Name: 비교 단백체 분석을위한 신진 대사 라벨링 및 막 분별 애기 장대 서스펜션 세포 배양 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: 배우세요 안정 동위원소 라벨링과 막 분별을 이용한 비교 단백체 분석 방법을 Arabidopsis thaliana 세포 배양에서 적용하여 신호 전달 과정을 연구하는 기술입니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Alexandersson, E., Saalbach, G., Larsson, C., Kjellbom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+plasma+membrane+proteomics+identifies+components+of+transport%2C+signal+transduction+and+membrane+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis plasma membrane proteomics identifies components of transport, signal transduction and membrane trafficking.</a> Plant Cell Physiol. 45, 1543-1556 (2004).</li>
<li>Brown, D. A., Rose, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorting+of+GPI-anchored+proteins+to+glycolipid-enriched+membrane+subdomains+during+transport+to+the+apical+cell+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sorting of GPI-anchored proteins to glycolipid-enriched membrane subdomains during transport to the apical cell surface.</a> Cell. 68, 533-544 (1992).</li>
<li>Lanquar, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((15N-metabolic+labeling+for+comparative+plasma+membrane+proteomics+in+Arabidopsis+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">15N-metabolic labeling for comparative plasma membrane proteomics in Arabidopsis cells.</a> Proteomics. 7, 750-754 (2007).</li>
<li>Kierszniowska, S., Walther, D., Schulze, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ratio-dependent+significance+thresholds+in+reciprocal+15N-labeling+experiments+as+a+robust+tool+in+detection+candidate+proteins+responding+to+biological+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Ratio-dependent significance thresholds in reciprocal 15N-labeling experiments as a robust tool in detection candidate proteins responding to biological treatment.</a> Proteomics. 9, 1916-1924 (2009).</li>
<li>Singer, S. J., Nicolson, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluid+mosaic+model+of+the+structure+of+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The fluid mosaic model of the structure of cell membranes.</a> Science. 175, 720-731 (1972).</li>
<li>Simons, K., Ikonen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+rafts+in+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional rafts in cell membranes.</a> Nature. 387, 569-5672 (1997).</li>
<li>Baumgart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+fluid%2Ffluid+phase+separation+of+proteins+and+lipids+in+giant+plasma+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Large-scale fluid/fluid phase separation of proteins and lipids in giant plasma membrane vesicles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 3165-3170 (2007).</li>
<li>Silvius, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partitioning+of+membrane+molecules+between+raft-and+non+raft-domains%3A+insights+from+model+membrane+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Partitioning of membrane molecules between raft-and non raft-domains: insights from model membrane studies.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1746, 193-202 (2005).</li>
<li>Tanner, W., Malinsky, J., Opekarova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+plant+and+animal+cells%2C+detergent-resistant+membranes+do+not+define+functional+membrane+rafts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">In plant and animal cells, detergent-resistant membranes do not define functional membrane rafts.</a> Plant Cell. , (2011).</li>
<li>Lauwers, E., Andre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+yeast+transporters+with+detergent-resistant+membranes+correlates+with+their+cell-surface+location%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Association of yeast transporters with detergent-resistant membranes correlates with their cell-surface location.</a> Traffic. 7, 1-15 (2006).</li>
<li>Kierszniowska, S., Seiwert, B., Schulze, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition+of+Arabidopsis+sterol-rich+membrane+microdomains+by+differential+treatment+with+methyl-%C3%9F-cyclodextrin+and+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Definition of Arabidopsis sterol-rich membrane microdomains by differential treatment with methyl-ß-cyclodextrin and quantitative proteomics.</a> Mol. Cell. Proteomics. 8, 612-623 (2009).</li>
<li>Simons, K., Toomre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+rafts+and+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lipid rafts and signal transduction.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 31-39 (2000).</li>
<li>Maeda, Y., Kinoshita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+remodeling%2C+trafficking+and+functions+of+glycosylphosphatidylinositol-anchored+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Structural remodeling, trafficking and functions of glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins.</a> Prog. Lipid Res. 50, (2011).</li>
<li>Keinath, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAMP-induced+changes+in+plasma+membrane+compartmentalization+reveal+novel+components+of+plant+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">PAMP-induced changes in plasma membrane compartmentalization reveal novel components of plant immunity.</a> J. Biol. Chem. 285, 39140-39149 (2010).</li>
<li>Stanislas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomics+reveals+a+dynamic+association+of+proteins+to+detergent+resistant+membranes+upon+elicitor+signaling+in+tobacco%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomics reveals a dynamic association of proteins to detergent resistant membranes upon elicitor signaling in tobacco.</a> Mol. Cell. Proteomics. 8, 2186-2198 (2009).</li>
<li>Minami, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+detergent-resistant+plasma+membrane+microdomains+in+Arabidopsis+thaliana+during+cold+acclimation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Alterations in detergent-resistant plasma membrane microdomains in Arabidopsis thaliana during cold acclimation.</a> Plant Cell Physiol. 50, 341-359 (2008).</li>
<li>Pauly, M., Eberhard, S., Albersheim, P., Darvill, A., York, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+mur1+mutation+on+xyloglucans+produced+by+suspension-cultured+Arabidopsis+thaliana+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Effects of the mur1 mutation on xyloglucans produced by suspension-cultured Arabidopsis thaliana cells.</a> Planta. 214, 67-74 (2001).</li>
