Name: 종양 표적의 측정 성장과 유전자 발현 역학 S. 티피 뮤 리움 박테리아 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: 배우세요 종양 내 S. typhimurium 박테리아의 생장과 유전자 발현 역학을 생체 발광 이미징과 콜로니 카운팅으로 정량 분석하는 방법을. 이 기술은 암 치료용 박테리아 요법 개발에 활용됩니다.

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우리는 원고의 중요한 읽기 및 편집 H. 플레밍 감사합니다. 이 작품은 Misrock 박사 학위 취득 후 친교 (TD) 및 NDSEG 졸업 교제 (AP)에 의해 지원되었다. SNB는 HHMI 탐정이다.

1. 세포의 준비 <ol><li> 표준 세포 배양 기술을 사용하여 통과 세포주. 이 실험에서, 우리는 OVCAR-8 세포 (NCI DCTD 종양 저장소 프레 더릭, 메릴랜드)를 사용. - 100 % 80 자랄 대상으로 세포를 성장. </li><li> 5 분 5 ML 트립신으로 세포를 배양 한 후 + FBS는 트립신을 비활성화하는 5 ML RPMI 매체를 추가합니다. </li><li> 혈구에 수확 수를 셀. 5 × 10 7 세포 / ㎖, 또는 플라스크 당 200 μL의 목표 농도에서 페놀 레드없는 DMEM에 resuspend을. </li><li> 15 % 감소 성장 인자 마트 리젤 (BD Biosciences의)를 추가 주입까지 얼음에 세포 현탁액을 유지합니다. </li></ol> 2. 종양 이식 <ol><li> isoflurane을 3 %를 사용 사주 오래 된 여성 NCR / 뉴 쥐를 마취 깊은 마취를 보장하기 위해 약 5 분을 기다립니다. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 사용합니다. </li><li> 1 ML의 주사기에 세포 (종양 당 100 μL)을로드하고 27 연결 1/ 2 게이지 바늘. </li><li> 두 양측 후방 측면 주사 부위의 각각에 대해 텐트를하고 기지에 세포를 주입하는 집게로 부드럽게 피부를 들어 올립니다. 혈액을 생산, 너무 깊이 침투하지 않도록주의하십시오. 가볍게 튀어없이 주사기를 제거하는 핀셋을 사용합니다. </li><li> 2 종양의 직경까지 - 20 일 - 4mm에 도달 할 때 10 일간 종양의 성장을 모니터링 할 수 있습니다. </li></ol> 3. 박테리아 준비 <ol><li> -80 C 냉동고 주식 또는 냉장 판에서 3 ML LB 미디어 + 암피실린 박테리아의 하룻밤 문화를 시작합니다. 이 실험에서, 우리는 S를 사용 티피 뮤 리움 균주 ELH430 (SL1344 PhoPQ - 로랑 -). </li><li> 아침에 필터링 LB에 문화 1:100 희석 OD600 0.4로 증가 - 0.6. </li><li> 스핀 다운 및 인산염에 3 회 세척 식염수 (PBS)는 버퍼와 0.1의 최종 OD600 (1 X 10 7 세포 / ML 약)에 resuspend을. </li></ol> 4. 박테리아 주입 <ol><li> 동물을 마취꼬리가 지배적 인 손을 향해 가리키는 측면에서 D 위치. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 사용합니다. </li><li> 따뜻한 물이나 가열 램프를 사용하여 꼬리 정맥을 팽창. </li><li> 1 ML의 주사기에서 박테리아 (마우스 당 100 μL)을로드하고 90도 이상 그냥 작은 팁을 구부립니다. </li><li> 꼬리 정맥에 주사기 끝을 맞추고 얕은 깊이 (아무런 저항을 느끼지한다)에 침투하고, 박테리아를 주입. 성공적으로 주입 혈류 변위를 관찰합니다. </li></ol> 5. 마우스 이미지 <ol><li> 유도 챔버에있는 동물을 마취 후 이미징 플랫폼에서 각 마우스를 놓습니다. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 사용합니다. 시점 사이의 정량적 인 결과를 보장하기 위해 정확한 위치를 유지합니다. </li><li> IVIS 스펙트럼 이미징 시스템 (캘리퍼스 생명 과학)를 사용하여 이미지 동물. 그들 사이 영상 1 개 이상의 동물, 장소 라이트 배리어 간 ILLU을 방지하는 경우mination. 동물은 박테리아의 현지화를 확인하기 위해 복부 측면에 먼저 몇 군데해야합니다. </li><li> 이미지 동물 dorsally 실험 (36 시간) 동안 IVIS마다 2 시간 사용. 특정 ROI에 대한 시간 경과를 생성합니다. </li></ol> 6. 세균 생체 분포를 정량화 <ol><li> 흡수성 기저귀의 뒷면에 CO 2와 장소를 사용하여 동물을 안락사. </li><li> 두 개의 뒷다리 측면 피하 종양을 노출하는 동물을 켭니다. 종양을 분리하고 제거하는 주변의 피부 조직을 잘라. 핀셋으로 종양을 잡고, 역 가위의 움직임을 사용하여 피부를 제거합니다. 피부의 대부분이 분리되었을 때, 완전히 핀셋을 사용하여 종양을 제거합니다. </li><li> 미리 무게의 microcentrifuge 튜브에 기관을 배치합니다. 이 튜브의 질량이 크게 달라질 수 있기 때문에 정량적 인 결과를 미리 무게를하는 것이 중요합니다. </li></ol> 7. 세균 생체 분포를 정량화 <ol><li> 각 시점, 소비세에 대한 그리고 종양의 무게. </li><li> 500 μL PBS + 15 % 글리세롤을 추가하고 조직 Tearor (BioSpec)를 사용하여 균질화. 샘플 간의 에탄올로 균질화 3 번 씻어. </li><li> 직렬 희석 및 세균성 식민지 계산을위한 격판 덮개를 생성합니다. 하나의 플레이트 사용 전 단면 플레이트에 플레이트 여러 희석한다. </li></ol>

