종양 표적의 측정 성장과 유전자 발현 역학 S. 티피 뮤 리움 박테리아

이 실험의 전반적인 목표는 종양 내부에서 자라는 S 티리안 박테리아의 생체 내 유전자 발현 역학을 연구하는 것입니다. 쥐 이종이식 암 모델에서 처음으로 박테리아는 꼬리 정맥을 통해 정맥 주사됩니다. 박테리아는 종양에 군집하고 기하급수적으로 성장하는 동안 유전자 발현은 발광 리포터를 사용하여 시각화됩니다.

전체 동물 생물 발광 이미징은 IVUS 스펙트럼 이미징 시스템을 사용하여 수행됩니다. 한 번에 24시간에서 48시간 동안 IVUS 이미지가 촬영됩니다. 이 이미지 시리즈는 종양을 균질화하고 도금하여 생성된 콜로니 수와 상관관계가 있습니다.

이러한 데이터를 함께 사용하면 표준 세포 배양 기술을 사용하여 실시간 세포 준비 통로, 세포주에서 생체 내 종양 표적 박테리아의 유전자 발현 및 집단 역학을 정량적으로 측정할 수 있습니다. 이 실험에서는 80 내지 100%의 목표 공동 유창성으로 8개의 세포 총 세포를 사용하여 혈구, 세포분석기, 재생, 현탁 및 페놀 레드 프리 DMEM의 5배 10의 목표 농도에서 밀리리터당 7개 세포 또는 플라스크당 약 200마이크로리터의 세포 수를 계산했습니다. 15% 감소된 성장 인자 마트리겔을 추가하고 이식 종양 이식까지 얼음에 세포 현탁액을 유지합니다.

Anes는 3%의 불소를 사용하여 4주 된 암컷 누드 마우스를 마취했습니다. 하나의 밀 주사기에 종양당 100마이크로리터의 세포를 로드하고 두 개의 양측 뒷측면 주사 부위 각각에 대해 27 및 50 게이지 바늘을 부착합니다. 집게로 피부를 부드럽게 들어 올려 텐트를 만들고 바닥에 세포를 주입합니다.

혈액을 생성하는 너무 깊숙이 침투하지 않도록 주의하십시오. 핀셋을 사용하여 주사기가 튀지 않도록 부드럽게 제거합니다. 종양 직경이 2-4mm에 도달할 때까지 10-20일 동안 매일 종양 성장을 모니터링합니다.

박테리아 준비, 3mils LB 배지에서 박테리아와 마이너스 80 냉동고 재고 또는 냉장 플레이트에서 항생제를 하룻밤 동안 배양을 시작합니다. 이 실험에서는 아침에 s tyer strain ELH 4 30을 사용했습니다. 배양액을 1에서 100으로 여과된 lb로 희석하고 0.4 내지 0.6의 OD 600으로 성장시킵니다.

인산염 완충 식염수로 스핀 다운 및 3회 세척하고 최종 OD 600 0.1 또는 약 1 곱하기 10에서 mil당 7개의 세포에 재현탁합니다. 박테리아를 주입하고, 동물을 마취하고, 꼬리가 주로 사용하는 손을 향하도록 자세를 취합니다. 꼬리 정맥을 찾아 따뜻한 물이나 열 램프를 사용하여 확장하십시오.

1mil 주사기에 마우스당 100마이크로리터의 박테리아를 넣고 칩을 90도 미만으로 구부립니다. 주사기 끝을 꼬리 정맥에 맞추고 저항하지 않고 얕은 깊이로 침투하여 박테리아를 주입합니다. 성공적인 주입을 위해 혈류 변위를 관찰하십시오.

집락화가 발생하기 위한 이미징이 발생하기 전에 약 12-18시간을 기다립니다. 마우스 이미징은 유도실에서 동물을 마취시킵니다. 그런 다음 각 마우스를 이미징 플랫폼에 놓습니다.

시점 간의 정량적 결과를 보장하기 위해 정확한 위치를 유지하고 Ibis Spectrum 이미징 시스템을 사용하여 동물을 이미지화합니다. 두 마리 이상의 동물을 촬영하는 경우 동물 사이에 라이트 배리어를 배치하여 교차 조명 동물 해부를 방지하고 핀셋으로 종양을 잡습니다. 역 가위 동작을 사용하여 피부를 제거합니다.

