비교 단백체 분석을위한 신진 대사 라벨링 및 막 분별

다음 실험의 전반적인 목표는 서로 다른 막 하구획을 분리하고, 이들의 상이한 단백질 조성을 연구하는 것입니다. 이는 서로 다른 조건에서 세포를 안정 동위원소로 표지하여 처리군 간의 구분이 가능하도록 함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계인 질량 분석법에서는 두 처리군의 세포 물질을 혼합하며, 이를 통해 공동 처리가 보장되고 시료 간 편차가 감소합니다.

다음으로, 자당(sucrose)을 이용하여 세포질막 하구획을 정제하고 이를 sterile, rich 및 sterile depleted 하구획으로 분리합니다. 정량 질량 분석법의 데이터를 기반으로, 서로 다른 처리 조건 하에서 하구획별 단백질 풍부도가 다르게 나타나는 구배 원심분리 결과를 얻습니다. 웨스턴 블로팅과 같은 기존 방법과 비교하여 이 프로토콜의 주요 장점은 수천 개의 단백질에 대한 하구획 분포를 정량적으로 기록함으로써 신호 전달 과정의 새로운 후보 물질을 발견할 수 있다는 점입니다.

2상 시스템의 막 정제 과정은 학습하기 어렵기 때문에 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 이는 많은 단계가 포함되어 있으며, 정밀한 제어와 철저한 취급이 매우 중요하기 때문입니다. 이 방법은 막 프로세스의 조절 인자로서 새로운 단백질 후보를 발견함으로써 신호 전달 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 표지 및 비표지 애기자라(Arabidopsis thaliana) 세포 현탁 배양을 성장시키는 것으로 시작하십시오.

액체 질소에 보관된 7일 된 세포 현탁 배양액 약 1L에서 얻은 균질화된 세포를 비커에 넣고, 신선 중량을 기준으로 표지된 동결 세포 배양액과 표지되지 않은 동결 세포 배양액을 동일한 양으로 혼합한 후 완충액 H를 2배 부피로 첨가합니다. 즉시 비커를 쉐이커에 올리고 물질이 완전히 녹아 얼음 결정이 없어질 때까지 흔들어 줍니다. 균질물을 미러 클로스(mirror cloth) 한 층을 통해 250mL 원심분리 튜브에 여과합니다. 완충액 H를 사용하여 시료의 양을 맞춘 후, 10,000 Gs에서 8분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후, 상층액(snat)을 약 32mL 부피의 사전 냉각된 초원심분리 튜브에 분주합니다.

완충액으로 시료의 부피를 맞춘 후, 100,000 Gs, 4°C에서 30분 동안 원심분리하여 마이크로솜을 펠렛화합니다. 원심분리가 끝나면 수용성 단백질이 포함된 상층액을 제거합니다. 이 분획의 소량을 보관하여 추후 단백질 침전 및 수용성 단백질 분석에 사용할 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 기술된 바와 같이, 각 시료의 막 펠렛을 해당 양의 완충액 R에 재부유시킨 후 U 12 상 시스템의 상단에 로딩합니다.

6g 2상 시스템을 사용하는 경우, 재현탁된 막 펠렛 2g을 정확히 정량하여 넣고, 샘플 재현탁에 사용한 것과 동일한 부피의 순수 버퍼 R을 U2에 넣습니다. U1과 U2 튜브를 초당 약 1회 속도로 30회 반전시켜 천천히 혼합한 후, 샘플을 1500 Gs, 4 °C에서 10분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 U2에서 상층액을 제거합니다. U1의 상층액을 U2로 옮긴 후 동일한 조건으로 원심분리를 반복합니다. 다음으로 U2의 상층액을 초원심분리 튜브로 옮기고, 5배 부피의 버퍼 R로 희석하여 충분히 혼합한 후 샘플을 200,000 Gs, 4 °C에서 1시간 동안 원심분리합니다.

마지막으로, 재사용 단계입니다. 세제 내성 막(detergent resistant membranes)을 분리하기 위해 막 펠렛을 소량의 T and E 버퍼에 현탁합니다. Bradford 분석으로 세포막 분획의 농도를 확인한 후, 세제 대 단백질의 중량비가 13에서 15 사이가 되고 최종 세제 농도가 0.5에서 1%가 되도록 Triton X 100을 세포막 분획에 첨가합니다. 시료를 약 100 RPM, 4 °C에서 30분 동안 흔들어 섞어줍니다.