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 절차를 사용하여, 우리는 종양을 식민지화 박테리아의 성장과 유전자 발현 역학 시간 코스를 생성 할 수 있습니다. 이러한 측정은 정기적으로 일괄 문화 나 마이크로 유체 장치에서 체외에서 수행하는 동안, 그들은 생체 내에서 수행하기가 훨씬 더 어렵습니다. 이러한 메서드에 적용 할 수있는 몇 가지 수정이 있습니다. 우리는 우리의 마우스 모델을 생성하는 OVCAR-8 세포주를 사용하면서, 다른 세포 라인의 수는 동등하게 사용할 수 있습니다. 예를 들어, luciferized 세포 라인은 종양 및 세균 루시퍼 채널 3D colocalization을 위해 허용하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 양자 뒷다리 측면 모델, 다른 번호와 주사 부위의 위치를​​ 사용하는 동안 또한, 서로 다른 현상을 연구하는 모델을 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 종양의 크기가 중요한 변수이며, 세포의 시리얼 희석을 준비 할 수 있으며, 스말를 생성, 동시에 ...

합성 생물학은 지난 십 년간 급속하게 진행되고 지금은 에너지와 건강에 중요한 문제에 영향을 배치됩니다. 그러나, 임상 분야 ​​진출은 안전 문제 및 생체 내 유전자 회로의 설계 기준을 개발 부재로 둔화되었다. 높은 충격 의료 애플리케이션을 가속화하여 의료 인프라, 제어 실험실 설정 이외의 기능 유전자 회로, 안전하고 임상 승인 미생물 호스트와 직접 인터페이스 방법을 활용해야합니다. 균주의 수는 종양에서 우선적으로 성장 할 수있는 능력으로 인해 암 치료에 조사되었다. 이들은 C.을 포함 novyi, E. 대장균, V. cholorae, B. longum의, 그리고 S. 티피 뮤 리움 3-8. S. 그들은 9-12 인간의 임상 실험의 숫자에 안전성과 내성을 전시 것처럼 티피 뮤 리움 특히 관심을 생성했습니다. 이 bacteri<html> 처음에 숙주 면역 체계의 자극을 통해 암 세포의 신진 대사에 필요한 영양소의 결핍에 의한 항 종양 효과를 만들 보였다. 치료화물의 생산은 이후 유전자 변형을 통해 추가되었습니다. 이 연구는 종양 치료를위한 박테리아의 사용에 중요한 진보를 대표하는 동안, 기존의 노력의 대부분은 일반적으로 높은 복용량, 오프 대상 효과 및 호스트 저항 13-16 개발의 배달 결과 높은 수준의 표현에 의존 . 이제, 합성 생물학 고급 감지 및 배달 17-20을 수행 할 수 계산 설계 유전자 회로를 이용하여 프로그래밍화물의 생산을 추가 할 수 있습니다. 이 회로는 종양 특정 자극하고 필요한 자기 조절화물의 생산을 감지 배달 시스템으로 작동하도록 설계 할 수 있습니다. 그러나 생체 내에서 이러한 회로의 기능을 공부하는 것은 지금까지 도전하고있다. 플라스미드 합성 회로를위한 공통 프레임 워크입니다 ve_content &quot;&gt; 때문에, 우리는 마우스 모델을 사용하여 생체 내에서 플라스미드 기반의 유전자 발현의 역학을 특성화하는 방법을 설명합니다.이 방법은 시간 경과 발광 이미징 및 생체 분포의 정량적 측정을 사용합니다. 함께, 이러한 접근은 임상 응용을위한 생체 내에서 플라스미드 기반의 네트워크를 공부하기위한 프레임 워크를 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>1ml 주사기</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>3/10cc 인슐린 주사기</td><td>BD Biosciences</td><td>309301</td><td></td></tr><tr><td>PrecisionGlide Needle </td><td>BD Biosciences</td><td>301629</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640 (1X), 액체, L-글루타민</td><td>Invitrogen</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>암피실린</td><td>포함 Sigma Aldrich</td><td>A0166-5G</td><td></td></tr><tr><td>LB 한천 육수</td><td>시그마 Aldrich</td><td>L2897</td><td></td></tr><tr><td>Luria-Bertani 육수</td><td>BD Biosciences</td><td>244610</td><td></td></tr></tbody></table>