동작: 피부의 대부분이 분리되면 핀셋을 사용하여 종양을 완전히 제거합니다. 장기와 미리 계량된 마이크로 원심분리기 튜브를 놓습니다. 이러한 튜브의 질량은 크게 다를 수 있기 때문에 정량적 결과를 위해 미리 계량하는 것이 중요합니다.

각 시점에 대한 세균 바이오 분포를 정량화하고, 종양을 절제 및 칭량하고, 종양을 절제 및 칭량하고, 500마이크로리터 PBS와 15%글리세롤을 추가하고, 조직 찢어짐을 사용하여 균질화하고, 박테리아 콜로니 계수 대표 결과를 위한 연속 희석 및 플레이트를 생성합니다. 이 프로토콜을 사용하여 종양 표적 박테리아의 생체 내 성장 및 유전자 발현 역학에 대한 데이터를 생성할 수 있습니다. 전체 워크플로는 여기에 요약되어 있습니다.

첫 번째 단계에서는 박테리아를 주입하고 ivus를 사용하여 동물을 이미지화하여 리포터로서 발광으로 유전자 발현을 측정했습니다. 그런 다음 두 번째 단계에서는 종양에서 자라는 박테리아의 수를 결정하기 위해 집락 수를 위해 종양을 절제, 균질화 및 도금했습니다. 박테리아 균주에 의해 생성된 생물 발광은 감쇠로 인해 모든 경우에 최소 집락 투여량의 약 5배, 10에서 5까지 주입량으로 ivus 신호 증가를 사용하여 시각화됩니다.

박테리아는 특이적으로 종양이 집락화되었거나 마우스에서 크게 성장하지 못하고, 노출 시간을 정규화하기 위해 복사 단위를 사용하여 신호를 정량화하거나, 10 내지 6 이상의 일반적인 값은 주어진 감염에 대한 집락화를 나타내며, 신호는 24 내지 48시간 이상의 시간에 따라 증가합니다. 최대 시작은 주입 후 약 36시간이지만, 타이밍은 사용하는 균주 및 플라스미드에 따라 다를 수 있습니다. 다음 실험 세트에서 정량적 결과를 보장하기 위해 매번 마우스를 정확히 같은 방식으로 배치해야 합니다.

박테리아 생체 내 분포는 다양한 장기에서 시간 경과에 따른 박테리아의 성장을 측정하기 위해 정량화되며, 생존 가능한 박테리아 및 종양은 종양을 절제 및 균질화하고 연속 희석액을 도금하여 정량화됩니다. 다른 장기는 정량화할 수 있습니다. 마찬가지로, 여기서는 종양 비장 비율이 희석 계수를 사용하여 역계산한 후 박테리아 특이도의 일반적인 척도이기 때문에 비장을 사용했습니다.

이러한 계수를 통해 시간 경과에 따른 특정 박테리아 개체군을 측정할 수 있습니다. 왼쪽에서는 실험이 진행되는 동안 박테리아의 수가 꾸준히 증가하는 것을 볼 수 있습니다. 1시간에서 3시간 사이의 두 배 시간으로 배치 배양 실험보다 훨씬 짧습니다.

이는 종양 미세환경의 영양 상태가 좋지 않기 때문일 수 있습니다. 오른쪽에서는 종양 비장 비율을 정량화하고 실험 전반에 걸쳐 증가하는 것을 관찰했습니다. 이 실험의 목표는 IVUS 이미징 및 콜로니 카운팅 기술을 사용하여 박테리아 및 종양 환경의 성장 및 유전자 발현 역학을 정량적으로 모니터링하는 것입니다.

우리는 박테리아 개체군이 종양 환경에서 생체 내에서 특성화될 수 있음을 보여주었습니다. 미래에는 더 복잡한 유전자 발현 프로그램을 설계하고 엔지니어링하여 박테리아에 정교한 치료 전달 시스템을 구축할 수 있습니다.