<li>Jouanneau, J. P., Peaud-Lenoel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+synthesis+of+proteins+in+cell+suspensions+of+a+kinetin+dependent+tobacco%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Plant%22%5BJournal%5D)">Growth and synthesis of proteins in cell suspensions of a kinetin dependent tobacco.</a> Physiol. Plant. 20, 834-850 (1967).</li>
<li>Engelsberger, W. R., Erban, A., Kopka, J., Schulze, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+labeling+of+plant+cell+cultures+with+K15NO3+as+a+tool+for+quantitative+analysis+of+proteins+and+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Metabolic labeling of plant cell cultures with K15NO3 as a tool for quantitative analysis of proteins and metabolites.</a> Plant Methods. 2, 1-11 (2006).</li>
<li>Arsova, B., Kierszniowska, S., Schulze, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+heavy+nitrogen+in+quantitative+proteomics+experiments+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">The use of heavy nitrogen in quantitative proteomics experiments in plants.</a> Trends Plant Sci. 17, 102-112 (2012).</li>
<li>Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stop+And+Go+Extraction+tips+for+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization%2C+nanoelectrospray%2C+and+LC%2FMS+sample+pretreatment+in+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Stop And Go Extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics.</a> Anal. Chem. 75, 663-670 (2003).</li>
<li>Olsen, J. V., Macek, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+accuracy+mass+spectrometry+in+large-scale+analysis+of+protein+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">High accuracy mass spectrometry in large-scale analysis of protein phosphorylation.</a> Methods Mol. Biol. 492, 131-142 (2009).</li>
<li>Schroeder, M. J., Shabanowitz, J., Schwartz, J. C., Hunt, D. F., Coon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neutral+loss+activation+method+for+improved+phosphopeptide+sequence+analysis+by+quadrupole+ion+trap+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">A neutral loss activation method for improved phosphopeptide sequence analysis by quadrupole ion trap mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 76, 3590-3598 (2004).</li>
<li>Frese, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+peptide+identification+by+targeted+fragmentation+using+CID%2C+HCD+and+ETD+on+an+LTQ-Orbitrap+Velos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Protrome+Research%22%5BJournal%5D)">Improved peptide identification by targeted fragmentation using CID, HCD and ETD on an LTQ-Orbitrap Velos.</a> Journal of Protrome Research. 10, 2377-2388 (2011).</li>
<li>van Breukelen, B., vanden Toorn, H. W., Drugan, M. M., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((StatQuant%3A+a+post-quantification+analysis+toolbox+for+improving+quantitative+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">StatQuant: a post-quantification analysis toolbox for improving quantitative mass spectrometry.</a> Bioinformatics. 25, 1472-1473 (2009).</li>
<li>Zauber, H., Schulze, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+wants+cRacker%3A+Automated+standardized+data+analysis+of+LC%2FMS+derived+proteomic+data%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Proteomics wants cRacker: Automated standardized data analysis of LC/MS derived proteomic data.</a> J. Proteome Res. 11, 5548-5555 (2012).</li>
<li>Raffaele, S., Mongrand, S., Gamas, P., Niebel, A., Ott, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+annotation+of+remorins%2C+a+plant-specific+protein+family%3A+Evolutionary+and+functional+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide annotation of remorins, a plant-specific protein family: Evolutionary and functional perspectives.</a> Plant Physiol. 145, 593-600 (2007).</li>
<li>Shah, M. B., Sehgal, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nondetergent+isolation+of+rafts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Nondetergent isolation of rafts.</a> Methods Mol. Biol. 398, 21-28 (2007).</li>
<li>Persaud-Sawin, D. -A., Lightcap, S., Harry, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+rafts+from+mouse+brain+tissue+by+a+detergent-free+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation of rafts from mouse brain tissue by a detergent-free method.</a> Journal of Lipid Research. 50, 759-767 (2009).</li>
<li>Macdonald, L. J., Pike, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+method+for+the+preparation+of+detergent-free+lipid+rafts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">A simplified method for the preparation of detergent-free lipid rafts.</a> Journal of Lipid Research. 46, 1061-1067 (2005).</li>
<li>Mühlhaus, T., Weiss, J., Hemme, D., Sommer, F., Schroda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+shotgun+proteomics+using+a+uniform+15N-labeled+standard+to+monitor+proteome+dynamics+in+time+course+experiments+reveals+new+insights+into+the+heat+stress+response+of+Chlamydomonas+reinhardtii%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative shotgun proteomics using a uniform 15N-labeled standard to monitor proteome dynamics in time course experiments reveals new insights into the heat stress response of Chlamydomonas reinhardtii.</a> Mol. Cell. Proteomics. 10, M110.004739(2011).</li>
<li>Schulze, W., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+in+mass-spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitation in mass-spectrometry-based proteomics.</a> Annu. Rev. Plant Biol. 61, 491-516 (2010).</li>
<li>Foster, L. J., de Hoog, C., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+quantiative+proteomics+of+lipid+rafts+reveales+high+specificity+for+signaling+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Unbiased quantiative proteomics of lipid rafts reveales high specificity for signaling factors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 5813-5818 (2003).</li>
<li>Lilley, K. S., Dupree, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+organelle+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Plant organelle proteomics.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 10, 594-599 (2007).</li>
<li>Sadowski, P. G., Groen, A. J., Dupree, P., Lilley, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-cellular+localization+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Sub-cellular localization of membrane proteins.</a> Proteomics. 8, 3991-4011 (2008).</li>
</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다. 저자되었습니다 Witold Szymanski는 분자 식물 생리학의 맥스 플랑크 연구소의 직원입니다. 저자는 트라우트 슐츠는 호헨 하임 대학, 독일의 직원입니다.