종양 표적의 측정 성장과 유전자 발현 역학<em&gt; s. 티피 뮤 리움</em&gt; 박테리아

Measuring Growth and Gene Expression Dynamics of Tumor-Targeted S. Typhimurium Bacteria

이 실험의 목적은 감쇠 S.의 성장과 유전자 발현 역학 양적 시간 코스 데이터를 생성하는 것입니다 종양 내부 성장 티피 뮤 리움 박테리아 식민지. 우리는 인간의 난소 암 세포주의 피하 주사, OVCAR-8 (NCI DCTD 종양 저장소 프레 더릭, 메릴랜드).에 의해 생쥐 모델 이종 이식 종양을 생성 우리는 S.의 감쇠 균주를 형질 전환 시각화 2 플라스미드 구조적 표현 루시 페라 제 (luxCDABE)와 함께 : 티피 뮤 리움 균 (SL1344 phoPQ-1 ELH430). 마우스 1 본질적으로 비 독성을 유지하면서 이러한 긴장은 특히 종양을 식민지. 측정 종양이 설립되었다되면, 박테리아는 용량을 변화와 꼬리 정맥을 통해 정맥 주사 하였다. 종양의 지역화, 박테리아 유전자 발현을 사용하여 60시간의 과정을 통해 실시간으로 측정 하였다생체 내 이미징 시스템 (IVIS)합니다. 각 시점에서, 종양은 균질화, 절제, 유전자 발현 데이터와 상관 관계 세균성 식민지를 정량을 도금했다. 함께,이 데이터는 종양 안에 성장 박테리아의 생체 성장과 유전자 발현 역학의 정량적 측정을 얻을 수 있습니다.

이 프로토콜을 사용하여, 우리는 종양 표적 박테리아의 생체 성장과 유전자 발현 역학에 데이터를 생성 할 수 있습니다. 전체적인 흐름은 그림 1에 요약되어 있습니다. 첫 번째 단계에서, 우리는 발광 (블루) 기자 등으로 유전자 발현을 측정하는 IVIS를 사용하여 동물을 박테리아를 주입 (녹색) 및 이미지. 그런 다음, 두 번째 단계에서, 우리 소비세는, 균질화, 그리고 식민지 카운트에 대한 플레이트 종양은 종양의 성장 박테리아의 수를 결정합니다. 균주에 의해 생성 된 생물 발광은 시각화하여 IVIS (그림 2)입니다. 5 × 10 5 정도의 최소 정착 용량 (그림 2A)를 주입 용량과 신호 증가. 모든 경우에, 감쇠 박테리아는 어느 특...

이 실험의 목적은 감쇠의 성장과 유전자 발현 역학 양적 시간 코스 데이터를 생성하는 것입니다<em&gt; S. 티피 뮤 리움</em종양 내부 성장&gt; 세균성 식민지. 이 비디오는 종양 세포의 준비와 주입, 박테리아 준비 및 사출, 전체 - 동물 발광 이미징, 종양 절제 및 세균성 식민지 계산을 다룹니다.