그 다음, 처리된 세포막 1부피당 2.4 M 수크로스 3부피를 추가하여 최종 수크로스 농도를 1.8 M로 맞춥니다. 1.8 M 분획 위에 각각의 수크로스 용액을 층지어 초원심분리 튜브에 수크로스 밀도 구배를 준비합니다. 샘플을 250,000 g, 4 °C에서 18시간 동안 원심분리합니다. 0.15 M과 1.4 M 수크로스의 경계면에서 우윳빛 고리로 보일 수 있는 저밀도 밴드가 흐트러지지 않도록 로터에서 초원심분리 튜브를 조심스럽게 꺼냅니다.

때로는 아무것도 보이지 않을 수 있지만, 계면활성제 내성 단백질 분획은 여전히 존재합니다. 그래디언트 상단에서 0.75 mL 부피의 분획, 즉 인터페이스 링 위쪽의 약 1.5 mL 부피를 포함하는 두 번째와 세 번째 분획을 제거하십시오. 그리고 인터페이스 링 아래쪽에서 0.5 mL를 제거하십시오.

계면활성제 내성 막 분획을 나타냅니다. 이 분획들을 15 milliliter Falcon 튜브에 수집하십시오. 분획 9와 10은 계면활성제 가용성 막 분획을 포함하고 있으며, 비교를 위해 함께 수집할 수 있습니다.

계면활성제 내성 분획(detergent resistant fraction)에서 단백질 추출을 시작하려면, 수집된 분획에 4배 부피의 methanol을 넣고 충분히 vortex 합니다. 그다음 1배 부피의 chloroform을 넣고 다시 충분히 vortex 합니다. 마지막으로 3배 부피의 물을 추가하고 충분히 vortex 한 뒤, 샘플을 2000 Gs에서 5분 동안 원심분리합니다.

벤치탑 원심분리기를 사용하여 중간층의 단백질 층 위에 있는 수층을 제거합니다. 다음으로, 메탄올 3배 부피를 넣고 볼텍싱합니다. 인솔루션 소화를 위해 펠렛을 취하기 전, S 상층액을 완전히 제거합니다.

샘플을 소량의 6 M urea 및 2 M thyroid pH 8(약칭 UTU)에 용해하여 인솔루션 소화를 시작합니다. 샘플에 적합한 범위 내에서 가능한 한 적은 부피를 사용하십시오. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 샘플을 원심 분리하고 소화를 진행한 후, 샘플을 4배 부피의 10 mM tris HCl pH 8로 희석합니다.

그런 다음 샘플 단백질 50 µg당 1 µL의 trypsin을 첨가하고, 700 RPM으로 지속적으로 흔들어주며 상온에서 하룻밤 동안 배양한 뒤, 샘플을 4,000 ×g에서 10분 동안 원심 분리합니다. 마지막으로, 약 1/10 부피의 2% trifluoroacetic acid를 첨가하여 최종 농도가 0.2% TFA가 되도록 산성화하여 pH 2에 도달하게 합니다. C18 스테이지 팁을 제작하려면, 일회용 플라스틱 페트리 접시와 같이 평평하고 깨끗한 표면에 C18 디스크를 놓습니다.

직경 1.5 밀리미터의 뭉툭한 팁 하이포더믹 바늘을 사용하여 작은 디스크를 펀칭해 냅니다. 디스크가 바늘에 붙어 있으므로 이를 피펫 팁으로 옮길 수 있습니다. 바늘에서 디스크를 밀어내어, 바늘 내부에 맞는 융합 실리카 조각이나 튜빙 피팅을 사용하여 피펫 팁의 테이퍼링 부분에 고정합니다. 준비된 스테이지 팁에 50 µL의 용액 B를 넣어 C 18 스테이지 팁을 컨디셔닝합니다.