본 논문에서 제시하는 프로토콜은 여러 단계를 포함하고, 그들 모두는 세제 저항 막 및 세제 용해 분수에 식물 세포막의 순수하고 대표 분별을 얻을 매우 중요합니다. 따라서 지침에 따라 각 단계를 수행하는 것이 중요합니다. 비 - 이온 성 세제 (단계 3.2)와 세포막 분획의 치료는 막 마이크로 도메인 분획의 품질에 강한 영향을 미친다. 상이한 제제 사이 재현 가능한 결과를 얻기 위해, 그리고 동일한 실험에서 서로 다른 샘플을 비교할 수 있도록, 그것이 정확하게 세포막에서 단백질의 농도를 평가하고, 단백질 함량에 대해 동일한 비율을 항상 세제를 적용하는 것은 매우 중요 항상 같은 최종 농도. 실제로, 그것은 때때로 높은 단백질 농도를 가진 샘플을 희석하거나 다른 농도의 주식을 사용할 필요가 있다는 것을 의미트리톤 (Triton) X-100. 생화학 적 연구에서, 최근에는 막 마이크로 도메인 28-30의 분리를...

1972 년, 조나단 가수와 거스 니콜슨은 일반적으로 1960 년대 초에 허용 된 단백질 지질 단백질 샌드위치 모델을 교체, 유체 모자이크 모델에게 세포막의 구조 모델을 제안했다. 가수 니콜슨은 생체막 모든 지질 및 단백질 분자는 자유롭게하고 쉽게 확산 5 이차원 액체로서 고려 될 수 있음을 가정했다. 그때 이후로, 막 조성의 세포막 및 지식의 구조 모델은 더 복잡하게되었다. 특히, 세포막 내에 그러한 단백질 복합체 및 지질 / 스테롤 기반 구조적 무질서 같은 마이크로 도메인 구조를 관찰 할 수있다. 인공 모델 막을 6,7에서 스테롤과 스핑 고리 피드 가로 방향으로 변형 된 신체 기능과 영역을 형성하기 위해 다른 지질 종에서 분리 할 수 있습니다. 세포막 내에서이 분리는 주로 스테롤 높은 SA의 자기 연관 특성에 의해 발생합니다phopsho 및 스핑 고지 8 turated 탄화수소 사슬. 특히, 강성 스테롤 반지 엄격한 및 똑바로 포화 지질 종과 이들의 상호 작용이 막 두께와 경도를 증가, 더 확장 된 입체 형태로 이웃 탄화수소 사슬을 강제로와의 상호 작용을 선호. 스테롤이 풍부한 막 마이크로 도메인의 일반적으로 관찰 된 기능 중 하나는 비 이온 계면 활성제 등의 트리톤 (Triton) X-100 BRIJ (35) 치료에 따라 자신의 불용성했다. 이 분획을 막 마이크로 도메인과 동일한 것으로 생각하고, 그들의 생화학 제조 방법 2에 따라 세제 저항 막 (DRM)라고했다. DRM 추출시 비이 온성 세제의 사용은 생화학 DRM 준비가 직접 사는 셀 (9) 내에서 특정 막 칸에 해당하지 않을 수 있으므로 약간의 비판을 받았다. 특히, 단백질의 비율 세제 등 준비에 중요한 것의 다른 세제뿐만 아니라 다른 세제 양의 세제 저항 막 분획 (10)의 다른 구성을 얻을 수 있습니다. 그러나, 특정 단백질의 종류는 특히 이러한 세포 스테롤이 풍부한 막 도메인과 연결하고,이 단백질이 잘 세제 저항 막 분수 (11)의 생화학 적 준비에 충실하는 증거가있다. 식물 DRM 분획에서 발견되었고,의 DRM에 존재 종속 스테롤했다하는 단백질의 핵심은, 이러한 fasciclin 같은 아라 비노 갈 락탄 단백질 (FLAs) 및 SKU 단백질 가족의 일원으로, 특히 GPI-고정 단백질이었다. 또한 수용체 같은 키나제 또는 포스 포 리파제 등 일부 신호 단백질은 11 발견되었다. 이러한 결과는 포유류 막 마이크로 도메인 12,13 많은 프로테오믹스 연구와 일치한다. 또한 식물에 스트레스 반응 (14)의 맥락에서 막 마이크로 도메인의 역할에 대한 증거가 증가하고있다 -16. 여기에 설명 된 프로토콜은 세포막 분획의 마이크로 도메인을위한 강력한 방법을 제공하고, 특히주세요 스테롤 풍부한 세포막 구획 4,11,14의 스트레스 유도 변화를 묘사 할 수의 세제 농도의 단백질을 사용한다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">시약 </td></tr><tr><td>Chemicals는 Sigma-Aldrich에서 주문되었습니다. 달리 명시</td><td></td><td></td><td></td>되지 않는 한</tr><tr><td>암모니아 (재고 25 % 용액)</td><td>WAKO</td><td>010-03166</td><td></td></tr><tr><td>TiO2 10 &mu; m </td><td>GL-Science</td><td>5020-75010</td><td></td></tr><tr><td>Empore Disk C18</td><td>Varian</td><td>12145004</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌 글리콜(PEG 3350)</td><td>Sigma</td><td>88276</td><td></td></tr><tr><td>Dextran T500</td><td>Roth</td><td>9219.2</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Promega</td><td>V5113</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일(PIC)</td><td>Sigma</td><td>P9599</td><td></td></tr><tr><td>K15NO3</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>NLM-765-PK</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT </td></tr><tr><td>Optima L-80 XP 초원심분리기 </td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>플레이트 리더</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EASY-nLC II 나노 액체 크로마토그래프</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LTQ-Orbitrap 질량분석기</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5417R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Speed Vac RVC 2-25</td><td>Christ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shaker Unimax 2010</td><td>Heidolph</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