종양 표적의 측정 성장과 유전자 발현 역학<em&gt; S. 티피 뮤 리움</em&gt; 박테리아

The goal of these experiments is to generate quantitative time-course data on the growth and gene expression dynamics of attenuated S. typhimurium ...

본 실험의 전체적인 목표는 종양 내부에서 성장하는 S tyrian 박테리아의 인 비보(in vivo) 유전자 발현 역학을 연구하는 것입니다. 우선 마우스 이종 이식 암 모델에서, 박테리아를 꼬리 정맥을 통해 정맥 주사합니다. 박테리아는 종양에 군락을 형성하여 기하급수적으로 성장하며, 이때 발광 리포터를 사용하여 유전자 발현을 시각화합니다.전신 동물 생물발광 이미징은 IVUS 스펙트럼 이미징 시스템을 사용하여 수행합니다. 24시간에서 48시간에 걸쳐 IVUS 이미지의 시계열 데이터를 수집합니다. 이 이미지 시리즈를 종양을 균질화하고 도말하여 생성한 콜로니 수와 상관 분석합니다.이러한 데이터들을 통해 종양 표적 박테리아의 유전자 발현과 개체군 역학을 생체 내(in vivo)에서 실시간으로 정량적으로 측정할 수 있습니다. 본 실험에서는 ocar eight 세포를 사용하였으며, 세포 배양의 표준 기술을 이용하여 80~100%의 표적 합류도(confluency)까지 배양하였습니다. 헤모사이토미터(hemocytometer)로 세포를 수확하여 수를 센 다음, phenol red free DMEM에 5 × 10⁷ cells/mL의 표적 농도(플라스크당 약 200 µL)로 재현탁하였습니다. 여기에 15% reduced growth factor matrigel을 첨가하고, 종양 이식 전까지 세포 현탁액을 얼음에 보관하였습니다.3% isof fluorine를 사용하여 4주 된 암컷 nude mice를 마취시켰습니다. 1mL 주사기에 종양당 100 µL의 세포를 분주하고, 양측 후측면 주사 부위에 사용할 27.5 gauge 바늘을 부착했습니다. 핀셋으로 피부를 부드럽게 들어 올려 텐트 모양을 만든 후, 그 기저부에 세포를 주입했습니다.출혈이 발생하지 않도록 너무 깊게 찌르지 않도록 주의하십시오. 핀셋을 사용하여 주사기를 조심스럽게 제거하여 액체가 튀지 않게 합니다. 종양의 직경이 2~4 mm에 도달할 때까지 10~20일 동안 매일 종양의 성장을 관찰하십시오.박테리아 준비를 위해, -80°C 냉동 보관주 또는 냉장 플레이트로부터 3mL의 LB 배지와 항생제가 포함된 배지에서 박테리아를 하룻밤 동안 배양합니다. 본 실험에서는 오전 중에 s tyer strain ELH four 30 균주를 사용하였습니다. 배양액을 여과된 LB 배지에 1:100 비율로 희석하여 OD 600 값이 0.4에서 0.6이 될 때까지 배양합니다.원심 분리하여 가라

measuring-growth-gene-expression-dynamics-tumor-targeted-s

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

출처: Liu, P. C., et al. 항생제 선택 하에서 박테리아의 적응 진화를 위한 저비용의 자동화된 Morbidostat의 설계 및 사용. J. Vis. 경험. (2016년)이 비디오는 미세유체 칩을 사용하여 트리메토프림 항생제 스트레스 하에서 야생형 및 트리메토프림 내성 대장균 균주의 성장과 형태를 시각화하고 비교하는 방법을 보여줍니다.

항생제 약물 내성을 연구하기 위한 미세유체 칩의 박테리아 성장

우리는 endomembrane 파열을 추적하는 방법을 설명하면 세포 내 박테리아에 의해...

액포 파열의 단일 세포 측정은 세포 내 병원균에 의해 발생

이 비디오 기사는 성공적으로 전체 동물의 척추 생물을 사용하여 복합 검사 및 약물 발견을위한 새로운 강력한 도구를 제공하는 제브라 피쉬 배아 많은 수의 감염 및 분석하기 위해 설립 된 높은 처리 파이프 라인에 대해 설명합니다.