원심분리기에서 팁을 2000 RPM으로 2분 동안 회전시킵니다. 벤치톱 원심분리기를 사용하여 100 µL의 용액 a로 스테이지 팁을 평형화합니다. 벤치톱 원심분리기에서 팁을 5,000 g로 회전시킵니다. 평형화와 회전 과정을 반복합니다.

디스크가 들어 있는 피펫 팁에 샘플을 조심스럽게 피펫팅하여 샘플을 로딩합니다. 샘플의 전체 부피가 C 18 디스크를 통과할 때까지 원심분리기에서 팁을 회전시킵니다. 100 µL의 용액 A로 스테이지 팁을 두 번 세척합니다. 원심분리기에서 팁을 회전시킨 후, 40 µL의 용액 B가 담긴 새로운 1.5 mL 반응 튜브에 EIT를 수집하고 원심분리합니다.

다시 한번, 최적의 조건에서 speed vac를 사용하여 샘플을 농축합니다. 액체가 약 1~2 µL 정도 남았을 때 탈수 과정을 중단합니다. 마지막 단계로, Resus suspension solution 9 µL를 샘플에 추가하여 최종 부피를 맞춘 후, 질량 분석법 분석을 위해 마이크로타이터 플레이트로 옮깁니다.

혈장막 단백질의 농축은 소량의 혈장막, 분획 및 2상 시스템의 하층에 존재하는 단백질에 대한 단백질체 분석을 통해 확인할 수 있습니다. 하층에는 세포의 내부 막이 포함되어 있습니다. 예를 들어, 수용체 키나아제 단백질과 같이 전형적으로 알려진 혈장막 단백질은 혈장막 분획에서 높은 풍부도를 보였으며, 내부 막을 포함하는 하층 분획에서는 낮은 풍부도를 보였습니다.

반대로 소포체의 기지 단백질들은 내막 분획에서 높은 풍부도를 보였으며, 세포막 분획에서는 관찰되지 않았습니다. 이후 세제 내성 막 분획을 농축하면, 이상적인 경우 저밀도 막 소낭이 우윳빛 고리 형태로 형성됩니다. 예상한 바와 같이, 튜브 높이의 약 5분의 1 지점에서 remn 단백질이 세제 내성 막 또는 DRM 분획에서 가장 높게 검출되었습니다.

반대로, ABC 수송체와 같이 막 미세 도메인에 존재하지 않는 단백질들은 DRM 분획에서 풍부도가 증가하지 않습니다. 또한, ATP synthase F₀ 복합체의 미토콘드리아 단백질이나 60S 리보솜의 리보솜 단백질과 같은 전형적인 오염 물질들 역시 DRM 분획에서 농축된 풍부도를 보이지 않습니다. 질량 분석 후 최소량이 여전히 검출될 수는 있으나, 표지 및 비표지 세포 배양액의 세포막 분획에서 단백질 인산화 상태에 따른 단백질 풍부도 비율을 정량적으로 구분할 수 있습니다.

MS 정량 분석 창의 일반적인 결과에서는 식별된 대부분의 펩타이드에 대해 이온 강도 비율이 1:1로 나타나야 합니다. 이온 강도 비율이 1:1에서 크게 벗어나는 펩타이드는 표지된 세포 배양물과 표지되지 않은 세포 배양물 사이에서 차등 조절된 것으로 간주되며, 적용된 처리에 의해 영향을 받은 단백질과 매칭될 후보가 됩니다. 성공적인 대사 표지의 양호한 품질 관리 지표는 여기에서 보여주는 것처럼 nano HPLC 분리 시 표지된 펩타이드 버전과 표지되지 않은 펩타이드 버전이 하나의 단일 피크로 공용출되는 것입니다.

이 기술을 숙달하면 추출 시작부터 질량 분석기로의 시료 로딩까지 3일 만에 완료할 수 있습니다. 이 절차 이후에는 특정 표적 단백질의 보충에 관한 추가 질문에 답하기 위해 Western Blot과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 따라서 이 영상을 시청한 후에는 안정 동위원소가 표지된 식물 세포 배양액을 혼합하는 방법, 2상 시스템을 통해 세포막 정제를 수행하는 방법, 그리고 안정 동위원소가 풍부한 분획과 결핍된 막 하위 구획을 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.