비교 단백체 분석을위한 신진 대사 라벨링 및 막 분별<em&gt; 애기 장대</em&gt; 서스펜션 세포 배양

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

세포막 마이크로 도메인은 지질 및 스테롤 환경의 물리적 특성에 기초하여 기능하고 신호 전달 프로세스에서 특정 역할이있다. 프로테옴 분석을 위해 식물 세포에서 스테롤이 풍부한 막 마이크로 도메인을 추출하면 여러 준비 단계 및 다른 세포 구획에서의 오염 물질에 대한 소스에 주로 어려운 작업입니다. 세포막은 식물 세포에있는 멤브레인의 단지 대략 5-20 %에 구성하고, 따라서 고순도 세포막 분획의 분리 도전적이다. 자주 사용하는 방법은 95 % (1)의 순도 세포막 소포를 산출 폴리에틸렌 글리콜 및 덱스 트란의 수성 두 단계의 분할을 포함한다. 세포막 내 스테롤이 풍부한 막 마이크로 도메인은 알칼리 pH에서 차가운 비 이온 계 계면 활성제 치료에 불용성이다. 이 세제 저항 막 분획은 초 원심 분리에 의해 대량 세포막으로부터 분리 될 수있다ucrose 그라데이션 2. 이어서, 단백질은 메탄올 / 클로로포름 침전 자당 구배 저밀도 대역으로부터 추출 될 수있다. 추출 된 단백질은 소화 탈염 마지막 LC-MS/MS 분석 트립신됩니다. 스테롤이 풍부한 마이크로 도메인에 대한 우리의 추출 프로토콜은 애기 장대의 세포 배양에서 청소 세제 저항 막 분수의 준비를 위해 최적화되어 있습니다. 우리는 또한 3의 생물학적 처리 다음과 같은 정량적 인 비교 프로테오믹스 연구를위한 유일한 질소원으로 K 15 NO 3와 애기 장대 서스펜션 세포 배양의 전체 신진 대사 라벨을 사용합니다. 조인트 단백질 추출을위한 표지 및 표지되지 않은 세포 배양의 동등한 비율을 혼합하여 최종 정량 결과의 준비 단계의 영향은 최소로 유지된다. 또한 추출 중 물질의 손실은 제어와 같은 방법으로 처리 샘플 모두에 영향을 미칠 것이다D 따라서 빛과 올림 펩타이드의 비율이 일정하게 유지됩니다. 제안 된 방법으로 표시하거나 다른 컨트롤 4 역할을하면서 레이블이없는 세포 배양은 생물학적 처리를 거쳐 하나.