설립과 연구에 높은 처리량 설정 최적화<em&gt; 표피 포도 구균</em&gt;와<em&gt; Mycobacterium의 박테</em&gt; 감염 신약 개발의 모델로

여기에서는 추정되는 파지 유전자의 기능적 특성화를 위한 표현형 접근법을 제시합니다. 기술에는 숙주 동화 대사를 모니터링할 수 있는 개발된 분석법, 다중 표현형 분석 플레이트(MAP), 이화 대사에 대한 효과를 측정할 수 있는 확립된 대사체학 방법 등이 포함됩니다.

파지 Phenomics : 생리 학적 접근 방법은 소설 바이러스 성 단백질의 특성을

진화 시나리오되지만 (공간적 분리)의 역할은 공간 분포의 조정을 허용하는 제어 실험실에서 미생물 단순한 시스템을 사용하여 조사 할 수있다. 설립자 셀 밀도를 수정하여, 다양한 구색 수준은 바실러스 서브 틸리 스 (Bacillus subtilis)의 식민지 바이오 필름에 형광 표지 된 박테리아 균주를 사용하여 시각화 할 수 있습니다.

표면 식민지 미생물 집단에 공간 분리를 모니터링

세균성 성장의 양적 평가 시스템 수준 현상으로 미생물 생리학을 이해 하는 데 필수적입니다. 실험적인 조작 및 분석 접근 프로토콜, 세균성 성장, 시스템 생물학의 핵심 주제는의 정확한, 높은 처리량 분석에 대 한 허용 소개.

세균성 성장의 정확한, 높은 처리량 분석

여기에 설명 된 세포 수준에서 동물의 조직에서 세균 유전자 발현을 분석 하기 위한 방법이입니다. 이 메서드는 감염 동안 조직 환경에 대 한 응답에서 세균성 인구 내에서 발생 하는 phenotypic 다양성을 공부에 대 한 리소스를 제공 합니다.

감염 된 조직에서 세균 유전자 규칙을 공부 하는 형광 기반 방법

마이크로티터 접시에 방사성 표지된 세균 배양물의 성장은 (p)ppGpp를 포함하여 뉴클레오티드 풀 풍부의 다중 기술적 및 생물학적 복제 측정을 허용하는 높은 처리량 샘플링을 용이하게 합니다. 생리 적 스트레스의 소스에 의해 자극 성장 전환의 효과 뿐만 아니라 스트레스에서 복구 모니터링할 수 있습니다.

대장균 (p)ppGpp의 여러 생체 내 측정을위한 마이크로 티터 접시 방사성 라벨링 사용 및 얇은 층 크로마토그래피

효모 성장 표현형은 마이크로콜로 성장하는 고정 된 세포의 매우 병렬 시간 경과 이미징을 통해 정확하게 측정됩니다. 동시에, 스트레스 내성, 단백질 발현 및 단백질 국소화를 모니터링할 수 있고, 통합된 데이터 세트를 생성하여 환경 및 유전적 차이뿐만 아니라 동종 세포 간의 유전자 발현 이질성, 변조 성장을 연구할 수 있습니다.

성장과 유전자 발현의 이질성을 측정하는 마이크로콜로니의 높은 처리량 라이브 이미징

항생제 지속성은 민감한 동종 집단 내의 작은 하위 집단이 고용량의 살균 항생제를 일시적으로 견딜 수 있는 능력을 설명합니다. 현재 프로토콜은 대장균 을 치사량의 오플록사신에 노출시킨 후 분자 및 세포 수준에서 항생제 지속성 표현형을 특성화하기 위한 접근 방식을 결합합니다.

대장균의 항생제 지속성에 대한 개체군 및 단일 세포 분석

박테리아를 감염시키는 바이러스인 박테리오파지(파지)는 장내 마이크로바이옴의 필수 구성 요소입니다. 이러한 공생 생물이 박테리아 적합성과 개체군 역학을 주도하지만 장내 항상성과 질병에 미치는 영향에 대해서는 거의 알려져 있지 않습니다. 이 프로토콜은 마우스 모델 내에서 분리된 T4 파지를 연구하며, 다른 파지-박테리아 쌍에 적응할 수 있습니다.

쥐 장에서 T4 박테리오파지와 대장균 상호작용: 생체 내 숙주-박테리오파지 역학 연구를 위한 프로토타입 모델

배우세요 종양 내 S. typhimurium 박테리아의 생장과 유전자 발현 역학을 생체 발광 이미징과 콜로니 카운팅으로 정량 분석하는 방법을. 이 기술은 암 치료용 박테리아 요법 개발에 활용됩니다.

종양 표적의 측정 성장과 유전자 발현 역학

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