처치된 마우스의 운동 능력이 개선된 것으로 나타났습니다.이식된 근육의 ex vivo 분석 결과, GFP 양성 영역이 나타나 IMS가 숙주 조직으로 콜로니를 형성한 범위를 보여주며, 이는 공여 세포가 디스트로피 근육에 성공적으로 생착되었음을 입증합니다. 중요한 점은, 이식된 세포가 in vivo에서 분화하여 새로운 골격근 섬유를 형성할 수 있다는 것입니다. 본 예시는 유전적으로 교정된 IMS가 $\alpha$-sarcoglycan 결핍 skid beige 마우스에서 $\alpha$-sarcoglycan 발현을 유도함을 보여줍니다.Masson's trichrome 염색 결과, 처리된 근육에서 섬유성 조직의 양이 감소한 것이 확인되었습니다. 이 절차에 이어 FreeWheel 테스트, Evan Blue Dye 분석, 그리고 단일 섬유 또는 전체 근육 역학 분석과 같은 방법을 수행하여 자발적 운동 능력의 향상, 섬유 취약성 및 특이적 힘에 관한 추가적인 질문에 대한 답을 얻을 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면 in vitro, in vivo 및 ex vivo 분석을 통해 iPS 세포 유래 근원성 전구세포의 근육 분화 능력, 이식 잠재력 및 기능적 효능을 평가하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

transplantation-induced-pluripotent-stem-cell-derived-mesoangioblast

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

작은 동물의 근육 Engraftment의 역학에 의해 추적 VIVO에서 형광 이미징

효소 분리, fibro / adipogenic 및 murine 골격근에서 myogenic progenitors의 유동세포계측법에 의해 표면 라벨 및 정화를위한 방법.

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설계 근육 조직은 질병 모델로 또한 고기에 대한 대체 소스로, 재생 의료에 큰 가능성이 있습니다. 여기 마우스 myoblast의 전구 세포, 및 전기 펄스에 의해 자극에서이 경우에, 근육 구조의 기술에 대해 설명합니다.

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Cardiotoxin 주입에 의한 급성 골격 근육 재생 유도

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최소한 침략 적 근육 (MIME) 포함-기증자 세포 중재 하는 Myogenesis를 촉진 하기 위하여 새로운 실험 기법

복잡한 인간 질병은 전통적인 실험실 모형 시스템에서 모델링하는 것이 어려울 수 있습니다. 여기에서, 우리는 면역 결핍 마우스로 인간 골격 근 생검의 이식을 통해 인간 근육 질병을 모델링하는 외과 접근을 기술합니다.

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신경 근육 장애에 대 한 치료를 조사 하기 위해 Myoblasts에 인간 섬유 아 세포의 직접 재프로그래밍

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인간 유도만능줄기세포(Human Induced Pluripotent Stem Cells)를 중간엽 기질세포(Mesenchymal Stromal Cell)로 분화하기 위한 두 가지 대표적인 방법의 비교

학습하세요 iPSC 유래 근생성 전구세포의 근육 재생 마우스 모델 이식 방법을. 이 기술은 근영양증 치료를 위한 세포치료 전략 개발에 활용됩니다.

근육 재생의 마우스 모델에서 유도 만능 줄기 세포 유래 메소안지오블라스트 와 같은 근생 성 전구의 이식

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