대사 적으로 표지 된 애기 세포 배양을 이용하여 제시된 프로토콜로는 식물 조직 (STEP2가, 2 및도 4)에서 원형질막을 분리하고, 세포막 내에 세제 저항 막 분획에 대한 풍부 할 수있다 (단계 3, 4 및도 5). 이어서, 프로토콜은 수있는 세제 저항 막 분획 (단계 4) 및 비교 프로테옴 분석 (단계 5)에 대한 단백질의 소화로부터 단백질의 추출. 마지막으로, 포스 포 (8 단계)의 선택적 농축은 세포 신호 전달 과정을 공부에 특히 흥미 롭다. 마지막 단계는 레이블과 레이블이없는 세포 배양에서 막 분획의 단백질 풍부 비율의 정량적 데이터 분석 (9 단계, 그림 6)입니다. 2 상 시스템 (단계 2) 및 이후 원심 혼합 후 전형적인 결과는 투명 착색 상부 위상 및 아르녹색은 낮은 단계 (그림 2) 색깔. 녹색 엽록체 및 다른 실내 막에서...

여기에서 우리는 완전히 15 N 표시 애기 장대 세포 배양 레이블의 혼합물에 따라 세제 저항하고 세제 용해 막에 식물 세포막의 분별과 생체 내에서 강력한 방법을 설명합니다. 절차는 시그널링 프로세스를 이해하기 위해, 비교 단백체 연구에 적용된다.

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

다음 실험의 전반적인 목표는 서로 다른 막 하구획을 분리하고, 이들의 상이한 단백질 조성을 연구하는 것입니다. 이는 서로 다른 조건에서 세포를 안정 동위원소로 표지하여 처리군 간의 구분이 가능하도록 함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계인 질량 분석법에서는 두 처리군의 세포 물질을 혼합하며, 이를 통해 공동 처리가 보장되고 시료 간 편차가 감소합니다.다음으로, 자당(sucrose)을 이용하여 세포질막 하구획을 정제하고 이를 sterile, rich 및 sterile depleted 하구획으로 분리합니다. 정량 질량 분석법의 데이터를 기반으로, 서로 다른 처리 조건 하에서 하구획별 단백질 풍부도가 다르게 나타나는 구배 원심분리 결과를 얻습니다. 웨스턴 블로팅과 같은 기존 방법과 비교하여 이 프로토콜의 주요 장점은 수천 개의 단백질에 대한 하구획 분포를 정량적으로 기록함으로써 신호 전달 과정의 새로운 후보 물질을 발견할 수 있다는 점입니다.2상 시스템의 막 정제 과정은 학습하기 어렵기 때문에 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 이는 많은 단계가 포함되어 있으며, 정밀한 제어와 철저한 취급이 매우 중요하기 때문입니다. 이 방법은 막 프로세스의 조절 인자로서 새로운 단백질 후보를 발견함으로써 신호 전달 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 표지 및 비표지 애기자라(Arabidopsis thaliana) 세포 현탁 배양을 성장시키는 것으로 시작하십시오.액체 질소에 보관된 7일 된 세포 현탁 배양액 약 1L에서 얻은 균질화된 세포를 비커에 넣고, 신선 중량을 기준으로 표지된 동결 세포 배양액과 표지되지 않은 동결 세포 배양액을 동일한 양으로 혼합한 후 완충액 H를 2배 부피로 첨가합니다. 즉시 비커를 쉐이커에 올리고 물질이 완전히 녹아 얼음 결정이 없어질 때까지 흔들어 줍니다. 균질물을 미러 클로스(mirror cloth) 한 층을 통해 250mL 원심분리 튜브에 여과합니다. 완충액 H를 사용하여 시료의 양을 맞춘 후, 10,000 Gs에서 8분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후, 상층액(snat)을 약 32mL 부피의 사전 냉각된 초원심분리 튜브에 분주합니다.완충액으로 시료의 부피를 맞춘 후, 100,000 Gs, 4°C에서 30분 동안 원심분리하여 마이크로솜을 펠렛화합니다. 원심분리가 끝나면 수용성 단백질이 포함된 상층액을 제거합니다. 이 분획의 소량을 보관하여 추후 단백질 침전 및 수용성 단백질 분석에 사용할 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 기술된 바와 같이, 각 시료의 막 펠렛을 해당 양의 완충액 R에 재부유시킨 후 U 12 상 시스템의 상단에 로딩합니다.6g 2상 시스템을 사용하는 경우, 재현탁된 막 펠렛 2g을 정확히 정량하여 넣고, 샘플 재현탁에 사용한 것과 동일한 부피의 순수 버퍼 R을 U2에 넣습니다. U1과 U2 튜브를 초당 약 1회 속도로 30회 반전시켜 천천히 혼합한 후, 샘플을 1500 Gs, 4 °C에서 10분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 U2에서 상층액을 제거합니다. U1의 상층액을 U2로 옮긴 후 동일한 조건으로 원심분리를 반복합니다. 다음으로 U2의 상층액을 초원심분리 튜브로 옮기고, 5배 부피의 버퍼 R로 희석하여 충분히 혼합한 후 샘플을 200,000 Gs, 4 °C에서 1시간 동안 원심분리합니다.마지막으로, 재사용 단계입니다. 세제 내성 막(detergent resistant membranes)을 분리하기 위해 막 펠렛을 소량의 T and E 버퍼에 현탁합니다. Bradford 분석으로 세포막 분획의 농도를 확인한 후, 세제 대 단백질의 중량비가 13에서 15 사이가 되고 최종 세제 농도가 0.5에서 1%가 되도록 Triton X 100을 세포막 분획에 첨가합니다. 시료를 약 100 RPM, 4 °C에서 30분 동안 흔들어 섞어줍니다.그 다음, 처리된 세포막 1부피당 2.4 M 수크로스 3부피를 추가하여 최종 수크로스 농도를 1.8 M로 맞춥니다. 1.8 M 분획 위에 각각의 수크로스 용액을 층지어 초원심분리 튜브에 수크로스 밀도 구배를 준비합니다. 샘플을 250,000 g, 4 °C에서 18시간 동안 원심분리합니다. 0.15 M과 1.4 M 수크로스의 경계면에서 우윳빛 고리로 보일 수 있는 저밀도 밴드가 흐트러지지 않도록 로터에서 초원심분리 튜브를 조심스럽게 꺼냅니다.때로는 아무것도 보이지 않을 수 있지만, 계면활성제 내성 단백질 분획은 여전히 존재합니다. 그래디언트 상단에서 0.75 mL 부피의 분획, 즉 인터페이스 링 위쪽의 약 1.5 mL 부피를 포함하는 두 번째와 세 번째 분획을 제거하십시오. 그리고 인터페이스 링 아래쪽에서 0.5 mL를 제거하십시오.계면활성제 내성 막 분획을 나타냅니다. 이 분획들을 15 milliliter Falcon 튜브에 수집하십시오. 분획 9와 10은 계면활성제 가용성 막 분획을 포함하고 있으며, 비교를 위해 함께 수집할 수 있습니다.계면활성제 내성 분획(detergent resistant fraction)에서 단백질 추출을 시작하려면, 수집된 분획에 4배 부피의 methanol을 넣고 충분히 vortex 합니다. 그다음 1배 부피의 chloroform을 넣고 다시 충분히 vortex 합니다. 마지막으로 3배 부피의 물을 추가하고 충분히 vortex 한 뒤, 샘플을 2000 Gs에서 5분 동안 원심분리합니다.벤치탑 원심분리기를 사용하여 중간층의 단백질 층 위에 있는 수층을 제거합니다. 다음으로, 메탄올 3배 부피를 넣고 볼텍싱합니다. 인솔루션 소화를 위해 펠렛을 취하기 전, S 상층액을 완전히 제거합니다.샘플을 소량의 6 M urea 및 2 M thyroid pH 8(약칭 UTU)에 용해하여 인솔루션 소화를 시작합니다. 샘플에 적합한 범위 내에서 가능한 한 적은 부피를 사용하십시오. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 샘플을 원심 분리하고 소화를 진행한 후, 샘플을 4배 부피의 10 mM tris HCl pH 8로 희석합니다.그런 다음 샘플 단백질 50 µg당 1 µL의 trypsin을 첨가하고, 700 RPM으로 지속적으로 흔들어주며 상온에서 하룻밤 동안 배양한 뒤, 샘플을 4,000 ×g에서 10분 동안 원심 분리합니다. 마지막으로, 약 1/10 부피의 2% trifluoroacetic acid를 첨가하여 최종 농도가 0.2% TFA가 되도록 산성화하여 pH 2에 도달하게 합니다. C18 스테이지 팁을 제작하려면, 일회용 플라스틱 페트리 접시와 같이 평평하고 깨끗한 표면에 C18 디스크를 놓습니다.직경 1.5 밀리미터의 뭉툭한 팁 하이포더믹 바늘을 사용하여 작은 디스크를 펀칭해 냅니다. 디스크가 바늘에 붙어 있으므로 이를 피펫 팁으로 옮길 수 있습니다. 바늘에서 디스크를 밀어내어, 바늘 내부에 맞는 융합 실리카 조각이나 튜빙 피팅을 사용하여 피펫 팁의 테이퍼링 부분에 고정합니다. 준비된 스테이지 팁에 50 µL의 용액 B를 넣어 C 18 스테이지 팁을 컨디셔닝합니다.원심분리기에서 팁을 2000 RPM으로 2분 동안 회전시킵니다. 벤치톱 원심분리기를 사용하여 100 µL의 용액 a로 스테이지 팁을 평형화합니다. 벤치톱 원심분리기에서 팁을 5,000 g로 회전시킵니다. 평형화와 회전 과정을 반복합니다.디스크가 들어 있는 피펫 팁에 샘플을 조심스럽게 피펫팅하여 샘플을 로딩합니다. 샘플의 전체 부피가 C 18 디스크를 통과할 때까지 원심분리기에서 팁을 회전시킵니다. 100 µL의 용액 A로 스테이지 팁을 두 번 세척합니다. 원심분리기에서 팁을 회전시킨 후, 40 µL의 용액 B가 담긴 새로운 1.5 mL 반응 튜브에 EIT를 수집하고 원심분리합니다.다시 한번, 최적의 조건에서 speed vac를 사용하여 샘플을 농축합니다. 액체가 약 1~2 µL 정도 남았을 때 탈수 과정을 중단합니다. 마지막 단계로, Resus suspension solution 9 µL를 샘플에 추가하여 최종 부피를 맞춘 후, 질량 분석법 분석을 위해 마이크로타이터 플레이트로 옮깁니다.혈장막 단백질의 농축은 소량의 혈장막, 분획 및 2상 시스템의 하층에 존재하는 단백질에 대한 단백질체 분석을 통해 확인할 수 있습니다. 하층에는 세포의 내부 막이 포함되어 있습니다. 예를 들어, 수용체 키나아제 단백질과 같이 전형적으로 알려진 혈장막 단백질은 혈장막 분획에서 높은 풍부도를 보였으며, 내부 막을 포함하는 하층 분획에서는 낮은 풍부도를 보였습니다.반대로 소포체의 기지 단백질들은 내막 분획에서 높은 풍부도를 보였으며, 세포막 분획에서는 관찰되지 않았습니다. 이후 세제 내성 막 분획을 농축하면, 이상적인 경우 저밀도 막 소낭이 우윳빛 고리 형태로 형성됩니다. 예상한 바와 같이, 튜브 높이의 약 5분의 1 지점에서 remn 단백질이 세제 내성 막 또는 DRM 분획에서 가장 높게 검출되었습니다.반대로, ABC 수송체와 같이 막 미세 도메인에 존재하지 않는 단백질들은 DRM 분획에서 풍부도가 증가하지 않습니다. 또한, ATP synthase F₀ 복합체의 미토콘드리아 단백질이나 60S 리보솜의 리보솜 단백질과 같은 전형적인 오염 물질들 역시 DRM 분획에서 농축된 풍부도를 보이지 않습니다. 질량 분석 후 최소량이 여전히 검출될 수는 있으나, 표지 및 비표지 세포 배양액의 세포막 분획에서 단백질 인산화 상태에 따른 단백질 풍부도 비율을 정량적으로 구분할 수 있습니다.MS 정량 분석 창의 일반적인 결과에서는 식별된 대부분의 펩타이드에 대해 이온 강도 비율이 1:1로 나타나야 합니다. 이온 강도 비율이 1:1에서 크게 벗어나는 펩타이드는 표지된 세포 배양물과 표지되지 않은 세포 배양물 사이에서 차등 조절된 것으로 간주되며, 적용된 처리에 의해 영향을 받은 단백질과 매칭될 후보가 됩니다. 성공적인 대사 표지의 양호한 품질 관리 지표는 여기에서 보여주는 것처럼 nano HPLC 분리 시 표지된 펩타이드 버전과 표지되지 않은 펩타이드 버전이 하나의 단일 피크로 공용출되는 것입니다.이 기술을 숙달하면 추출 시작부터 질량 분석기로의 시료 로딩까지 3일 만에 완료할 수 있습니다. 이 절차 이후에는 특정 표적 단백질의 보충에 관한 추가 질문에 답하기 위해 Western Blot과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 따라서 이 영상을 시청한 후에는 안정 동위원소가 표지된 식물 세포 배양액을 혼합하는 방법, 2상 시스템을 통해 세포막 정제를 수행하는 방법, 그리고 안정 동위원소가 풍부한 분획과 결핍된 막 하위 구획을 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

metabolic-labeling-membrane-fractionation-for-comparative-proteomic

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

식물의 특정 세포 유형을 분리하는 방법을 시연합니다. 이 기법은 특정 세포 유형, 세포 분리 및 형광 활성 세포에 형광 단백질 정렬을 표현 형질 마커 라인을 사용합니다. 또한, 성장의 설정은 치료를 용이하게되는 여기...

식물 Protoplasts의 형광 활성 세포 정렬

공간적 특정 phytochrome 반응의 분자 기초는 조직과 기관이 특정 phytochrome 결함을 전시 유전자 변형 식물을 사용하여 조사 중입니다. 특정 세포의 분리는 microarray 분석에 의해 다음 정렬 것은 공간적 특정 phytochrome 응답에 관련된 유전자를 확인하기 위해 활용되고있는 형광 활성화된 세포로 유도 phytochrome 발색단 고갈을 전시.

에서 외과를 이용한 셀 타입 특정 표현식 프로파일을 사용하여 조직 및 장기 특정 Phytochrome 응답 조사 Arabidopsis thaliana</em

의 세포 구체적인 분석<em&gt; Arabidopsis</em&gt; 형광 활성화 셀 정렬을 사용하여 잎

기술 비교, 정량 프로테오믹스 방법은 서로 다른 조건에서 multiprotein의 단지의 조성에 대한 통찰력을 얻는 것을 목표로하고 유 전적으로 서로 다른 변종을 비교하여 보여줍니다. 정량 분석​​을 위해 자당 밀도 구배 상이한 분획 같은 부피는 질량 분석법에 의해 혼합되고 분석된다.

multiprotein의 단지의 비교 분석을위한 새로운 접근 방식을 기반으로<sup&gt; 15</sup&gt; N 대사 라벨링 및 정량 질량 분석

하나의 샘플을 사용하여 생물학적 조직에서 지질, 대사 산물 및 단백질을 포괄적으로 추출하기위한 프로토콜이 제시됩니다.

단일 시료의 대사 산물, 지질 및 단백질의 종합 분석을위한 간단한 분취 추출 방법

여기, 우리는 Arabidopsis thaliana 엽초 엽 원형체에 적용된 상호 작용 캡처 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 생체 내 UV 가교 결합에 비판적으로 의존하며 생리 환경으로부터 식물 mRNA 결합 단백질의 분리 및 동정을 허용합니다.

식물 원형질에서 mRNA Interactome 캡처

단백질 대사 산물 및 단백질-단백질 상호 작용은 모든 세포 기능에 중요 한. 여기, 우리는 선택의 이러한 상호 작용 단백질으로의 병렬 분석을 허용 하는 프로토콜을 설명 합니다. 우리의 프로토콜 식물 세포 배양에 대 한 최적화 되었습니다 및 질량 분석 기반 단백질 및 대사 산물 검출 친 화력 정화를 결합 했다.

2 1: 원스텝 단백질 단백질과 단백질 대사 산물 단지의 병렬 분석에 대 한 친 화력 정화

여기, 우리 애기 잎 (봉투, 기질, 그리고 thylakoids), 그들의 세 가지 주요 하위 구획에서 그대로 엽록체를 정화 하는 방법을 설명 차동 centrifugations, 연속 Percoll 기울기의 조합을 사용 하 고 불연속 자당 기온 변화도입니다. 메서드는 subplastidial 및 immunoblotting과 proteomics에 의해 단백질의 subcellular 지 방화에 대 한 귀중 한.

단백질 지 방화 Immunoblotting 또는 단백질의 분석에 대 한 애기에서 엽록체 하위 구획의 준비

다중 생체 분자의 시스템 전반의 분석은 생물학적 과정에 대한 기능적 및 기계적 통찰력을 얻는 데 매우 중요합니다. 따라서, 광범위한 프로토콜은 동기화된 클라미도모나스 배양으로부터 수확된 단일 샘플로부터 지질, 대사산물, 단백질 및 전분의 높은 처리량 추출에 대해 설명된다.

녹색 조류 클라미도모나스 린하르티의 동기화 된 배양의 심층 분석을위한 다중 Omics 추출 방법

고처리량 scRNA-seq 분석법의 실현 가능성과 효과는 식물 연구에서 단일 세포 시대를 예고합니다. 여기에 제시된 것은 특정 Arabidopsis thaliana 뿌리 세포 유형을 분리하고 후속 전사체 라이브러리 구성 및 분석을 위한 강력하고 완전한 절차입니다.

식물 세포 유형의 분리 및 전사체 분석

배우세요 안정 동위원소 라벨링과 막 분별을 이용한 비교 단백체 분석 방법을 Arabidopsis thaliana 세포 배양에서 적용하여 신호 전달 과정을 연구하는 기술입니다.

비교 단백체 분석을위한 신진 대사 라벨링 및 막 분별

더 많은 동영상 탐색